Summary
Здесь мы представляем эффективный метод для исследования антифибротической активности внутривенно вливания человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины после индукции травмы легких эндотрахеальной инъекции блеомицина в C57BL /6 мышей. Этот протокол можно легко распространить на доклинические испытания других терапевтических препаратов.
Abstract
Легочный фиброз является отличительной чертой нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией. Поскольку нынешняя терапия довольно ограничена, мышиные модели по-прежнему являются важным инструментом для разработки новых антифиброзных стратегий. Здесь мы предоставляем эффективный метод для исследования in vivo антифиброзной активности человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины (hUC-MSC) в ослаблении bleomycin-индуцированной травмы легких. C57BL/6 мышей получают одну эндотрахеульную инъекцию блеомицина (1,5 U/kg массы тела), а затем двойной вливание hUC-MSC (2,5 х 105) в хвостовой вены, 24 ч и 7 дней после введения блеомицина. При жертвоприношении в дни 8, 14 или 21, воспалительные и фиброзные изменения, содержание коллагена, и присутствие hUC-MSC в эксположив легочной ткани анализируются. Инъекции блеомицина в трахею мыши позволяет прямого ориентации легких, что приводит к обширному воспалению легких и фиброза. Системное введение двойной дозы hUC-MSC приводит к раннему притупию травмы легких, вызванной блеомицином. Внутривенно вливания hUC-MSC временно привиты в легкие мыши, где они оказывают свою противовоспалительные и противофиброзные активности. В заключение, этот протокол был успешно применен для доклинических испытаний HUC-MSC в экспериментальной мышиной модели фиброза легких человека. Тем не менее, этот метод может быть легко расширен как для изучения влияния различных эндотрачелогически вводимых веществ на патофизиологию легких и для проверки новых противовоспалительных и противофиброзных системных методов лечения.
Introduction
Легочный фиброз является прогрессивным патологическим процессом, характеризующимся чрезмерным осаждением внеклеточных матричных компонентов, в основном коллагена I типа, в интерститии легких, что приводит к нарушению функции легких. Это отличительная черта нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией и представляет собой плохой клинический прогностик фактор. Поскольку текущие методы лечения довольно ограничены1, мыши модели продолжают быть важным инструментом как для дальнейшего исследования патогенных механизмов, влияющих на начало и прогрессирование болезни и для разработки новых антифибротических стратегии2,3.
На сегодняшний день, введение блеомицина была наиболее часто применяемой моделью экспериментально индуцированного фиброза легких4. Помимо нескольких методов доставки (в том числе внутривенных, внутриперитоненных, подкожных и ингаляционных), внутричехальные или эндотрахеальные инъекции блеомицина стали наиболее часто используемыми маршрутами4,5. Метод, который мы описываем в данном ниле был разработан, чтобы избежать обжигающий эффект блеомицина на слизистую оболочку трахеи. В самом деле, путем экстерьеризации трахеи и визуализации его через операционный микроскоп, можно достичь закапывания всего объема раствора блеомицина непосредственно в нижние дыхательные пути без каких-либо разливов в верхней дыхательной части. При наличии необходимых хирургических знаний и приборов, этот метод позволяет обеспечить безопасную, надежную и воспроизводимую индукцию воспаления легких и фиброза, как сообщалось ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были одобрены Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 456/2016-PR) и выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией.
1. Мыши
- После покупки их, позволяют мышам акклиматизироваться, по крайней мере за 7 дней до инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были размещены на животном объекте в условиях, свободных от патогенов, поддерживались при постоянной температуре и влажности на 12 ч свет / темный цикл, и получили свободный доступ к воде и стандартные продукты питания гранул. - Используйте самок C57BL/6 мышей и вводить их в возрасте от 12 до 16 недель.
2. Эндотрахеульная инъекция блеомицина
- Препарат Блеомицин
ВНИМАНИЕ: На основе глобально согласованной системы классификации и маркировки химических веществ (GHS), блеомицин классифицируется как ОПАСНОСТЬ для здоровья GHS08.- Подготовка блеомицина под химическим капотом.
