Summary
여기, 우리 악기를 포함 한 녹색 형광 단백질을 표현 하는 녹 농 균 biofilms에 전단 응력 효과의 분석을 위한 형광 현미경과 함께 더 높은 처리량 미세 생물의 사용 설명 설정, biofilm 범위, 성장 율, 및 형태학 속성의 결정.
Abstract
형광 현미경과 함께 생물 체 외에서 높은 처리량 미세 세균의 biofilm 성장 형태학, 녹 농 균 (P. 녹 농 균) 등을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여기, 우리는 시스템을 사용 하 여 표면 거칠기 등 피 농 균 스트레인 표현 하는 향상 된 녹색 형광 단백질 (PA01 EGFP PA01의 조직상 엔트로피 형태학 속성과 성장 속도 론을 공부 하는 방법을 설명 합니다. ). 자세한 프로토콜 성장과 PA01 EGFP 문화를 시드하는 방법을 설명 합니다, 설정 하는 방법 현미경 및 자동 실행, 이미지 분석을 성장 율 및 형태학 속성에 의해 제어 되는 전단 세력의 다양 한 사용 하는 미세 장치입니다. 이 문서는 결국 미세 플랫폼을 사용 하 여 박테리아, 균 류, 또는 조류 biofilms의 다른 변종으로 적용 될 수 있는 PA01 EGFP biofilms의 연구 개선 하는 기술에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.
Introduction
여기, 우리는 형광의 형성에 전단 응력의 영향을 측정 하는 방법을 시연할 예정 이다는 자동된 높은 처리량 미세 시스템을 사용 하 여 녹 농 균 (P. 녹 농 균) PA01 biofilms.
Biofilms는 미생물, 박테리아, 세포 외 고분자 물질을 지원에 연결 하 고 일반적으로 액체와 고체 표면1인터페이스에서 찾을 수 있습니다 의해 조직 등의 사회. 개선 수 질 물 공급 라인 및 고집 불통의 bioremediation 화합물2,3와 같은 이러한 biofilm 커뮤니티 환경에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, biofilms 매우 바람직하지 않은 결과 함께 인간의 건강에 유해한 수 있습니다. 예를 들어 엉덩이 무릎 임 플 란 트 등 의료 기기 표면 어디 biofilm 축적 도전 하고있다 심각한 의료 합병증4,5발생의 한 유형입니다. Biofilms 수 또한 같은 강, 호수, 자연의 물 시스템을 입력 하 고 박테리아 감염6,,78인 식 수에 오염에 지도 하는 물 공급 관을 침투. Biofilms 해양 환경에서 형성 된 배와 다른 사람이 만든 기판에 고착 하 고 증가 마찰 증가 연료 소비9,10리드 주요 경제 및 환경 문제를 제시. 같은 Tributyltin, 항균 성 코팅, 이러한 문제를 방지 하기 위해 개발 되었습니다 하지만 해양 생물11독성이 있다.
P. 녹 농 균 은 높은 번성 기능 다양 한 환경 및 nutrimental 조건12그램 음성 박테리아입니다. P. 농 균 지역 사회와 병원 획득 감염의 일반적인 원인은 이며 밀접 하 게 될 관련 부상, 심한 화상, immunocompromised 호스트 등을 같은 낭 성 섬유 증 (CF)5,12, 발견 13, 에이즈, 그리고 암 환자5,13. P. 농 균 biofilms의 대형은 가장 심각 하 게 만성 폐 감염5이 질병 대 한 죽음의 주요 원인이 되는 CF에 연결 되었습니다.
