Summary
在这里,我们提出了一种有效的方法,以研究静脉注射人类中发性血质细胞的抗纤维化活性,从整个脐带获得后,通过在C57BL的内切治疗注射注射肺损伤/6 小鼠。该协议可以很容易地扩展到其他疗法的临床前测试。
Abstract
肺纤维化是几种人类肺病的标志,病因不同。由于目前的疗法相当有限,小鼠模型仍然是开发新的抗纤维化策略的重要工具。在这里,我们提供了一种有效的方法,以研究从全脐带(hUC-MSC)获得的人类中位血质基质细胞在体内抗纤维化活性,以减轻博霉素引起的肺损伤。C57BL/6小鼠接受单次内切注射布洛霉素(1.5 U/kg体重),然后两次向尾静脉注入hUC-MSC(2.5 x 10 5),在布洛霉素给予后24小时和7天。在第8天、第14天或第21天牺牲时,将分析炎症和纤维化变化、胶原蛋白含量和hUC-MSC在外植肺组织中的存在。将小霉素注射到小鼠气管中,可直接瞄准肺部,导致广泛的肺部炎症和纤维化。双剂量hUC-MSC的系统施用导致博霉素引起的肺损伤的早期钝化。静脉注射hUC-MSC被暂时移植到小鼠肺部,在那里他们发挥抗炎和抗纤维化活性。最后,该方案已成功应用于人类肺纤维化实验小鼠模型hUC-MSC的临床前测试。然而,这种技术可以很容易地扩展,既研究不同内切施用的物质对肺部病理生理学的影响,也验证新的抗炎和抗纤维化全身疗法。
Introduction
肺纤维化是一种渐进的病理过程,其特点是细胞外基质成分(主要是I型胶原蛋白)在肺间质内沉积过多,导致肺功能受损。它是几种具有不同病因的人类肺部疾病的标志,是临床预后不良因素。由于目前的疗法相当有限1,小鼠模型仍然是一个重要工具,以进一步调查影响疾病发病和进展的致病机制,以及开发新的抗纤维化药物策略2,3.
迄今为止,博洛霉素的施用一直是实验诱发肺纤维化最常见的应用模型。除了多种分娩方法(包括静脉注射、腹管内、皮下和吸入外,宫内注射的博洛霉素已成为最常用的途径4、5。本文所描述的方法已经开发出来,以避免霉素对气管粘管的烫伤作用。事实上,通过将气管外在并通过操作显微镜进行可视化,可以实现将整个体积的博洛霉素溶液直接注入下气道,而不会在上气道中溢出。当有所需的外科专业知识和仪器可用时,此方法允许安全、可靠和可重复的诱导肺部炎症和纤维化,如下所述。
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Protocol
所有动物护理和实验程序均获得意大利卫生部的批准(授权书456/2016-PR),并根据《赫尔辛基公约宣言》执行。
1. 老鼠
- 购买后,让小鼠在注射前至少7天适应。
注:小鼠在无病原体条件下被安置在动物设施中,在12小时光/暗循环的恒定温度和湿度下保持,并免费获得水和标准颗粒食物。 - 使用雌性C57BL/6小鼠,在12至16周大时注射。
2. 内切治疗注射博霉素
- 博霉素制剂
注意:根据全球统一的化学品分类和标签制度(GHS),博洛霉素被归类为GHS08健康危害。- 在化学罩下准备博洛霉素。
- 要获得所需的工作浓度(0.05 U/100 μL),在30 mL无菌盐水中重新悬浮15 U的冻干霉素硫酸盐。
- 通过反转管来小心地混合样品,以避免血栓形成。
- 正确标记管与重新悬浮的日期,将其储存在4°C,并在24小时内使用其内容。
- 在灌输之前,将博洛霉素溶液与室温平衡。
注:在本实验中,使用单剂量1.5 U/kg体重的布洛霉素诱导C57BL/6小鼠的肺部损伤。然而,每只小鼠菌株对波洛霉素6,7有不同的敏感性。应对博霉素进行滴定,以确定用于实验的小鼠菌株中的最佳剂量。
- 麻醉
- 在9 mL无菌盐水和1 mL绝对乙醇(工作浓度为20mg/mL)中溶解0.2克2,2,2-三溴二苯乙醇,准备麻醉。