- Для получения желаемой рабочей концентрации (0,05 U/100 Л) повторно приостановите 15 U лиофилизированного блеомицина сульфата в 30 мл стерильного солья.
- Тщательно смешайте образец, инвертируя трубку, чтобы избежать образования тромба.
- Правильно пометьте трубку датой повторного подвески, храните ее при 4 градусах Цельсия и используйте ее содержимое в пределах 24 ч.
- Перед закапыванием уравновешивать раствор блеомицина до комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, одна доза 1,5 U/kg вес тела блеомицина был использован для индуцирования травмы легких у c57BL/6 мышей. Тем не менее, каждый штамм мыши имеетразличную чувствительность к блеомицин 6,7. Титрация блеомицина должна быть выполнена для определения оптимальной дозы в штамме мыши, используемом для экспериментов.
- Анестезии
- Подготовка анестезии путем растворения 0,2 г 2,2,2-трибромоэтанола в 9 мл стерильного солья и 1 мл абсолютного этанола (при рабочей концентрации 20 мг/мл).
- Тщательно перемешайте, инвертируя трубку, чтобы избежать образования тромба.
- Правильно пометьте трубку датой приготовления, храните ее при 4 градусах по Цельсию в темноте и используйте в течение 3 дней.
- Анестезия мышей с интраперитонеальной инъекции 250 л раствора трибромоэтанола (при окончательной дозе 200 мг/кг массы тела) на мышь, используя 1 мл шприца и 26 G иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этой дозой, мыши находятся в бессознательном состоянии, по крайней мере 20 мин. При необходимости отрегулируйте дозировку в соответствии с ответом мыши, в консультации с ветеринаром. - Следите за дыханием мыши. Скорость дыхания немного замедлится. Через несколько минут, щепотку одной из ковриков мыши, чтобы проверить отсутствие педали рефлекс.
- Эндотрахеял инъекция
- Поддержание асептических состояний во время всей процедуры. Используйте стерильные хирургические инструменты и материалы, носите стерильные перчатки и избегайте контакта с любой нестерильной поверхностью.
- Лягте на анестезирующую мышь на спину на хирургической платформе и удерживайте ее на месте, деликатно фиксируя ноги хирургическими полосками ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нежное лента ножки мыши рекомендуется, чтобы избежать мыши скольжения от хирургической платформы во время ее вращения (шаг 2.3.10). - Поместите мышь на нагретый коврик, чтобы сохранить температуру прямой кишки стабильной на уровне 37 градусов по Цельсию на протяжении всего вмешательства. Измерьте температуру прямой кишки ректальным зондом.
- Аккуратно hyperextend мыши шеи, поместив "подушка", например, зубной хлопок рулон, под его шейной области.
- Аккуратно побрить горло лезвием бритвы.
- Удалить волосы из хирургической области с алкоголем и дезинфицировать кожу мыши несколько раз с 1% повид-йодраствор.
- Ущипните кожу парой анатомических щипцов и сделайте короткий разрез в соответствии стерногидной мышцы мыши, используя пару кольцевых, изогнутых тупых ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез кожи составляет около 0,5 см в длину. Соответствующий кусок кожи, который удаляется настолько мала, что она не создаст никакого напряжения в шее мыши. - Остановите кровотечение ватными палочками.
- Изгоняйте трахею тупым вскрытием, аккуратно очищая ее от жира и других тканей.
- Поверните хирургическую платформу, чтобы сориентировать мышь головой к оператору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это положение позволяет оператору, во время инъекции, угол шприц так, что он следует естественный путь трахеи прямо в легкие. - Поместите мышь под операционный микроскоп, чтобы помочь с визуализацией трахеи. Отрегулируйте освещение и установите увеличение (между 1 и 1,2), фокус и резкость. Трахею можно легко отличить как белую полупрозрачую трубку, и кольца трахеи хорошо видны.
- Смешайте раствор блеомицина, аккуратно пипетка, и аспирировать 100 л в шприц 0,5 мл с иглой 25 G, избегая образования пузырьков.
- После того, как трахея в четко визуализированы, тщательно прокол его иглой наконечник омрачает под углом 30 "(Рисунок1A).