P. 녹 농 균, PA01의 참조 스트레인이이 보고서에 사용 되 고는 향상 된 녹색 형광 단백질 (PA-EGFP)를 표현 하기 위해 유전자 변형. EGFP 돌연변이 형태의 GFP 큰 형광 속성 biofilm 분석 제자리에 형광 현미경 검사 법14,,1516를 사용 하 여 수 나타냅니다. 형광 분석의이 종류는 biofilms의 연구에 대 한 유리한 GFP는 세포 성장 및 기능17크게 방해 하지 않는 때문입니다. 예를 들어 대장균 세포 GFP와 태그를 제어 박테리아17에 비해 어떤 독성 효과 겪어 없이 잘 하 고 지속적으로 성장. 다른 보고서는이 주장을18,,1920입증할. 또한, EGFP 같은 형광 기자를 사용 하 여 신속 하 고 간단 하 고, 아직 죽은 세포는 신속 하 게21형광을 중단 하기 때문에 라이브 셀으로 측정 됩니다.
Biofilms는 다른 흐름 율을 가진 포함 하는 다양 한 환경 조건에서 성장할 수 있다. 예를 들어 영화 성장할 수 있다 높은 전단 응력에서와 같은 강, 높은 물 흐름 조건22큰 미생물 다양성 리드에. 반대로, 서 있는 물 연못 또는 구두 biofilms는 훨씬 낮은 전단 힘23경험. 유량, 이외에 있다 biofilm 접착, 표면 거칠기 등 hydrophobicity, 미디어 구성, 영향을 미치는 다른 요인 그리고 심지어 박테리아 세포 표면1,4,7, 24. 조건 또한 공간 구조 나 형태는 biofilm의 변화를 일으킬 수 있습니다. 이 움직이는 액체에 의해 발휘 된 전단 응력 등 환경 조건 또는 양분 가용성 및 종 같은 생물학적 요인에 그라디언트 시스템, 세포의 운동 성 및 특정 단백질에는 세포 외에 존재 고분자 물질25,,2627 어떤 조건에서 biofilm 잔디 같은 것은 biofilm 거친, 솜 털, 또는 버섯 모양의28도 다른 조건 (부드럽고 평평한), 동안. 체계적이 고 양적 biofilm 잔디와 버섯 구조 사이의 질적 차이 미세한 이미지에서 명확 하 게 볼 수 있습니다, 하는 동안 필요한 영화 구조와 영화 내에서 생물 학적 프로세스 사이의 관계를 이해 형태를 설명 하는 방법. 연구자에 의해 연구에 대 한 제안 형태학 속성 다공성, 프랙탈 차원, diffusional 길이, 층, microcolony 볼륨, 거칠기 계수, 그리고 텍스처 엔트로피29,30 microcolony 지역 포함 .
Bioreactors는 biofilms의 연구에서 실제 생활 조건31을 모방 하는 데 사용 됩니다. 똑 흐름 원자로 (DFR) 낮은 전단 환경을 미디어에 영양소 높은 세포 밀도32biofilm을 형성 하는 시간이 지남에 표면에 부착 하는 셀에 걸쳐 천천히 흐름을 나타냅니다. CDC 원자로 지속적으로 미디어 내 회전 교 반 막대의 제어에 의해 높은 전단 응력 유체 환경을 만드는 bioreactors 채워진 탱크33. 생물 반응 기의이 유형은 간단 하 게 설정, 하지만 그들은 상대적으로 낮은 샘플 크기, 미디어, 미디어 똑 흐름 125 µ L/분 똑 흐름 원자로에서 배열에서 생산 하는 유해 폐기물의 큰 금액의 높은 소비 때문에 범위에 제한 됩니다. 이상 1 mL/분 CDC 원자로 및 고압 대용량 유리 및 폐기물 미디어34의 필요를 Biofilms 성장 하지 않는다 균등 하 게 물방울 흐름 반응 기에서 표면에 걸쳐 미디어의 낮은 전단 P. 농 균 박테리아의 큰 대기업 따라 따라서 후행, biofilm 성장 매우 부드러운 되지 않습니다 원인과 고르지 샘플 수 없습니다 있기 때문에 형광 현미경 검사 법35,36 으로 쉽게 분석.