- 通过反转管彻底混合,以避免血栓形成。
- 正确标记管子的制备日期,将其储存在黑暗中4°C,并在3天内使用。
- 每只小鼠使用1mL注射器和26G针头,用250μL的三溴二醇溶液(最终剂量为200mg/kg体重)对小鼠进行麻醉。
注:使用此剂量,小鼠至少昏迷 20 分钟。必要时,根据小鼠反应调整剂量,与兽医协商。 - 监测鼠标呼吸。呼吸速率将稍微减慢。几分钟后,捏一只鼠标脚,检查踏板反射是否缺乏。
- 内切治疗注射
- 在所有过程中保持无菌状态。使用无菌手术器械和材料,戴上无菌手套,避免接触任何非无菌表面。
- 将麻醉小鼠放在手术平台上的背上,用手术胶带细腻地固定它的腿,将其固定到位。
注: 建议轻柔地绑住鼠标腿,以避免鼠标在旋转过程中滑离手术平台(步骤 2.3.10)。 - 将鼠标放在加热垫上,在整个干预过程中使直肠温度稳定在37°C。通过直肠探头测量直肠温度。
- 轻轻地伸出鼠标颈部,把一个"枕头",例如,牙科棉卷,在其颈椎区域下。
- 用剃刀轻轻剃须喉咙。
- 用酒精去除手术区的头发,用1%的波维酮碘溶液对小鼠皮肤进行几次消毒。
- 用一对解剖钳夹住皮肤,用一把环处理的弯曲钝剪刀,在小鼠肌体肌肉的对应性上做一个短切口。
注:皮肤切口长约0.5厘米。去除的相应皮肤片非常小,不会造成鼠标颈部的张力。 - 用棉布棒止血。
- 通过钝解剖将气管外在外,从脂肪和其他组织中轻轻清洁。
- 旋转手术平台,将鼠标头朝向操作者定向。
注:此位置允许操作员在注射过程中将注射器角度,使其沿着气管的自然路径直接连接到肺部。 - 将鼠标放在操作显微镜下,以帮助气管的可视化。调整照明并设置放大倍率(介于 1 和 1.2 之间)、对焦和锐度。气管可以很容易地区分为白色半透明管,气管环清晰可见。
- 通过轻轻移液将博洛霉素溶液混合,用25G针头将100μL吸进0.5 mL注射器中,避免气泡形成。
- 一旦气管在清晰可视化,小心刺穿它与针尖在30°的角度(图1A)。
- 缓慢地将100 μL的卵霉素或无菌盐水(车辆控制)直接注入气管的流明中。等待几秒钟,直到整个体积沿着针向下移动,然后从气管中取出。
- 观察呼吸暂停几秒钟,当针头正确插入气管时,就会发生呼吸暂停,以便鼠标立即吸入液体的整个体积。
- 如果鼠标未吸入液体,请仔细监测其呼吸并调整针头位置。如果鼠标停止呼吸,请立即拔下针头,让小鼠在重新插入之前恢复正常呼吸。
- 注射后安全丢弃注射器和针头。
- 用5-0可吸收缝合线关闭皮下筋膜和皮肤伤口。
注:当未完全重新吸收时,手术后7-10天切除缝合线。
- 动物恢复
- 将注入的鼠标侧放在加热垫上以进行恢复。
- 监测小鼠呼吸并观察鼠标,直到它开始移动并恢复胸腔回肠和全意识。
- 确认鼠标处于良好状态后,将其返回到原始保持架。在完全恢复之前,不要将其归还给其他动物的陪伴。
- 为确保长期性失气和避免任何残留的介入后疼痛,每12小时内切痛注射后给小鼠服用皮下丁丙诺啡(最终剂量为0.05mg/kg体重)。
- 在注射博洛霉素后,检查小鼠24小时,每天做两次。监测小鼠呼吸窘迫、体重减轻、行为异常以及任何发病迹象。
3. 人类脐带等位质细胞的尾静脉输注
- 细胞制备
注:人类脐带中位体细胞的分离、表征和培养,此前曾被描述为8、9、10。hUC-MSC 应无菌操作和注入;因此,在无菌罩下执行所有步骤。- 将 75 cm2培养瓶中的 hUC-MSC 扩展至早期通道(最大 1⁄3)。
注:hUC-MSC在输入小鼠的当天应为70%的汇合。 - 在室温下用10 mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。
- 加入2 mL的胰蛋白酶,在37°C孵育细胞约1分钟,直到它们开始分离。