- Медленно прививайте 100 л плеомицина или стерильного солика (управление транспортным средством) непосредственно в просвет трахеи. Подождите несколько секунд, пока весь объем путешествует вниз по игле, а затем удалить его из трахеи.
- Обратите внимание на несколько секунд апноэ, которое возникает, когда игла правильно вставляется в трахею так, что мышь сразу же вдыхает весь объем жидкости.
- Если мышь не вдыхает жидкость, внимательно следите за ее дыханием и регулируйте положение иглы. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите иглу и позвольте мыши возобновить нормальное дыхание перед ее повторной вставкой.
- Безопасно отбросьте шприц и иглу после инъекции.
- Закройте подкожную фасцию и рану кожи с 5-0 поглощаемым швом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда не полностью абсорбции, удалить швы 7-10 дней после операции.
- Восстановление животных
- Поместите вводимые мыши на бок на грелку для восстановления.
- Монитор мыши дыхание и наблюдать за мышью, пока он не начинает двигаться и восстанавливает суровый recumbency и полное сознание.
- Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, верните ее в исходную клетку. Не возвращайте его в компанию других животных, пока он полностью не выздоровеет.
- Для обеспечения длительной обезболивающей и избежания остаточной послеинтервенционной боли, вводят подкожно бупренорфин (при окончательной дозе 0,05 мг/кг массы тела) к мышам каждые 12 ч после эндотрахеальной инъекции.
- Изучите мышей в течение 24 ч после эндотрахеяловой инъекции блеомицина и делать это два раза в день. Мониторинг мышей для дыхательных дистресс, потеря веса, поведение аномалии, и для любых признаков заболеваемости.
3. Вливание хвостовой вены из мезенхимальных стромальных клеток пуповины человека
- Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция, характеристика и культивирование мезенхимальных стромальных клеток из пуповины человека ранее были описаны8,9,10. hUC-MSC следует асептически манипулировать и настоять; поэтому выполните все ступени под стерильным капюшоном.- Расширьте hUC-MSC в 75 см2 культурных колб до ранних проходов (максимум 1-3).
ПРИМЕЧАНИЕ: HUC-MSC должен быть 70% слияние в день их вливания в мышей. - Вымойте клетки 10 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) при комнатной температуре.
- Добавьте 2 мл трипсина и инкубировать клетки при 37 градусах По Цельсию в течение примерно 1 мин, пока они не начнут отделяться.
- Нейтрализовать трипсин, добавив 8 мл hUC-MSC полной среды, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
- Соберите клетки центрифугированием при 350 х г в течение 10 мин.
- Отрепричить гранулы в стерильном сольном и посчитать клетки с помощью камеры Бюркера. Подготовьте суспензию клетки для инфузии, разбавляя клетки до конечной концентрации 2,5 х 105 в 200 л стерильного солей на мышь. Подготовьте избыточную суспензию клетки, чтобы обеспечить достаточный объем для вливание всех мышей.
- Держите клетки на льду до настоя. Настоять в течение нескольких часов, как описано в разделе 3.3.
- Расширьте hUC-MSC в 75 см2 культурных колб до ранних проходов (максимум 1-3).
- Анестезии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы свести к минимуму риск повреждения вены хвостмыши мыши во время инъекции мышь не должна двигаться. Поэтому анестезия была предпочтительнее, чем простой мышь сдерживания.- Анестезия мышей на 4% изолюранинга в индукционной камере.
- Следите за дыханием мыши. Скорость дыхания немного замедлится. Через несколько минут, щепотку одной из ковриков мыши, чтобы проверить на надлежащее обезвращество.
- Настой хвостовой вены
- После того, как бессознательное было подтверждено, поместите мышь под стерильный капюшон для асептического hUC-MSC внутривенного вливания.
- Поддержание общей анестезии на протяжении всего эксперимента с помощью маски для лица с непрерывным потоком 1,5% изофларан.
- Для содействия вазодилатации и обеспечить более легкий инъекции, замочите хвост мыши в теплой воде в течение 2 мин.
- Смешайте клеточной подвески, аккуратно pipetting, чтобы убедиться, что клетки не образуют сгустки. Аспир 200 л в шприц 1 мл с иглой 26 G, избегая образования пузырьков.
- Держите хвост мыши за кончик и аккуратно выпрямите его.
- Найдите боковую вену хвоста мыши; аккуратно соскребите его скальпелем и протрите 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно соскоб хвоста выполняется для удаления волос, что делает место инъекции более гладкой и чистой. - Начиная с дистальной части хвоста, вставьте иглу в вену под углом 15 "и медленно влить 200 л hUC-MSC или стерильный солен (управление транспортным средством) (Рисунок 1B).
- Мониторинг успешного внутривенного вливания жидкостью, попадающей в вену без сопротивления и отсутствием экстравазации. Подождите несколько секунд, пока весь объем путешествует вниз по игле, а затем удалить его из вены.
- Чтобы предотвратить кровотечение, кратко надавите на входную рану стерильной марлей.
- Безопасно отбросить шприц и иглу после настоя.
- Восстановление животных
- Поместите настоятельную мышь на бок на грелку для восстановления.
- Монитор мыши дыхание и наблюдать за мышью, пока он не начинает двигаться и восстанавливает суровый recumbency и полное сознание.
- Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, верните ее в исходную клетку. Не возвращайте его в компанию других животных, пока он полностью не выздоровеет.
- Изучить мышей в течение 24 ч после вливания хвостовой вена и через день, чтобы контролировать их состояние здоровья и обнаружить любые страдания или патологические знаки рано.
4. Эксплантирование органов и обработка тканей
- Пожертвуйте мышами в дни 8, 14 или 21 после введения блеомицина(Рисунок 1С) передозировкой инъекционных анестезии.
- Акциз трахеи и легких и сразу же мыть их в ледяной PBS.
- Прикрепите-заморозить правые легкие в жидком азоте и хранить их при -80 градусов по Цельсию для последующего молекулярного анализа10.
- Надуть левые легкие с 4% параформальдегида и исправить их в 10% нейтрально-буферизированных формалина раствор для 24 ч; Затем, обезвоживать их в градуированных серии алкоголя, очистить их в ксилен, и вставлять их в парафин10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Травма легких была вызвана одной эндотрахельной инъекцией 1,5 U/kg массы тела bleomycin сульфата в 100 Л стерильного соления. Контрольные животные получили эндотрахеюлку инъекций равного объема соления. Два выстрела hUC-MSC (2,5 х 105 в 200 л стерильного солей) были влиты в вену хвоста мыши, 24 ч и 7 дней после введения блеомицина. Контрольные животные получали внутривенный вливание равного объема стерильного солей. Мыши были принесены в жертву для легких explant и обработки тканей в дни 8, 14, и 21 после введения блеомицина(рисунок 1).
Мы продемонстрировали, что прямое закапывание блеомицина в трахею мыши позволило быстрое распространение в легкие, что привело к обширному воспалению, прогрессирующему фиброзу и искажению их нормальной архитектуры, в соответствии с предыдущими исследованиями 11. Легкие гистопатологические изменения были оценены гематоксилин-эозин (H и E) и picrosirius красное окрашивание10, и фиброз был подтвержден увеличением содержания гидроксипролина и осаждения коллагена (Рисунок 2). Воспалительные изменения в тканях оценивались гистологической системой скоринга, основанной на воспалительной инфильтрации вокруг бронхиолов, бронхов и кровеносных сосудов, а также интерстициальной пневмонии, наблюдаемой в окрашенных секциях легких гематоксилин-эозин10. После инъекции bleomycin, счет Эшкрофт атизней легких разделы постепенно увеличивается со среднего значения 1,5 на 8-й день до среднего значения 4,5 в день 14 и 6,5 в день 2110. Двойной вливание hUC-MSC в вену хвоста мыши больш смягченной bleomycin-индуцированной ушибом легкя, с значительно уменьшением, хотя не вполне аннулированием, и воспалительного инфильтрации и размера фиброза на каждом пункте времени ( Рисунок 2). Иммунопятно с конкретными антителами10 показали, что настоянные hUC-MSC быстро и эффективно достигли легких мыши, хотя только несколько клеток были обнаружены, с уменьшением числа с 8-го дня до дня 21 (Рисунок 3). Как сообщалось ранее12, эти данные свидетельствуют о быстром вывихе клеток от места травмы, несмотря на их длительный защитный эффект. Иммуногистохимия (IHC) окрашивание hUC-MSC была выполнена, также в солей обработанных образцов, но ни одна клетка не может быть обнаружена, учитывая отсутствие воспалительных очагов, привлекающих HUC-MSC.