- 加入含有10%胎儿牛血清(FBS)的8 mL hUC-MSC完整培养基,中和胰蛋白酶。
- 以350 x g离心收集细胞10分钟。
- 在无菌盐水中重新悬浮颗粒,并使用Bürker腔室计算细胞。将细胞稀释至每只小鼠200 μL无菌盐水的2.5 x 105的最终浓度,为输液准备细胞悬浮液。准备过量的细胞悬浮液,以确保有足够的体积注入所有小鼠。
- 输注前,将细胞放在冰上。如第 3.3 节所述,在几个小时内注入。
- 将 75 cm2培养瓶中的 hUC-MSC 扩展至早期通道(最大 1⁄3)。
- 麻醉
注:为了将注射期间损坏小鼠尾静脉的风险降至最低,小鼠不得移动。因此麻醉比简单的鼠标抑制更受欢迎。- 在诱导室中用4%的胶质吸入麻醉小鼠。
- 监测鼠标呼吸。呼吸速率将稍微减慢。几分钟后,捏住一只老鼠的脚,检查是否进行适当的麻醉。
- 尾静脉输液
- 一旦确认无意识,将小鼠置于无菌hUC-MSC静脉输注无菌罩下。
- 在整个实验中,通过连续流动为1.5%的异常人面膜保持全身麻醉。
- 为了促进血管扩张,并允许更容易注射,将小鼠尾巴浸泡在温水中2分钟。
- 通过轻轻移液混合细胞悬浮液,以确保细胞不会形成团块。用26G针将200μL吸气到1mL注射器中,避免气泡形成。
- 握住鼠标尾部的尖端,轻轻拉直鼠标。
- 定位鼠标尾部的侧静脉;用手术刀轻轻刮擦,并用70%乙醇擦拭。
注:轻轻刮擦尾巴以去除毛发,使注射部位更光滑、更清洁。 - 从尾部的远端部分开始,以 15° 角将针头插入静脉,然后缓慢地注入 200 μL 的 hUC-MSC 或无菌盐水(车辆控制)(图 1B)。
- 监测静脉输液成功,液体进入静脉,没有阻力,没有外溢。等待几秒钟,直到整个体积沿着针向下移动,然后从静脉中取出。
- 为防止出血,请用无菌纱布对进入伤口短暂施加压力。
- 输液后,安全地丢弃注射器和针头。
- 动物恢复
- 将注入的鼠标侧放在加热垫上以进行恢复。
- 监测小鼠呼吸并观察鼠标,直到它开始移动并恢复胸腔回肠和全意识。
- 确认鼠标处于良好状态后,将其返回到原始保持架。在完全恢复之前,不要将其归还给其他动物的陪伴。
- 在尾静脉输液后,每隔一天检查小鼠24小时,以监测其健康状况,并及早发现任何痛苦或病理迹象。
4. 器官外植和组织处理
- 在博洛霉素给药(图1C)后,在第8天、第14天或第21天通过过量注射麻醉剂牺牲小鼠。
- 切除气管和肺部,并立即在冰冷的PBS中清洗。
- 在液氮中冷冻右肺并将其储存在-80°C,以便进行后续的分子分析10。
- 用4%的甲醛充气左肺,并将其固定在10%中性缓冲形式溶液中24小时;然后,在分级酒精系列中脱水,在二甲苯中清除它们,并将其嵌入石蜡10中。
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Representative Results
肺损伤是由在100μL无菌盐水中单次注射1.5 U/kg的硫酸洋霉素体重引起的。对照动物接受相同量盐水的内切注射。两针hUC-MSC(2.5 x 105在200 μL无菌盐水)注入小鼠尾静脉,24小时和7天后,博洛霉素。对照动物接受同等体积的无菌盐水的静脉注射。小鼠在博霉素给给后的第8天、第14天和第21天被牺牲用于肺外植和组织处理(图1)。