Рисунок 1: Схема экспериментального протокола. (A) Мыши получили одну эндотрахеэль (напротив) инъекции 1,5 U/kg вес тела блеомицина, чтобы вызвать травму легких (день 0). (B) Двойной внутривенный (т.е.) вливание 2,5 х 10человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины (hUC-MSC) было выполнено 24 ч (день 1) и 7 дней (день 7) после введения блеомицина. (C) Хронология инъекций и моменты жертвоприношения показаны здесь. Группы мышей приносили в жертву в дни 8, 14 и 21 после введения блеомицина (т.е. 24 ч, 7 дней и 14 дней после второго инфузии hUC-MSC, соответственно). Эта цифра была изменена от Moroncini и др. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: hUC-MSC downregulate bleomycin-индуцированного воспаления легких и фиброз. (A и B) Представитель микроскопических изображений (10x увеличение) гематоксилин-эозин (H и E) и picrosirius красное пятно легких разделов, полученных из C57BL/6 мышей, 21 дней после эндотрахеальной инъекции стерильного соления (солин) или блеомицин (блеомицин), за последним также последовалвнутри внутривенное вливание ГУК-МСК (блеомицин-хУК-МСК) или стерильного соля (блеомицин-салин). Солин-контроль продемонстрировал нормальную архитектуру легких. Широко распространенные воспалительные инфильтры наблюдались через 21 день после получения кровотечения, с серьезным искажением архитектуры легких и образованием фиброзных очагов. Bleomycin-индуцированных изменений были значительно ослаблены hUC-MSC лечения, но не солением. (C) Содержание гидроксипролина в дни 8, 14 и 21 в легких C57BL/6 мышей, которые получили вышеупомянутые лечения. Результаты являются средним и SD (n - 8 на группу), выраженным в процентах от значения, полученного от эндотрахееясовых солен-обработанных мышей и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. -П Злт; 0,05, П.л.; 0,01, по сравнению с обработанными блеомицином мышами. (D) Мышь Col1A1 уровни экспрессии в целом мРНК легких, полученных в дни 8, 14, и 21 от C57BL / 6 мышей, которые получили вышеупомянутые лечения. Результаты являются средними SD(n - 5 на группу) и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, выполненных в тройном. -П Злт; 0,05, П.л.; 0,01, по сравнению с обработанными блеомицином мышами. Эта цифра была изменена с Морончини и др. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обнаружение HUC-MSC в легочной ткани. (A и B) Представитель микроскопических изображений (200x и 400x увеличение, соответственно) иммуносохранения с анти-HLA-1 антитела легких разделов, полученных от C57BL/6 мышей, получающих эндотрахеальный бломацин с последующим внутривенным hUC-MSC. Красные стрелки указывают на положительно окрашенные hUC-MSC. (C) Человек GAPDH оценивается количественной реакции полимеразы в реальном времени (PCR) анализ в целом мРНК, извлеченные из культивированного hUC-MSC до инфузии (настоя hUC-MSC) или из легочной ткани в дни 8, 14, и 21 из C57BL/6 мышей, получающих эндотрахеик блеомицин с последующим внутривенным hUC-MSC (блеомицин-хУК-MSC). Результаты являются средними SD(n - 5 на группу) и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, выполненных в тройном. Следует отметить, что источник человеческого транскрипта GAPDH в этом экспериментальном протоколе может быть предоставлен исключительно внутривенно вливанием hUC-MSC. Эта цифра была изменена с Морончини и др. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эндотрахельное управление является преференциальным маршрутом для доставки экзогенных агентов в легкие. С нескольких лет, прямое введение bleomycin в трахею широко используется для индуцирования легочного фиброза13 и, в последнее время, более продвинутые, неинвазивные методы были разработаны для достижения этой14,15 ,16.