我们证明,将小霉素直接注入小鼠气管,可以迅速扩散到肺部,导致广泛的炎症、渐进性纤维化和正常结构的扭曲,与先前的研究一致11.肺组织病理学变化通过血氧林-eosin(H&E)和picrosirius红色染色10评估,纤维化通过羟基丙氨酸含量增加和胶原蛋白沉积得到确认(图2)。组织炎症变化由基于支气管、支气管和血管周围炎症渗透的组织学评分系统评估,并在血氧林-欧素染色肺部分10中观察到的间质肺炎。继博洛霉素注射后,肺科的阿什克罗夫特分数逐渐从第8天的平均值1.5增加到第14天的平均值4.5和2110日的平均值6.5。hUC-MSC向小鼠尾静脉的双重注入在很大程度上减轻了博霉素引起的肺损伤,在每个时间点的炎症渗透和纤维化程度显著减少,尽管不完全被废除(图 2.用特异性抗体10进行免疫染色表明,注入hUC-MSC迅速而有效地到达小鼠肺部,尽管只检测到少数细胞,从第8天到第21天,数量减少(图3)。正如先前12日报道的,这些数据表明,尽管细胞具有长期的保护作用,但细胞会迅速从损伤部位脱位。hUC-MSC的免疫组织化学(IHC)染色也发生在盐碱处理的样品中,但鉴于没有引起hUC-MSC的炎症性病灶,因此无法检测到任何细胞。
图1:实验协议的原理图。(A) 小鼠接受单次内切治疗(例如)注射1.5 U/kg体重的博洛霉素,以诱发肺部损伤(第0天)。(B) 从全脐带(hUC-MSC)获得的2.5 x 105人间质基质细胞进行双静脉注射(i.v.)输注,在布洛霉素给药后24小时(第1天)和7天(第7天)进行。(C) 注射和牺牲时刻的时间表显示于此.小鼠组在博霉素给予后的第8天、第14天和第21天(即,第二次HUC-MSC输注后分别为24小时、7天和14天)。这个数字已由莫龙奇尼等人修改。10.请点击此处查看此图的较大版本。
图2:hUC-MSC降调霉素引起的肺部炎症和纤维化。(A和B)从C57BL/6小鼠获得的血氧林-欧素(H&E)和肺部分的代表性显微图像(10倍放大率),在无菌盐水(盐碱)或布洛霉素(布洛霉素)的内切愈合注射后21天,后者随后还静脉注射hUC-MSC(博霉素+hUC-MSC)或无菌盐水(博霉素+盐水)。盐碱对照显示正常的肺结构。在波洛霉素受伤后21天观察到广泛炎症渗透,肺部结构严重变形,纤维化病形成。由于hUC-MSC治疗,不因盐水而显著减弱了博霉素引起的改性。(C) 接受上述治疗的C57BL/6小鼠肺部第8、14和21天的羟基丙氨酸含量。结果为均值 = SD (n = 8 每组),以从内切沙盐水处理小鼠获得的值的百分比表示,并代表三个独立实验。•P < 0.05, =P < 0.01,与博霉素处理小鼠相比。(D) 接受上述治疗的C57BL/6小鼠在第8天、第14天和第21天获得全肺mRNA中的小鼠Col1A1表达水平。结果为均值 = SD (n = 5 每组),代表在三次三次实验中进行的三个独立实验。•P < 0.05, =P < 0.01,与博霉素处理小鼠相比。这个数字已由莫龙奇尼等人修改。10.请点击此处查看此图的较大版本。
图3:肺组织hUC-MSC检测。(A和B) 从接受内切球霉素的小鼠获得的肺部分的抗HLA-1抗体的免疫染色代表性显微图像(分别为200倍和400倍放大倍数),然后静脉注射hUC-MSC。红色箭头表示正彩色 hUC-MSC。(C) 在输注前从培养的hUC-MSC中提取的整mRNA(注入hUC-MSC)或从肺组织中抽取的C57BL/6小鼠接受内皮治疗后,通过定量实时聚合酶链反应(PCR)测定进行人体GAPDH评估博洛霉素随后是静脉注射hUC-MSC(博霉素+hUC-MSC)。结果为均值 = SD (n = 5 每组),代表在三次三次实验中进行的三个独立实验。值得注意的是,本实验协议中的人类GAPDH成绩单的来源只能由静脉注射hUC-MSC提供。这个数字已由莫龙奇尼等人修改。10.请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
内切管管理是向肺部输送外源性药物的优先途径。几年来,将肌霉素直接注射到气管中已被广泛用于诱发肺纤维化13,最近,已经开发出更先进的非侵入性技术,以实现这14,15 ,16.