Описанный здесь метод дает ряд значимых преимуществ по сравнению с некоторыми потенциальными ограничениями. Инъекция трахеи требует хирургического вмешательства, неся с собой потенциал для осложнений, вызванных самой процедурой, а также необходимость глубокого селяции животных. Поэтому необходима хорошая подготовка и практика совершенствования процедуры. Кроме того, чтобы свести к минимуму страдания мыши, необходимо установить соответствующую дозу анестезии в соответствии с штаммом мыши и индивидуальной реакции и поддерживать строгое наблюдение за состоянием седации животных. Тем не менее, мы наблюдали очень низкий уровень смертности и оптимальное восстановление животных после анестезии. Кетамин и ксилазин могут быть использованы для анестезии, а также трибромоэтанол. Однако у мышей эффективная доза кетамина и ксилазина близка к смертельной дозе; таким образом, они могут легко вызвать остановку дыхания. И наоборот, доза трибромоэтанола можно легко регулировать и, таким образом, является предпочтительным анестетиком. После эндотрахеяле инъекции блеомицина в трахею, мы не наблюдали каких-либо побочных эффектов. Мышей были свободны от лихорадки и никаких признаков воспаления или инфекции наблюдались вокруг трахеи и раны кожи. Поэтому не было необходимости в профилактике антибиотиков. Кроме того, использование операционного микроскопа обеспечивает высокую уверенность в успехе, позволяя оператору точно контролировать правильное размещение иглы в трахею мыши до закапывания, тем самым минимизируя риск повреждения его.
Эндотрахеальная инъекция блеомицина приводит к мощной воспалительной и фиброзной реакции в обоих легких и может рассматриваться как надежный метод для создания экспериментальных моделей мыши человеческих интерстициальных заболеваний легких (ILD). Однако, как ранее документально7, фиброзный ответ на блеомицин у мышей является штамм-зависимых и гендерных и возрастных. Таким образом, очень важно для успеха протокола, чтобы найти допустимую дозу блеомицина в каждой экспериментальной обстановке. Самки мышей были использованы в этом исследовании, потому что основной интерес в этом исследовании было интерстициальное заболевание легких, связанных с системным склерозом, который является заболеванием в значительной степени распространены у молодых взрослых женщин. Три-четыре месяца мышей были выбраны потому, что это возраст, в котором они просто вступают во взрослую фазу (мыши достигают половой зрелости в 8-12 недель возраста)17. Таким образом, они считаются молодыми взрослыми мышами и предпочтительнее, чем более молодые животные, так как фиброз легких не распространен ы у очень молодых особей. Они также предпочтительнее, чем пожилые животные, так как предыдущие исследования18 показали, что в возрасте мышей выставлены изменения в фенотипе фибробластов легких, что приводит к повышенной восприимчивости к неисправности и фиброз у него после травмы легких, которые может представлять собой возможную предвзятость в экспериментальной модели, представленной здесь.
Настой хвостовой вены является простым, надежным и неинвазивным способом обеспечения быстрой и эффективной доставки препаратов в кровоток. Это может быть легко выполнено с простым медицинским оборудованием, короткие ручные тренировки, и снижение расходов.
Экспериментальный протокол, описанный здесь, измененный из ранее опубликованных исследований19,20,21 , существует двойной внутривенный вливание 2,5 х 10 hUC-MSC для повышения клеточной трансплантации в мышь легких и их терапевтический эффект. В самом деле, так как процедура является нетравматической, она может быть повторена в том же животном, но период 7 дней между двумя последовательными инъекциями рекомендуется, чтобы позволить возмещение возможных вазальных ран. Кроме того, мы использовали изофларанинга для анестезии C57BL/6 мышей во время процедуры, чтобы избежать травмы хвостовой вены в случае резких движений животных.
В заключение, этот протокол был успешно применен для эффективного индуцирования легочного фиброза у мышей C57BL/6 и для проверки антифибротического эффекта hUC-MSC in vivo. Этот метод также может быть использован для введения наркотиков или агентов, кроме блеомицина в дыхательные пути, для того, чтобы генерировать различные экспериментальные модели болезни легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом RF-2011-02352331 от Министра Италио делла Салюта (Армандо Габриэлли).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