此处描述的方法提供了一些有意义的好处,以超过一些潜在的限制。气管的注射需要手术干预,携带手术本身引起的并发症的可能性,以及深动物镇液的需要。因此,在完善程序方面需要做好充分的准备和实践。此外,为了尽量减少小鼠的痛苦,必须根据小鼠菌株和个体反应设定适当的麻醉剂量,并保持对动物镇定状态的严格观察。然而,我们观察到死亡率非常低,动物从麻醉中恢复最佳。氯胺酮和木兰素可用于麻醉,以及三溴二苯丙胺。然而,在小鼠中,氯胺酮和木兰素的有效剂量接近致命剂量;因此,它们很容易诱发呼吸停止。相反,三溴二苯醚的分给剂很容易调整,因此是一种可取的麻醉剂。在将气管霉素注射到气管后,我们没有发现任何不良反应。小鼠没有发烧,在气管和皮肤伤口周围没有发现炎症或感染的迹象。因此,不需要抗生素预防。此外,使用操作显微镜可确保高度的成功信心,使操作员在注入之前能够准确监控针头在小鼠气管中的正确位置,从而将损坏针头的风险降至最低。
体细胞内注射的卵霉素在两个肺部产生强烈的炎症和纤维化反应,可被视为生成人类间质性肺病(ILD)实验小鼠模型的有力方法。然而,正如先前记载的7,小鼠对博霉素的纤维化反应是依赖性以及性别和年龄相关的。因此,在每个实验环境中找到可耐忍受的博霉素剂量对协议的成功至关重要。在这项研究中使用了雌性小鼠,因为这项研究的主要兴趣是与全身硬化症相关的间质肺病,这是一种在年轻成年女性中流行的疾病。选择三到四个月大的小鼠,是因为这个年龄,他们只是进入成人阶段(小鼠达到性成熟在8-12周的年龄)17。因此,它们被认为是年轻的成年小鼠,比年轻的动物更可取,因为肺纤维化在非常年轻的个体中并不常见。它们也比年长的动物更可取,因为以前的研究18已经表明,老年小鼠表现出肺成纤维细胞表型的变化,导致肺损伤后失修和纤维化的易感性增加,这可以代表这里介绍的实验模型中可能存在的偏差。
尾静脉输液是一种简单、可靠、无创的方法,可确保药物快速有效地输送到血液中。只需简单的医疗设备、短期的手动培训以及降低成本,即可轻松完成。
此处描述的实验方案,从先前发表的研究19,20,21修改,存在2.5 x 105 hUC-MSC的双重静脉输注,以增强细胞移植到小鼠肺及其治疗效果。事实上,由于这个程序是非创伤性的,它可以在同一动物中重复,但建议在连续注射之间7天,以便赔偿最终的血管伤口。此外,我们在手术过程中使用异苯并对C57BL/6小鼠进行麻醉,以避免动物突然运动时的尾静脉损伤。
最后,该方案已成功应用于有效诱导C57BL/6小鼠肺纤维化,并验证hUC-MSC体内抗纤维化作用。该方法还可用于将博霉素以外的药物或制剂注入气道,以生成不同的实验性肺病模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了意大利部长德拉·萨洛(阿曼多·加布里埃利)的RF-2011-02352331赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
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