몇 가지 일반적인 생물 제한만 미디어의 밀리 리터, 고 반응 접시는 작고 쉽게 일회용 압력가 마로 소독37후 중간 처리량 미세 생물을 사용 하 여 극복 됩니다. 또한, 우물의 수에 따라 실행, 충분 한 양의 데이터를 의미 있는 통계 분석을 제공 하는 하나의 반응 기에서 많은 복제를 수행할 수 있습니다. 그림 1, 허용 온도 포함 하 여 제어 된 조건 하 고는 흐름 속도38,,3940, 미세 현미경 시스템의 다른 구성 요소에 표시 됩니다. 생물 낮은 환경에서 또는 생물 의학 분야에서 발생 하는 보다 현실적인 시나리오를 모방 하는 높은 전단 조건 적용 시각화 아래 PA01 EGFP 태그의 형광을 형광 현미경과 결합 이다.
그림 1 : 미세 시스템의 개별 구성 요소. 개별 구성 요소는 왼쪽에서 오른쪽으로 나열 됩니다: 1. CCD 카메라, 2. 높은 해상도 거꾸로 현미경 자동 단계와 자동 형광 모듈, 자동 초점 모듈, 3. 4 판 단계: 이미징 시스템 인터페이스, 5: 수동 현미경 단계 제어, 6: 증기 트랩, 7: 이미징 시스템 컨트롤러 (온도 조절기 포함) 8: 하드웨어 컨트롤러, 9: 형광 컨트롤러, 10: 무정전 전원 공급 장치, 11: 이미지 저장, 12에 대 한 외부 하드 드라이브: PC 워크스테이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
미세 접시의 발췌는 그림 2에 표시 됩니다. 48 웰 스가 가장 일반적으로 사용 되는 격판덮개에 의하여 이루어져 있다. 한 실험에는 1 개의 입구 및 1 개의 출구 우물, 2 웰 스의 총 필요합니다. 항균 처리 및 미디어 채널에서 채널을 다양 하 고 6 개의 채널의 각 열에 대 한 전단 흐름 제어 실험에 대 한 24 동시 수행할 수 있는 세균성 긴장 등 다양 한 실험 조건, 수 있습니다. 실험 온도 또한 접시에 걸쳐 한 온도 설정으로 제어 됩니다. 미세 채널 각 채널에는 충분 한 배 압 및 제어 전단 제공 하 문석 영역 표시.
그림 2: 미세 채널 보기 창을의 시각화. 미세 채널 그들 연결 2 개의 입구와 출구 웰 스는 빨간색과 녹색 염료는 강조 표시 됩니다. 염료 보이도록 뱀 지역 유체 흐름 시 충분 한 배 압 및 제어 전단 만드는 각 채널에서 합니다. (빨간색 동그라미) 안에 각 보기 채널 원하는 파장 몇 군데 될 수 있습니다. 밝은 분야 (맨 위) 및 형광 (아래)은 20 X 목표를 사용 하 여 PA01 EGFP biofilm 단일 채널의 현미경 이미지. 눈금 막대 = 80 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
단계적으로 가이드는 형광 현미경 검사 법 사용 하 여 다른 전단 환경 소설 biofilm 실험을 실시와 함께 결합 된 미세 bioreactors의 사용자를 허용 하도록 제공 됩니다. 이 방법은 박테리아, 균 류와 조류, 의료 및 환경 응용 프로그램41,,4243있는 등 외 다른 미생물을 포함 하는 실험의 확장에 대 한 수 있습니다. 자세한 접근 PA01 EGFP 문화, 접종 48-잘 접시 미세 장치 및 소프트웨어를 설정, 형광 현미경, 설정 하 고 biofilm 범위, 성장 속도를 소프트웨어 분석을 설명 하는 방법을 설명 하 고 표면 거칠기 같은 형태학 속성.
Protocol
1. 미디어 준비
- 포도 당 0.25%와 최소한의 미디어 (MM)를 준비 합니다. M M의 1 L 0.25% 포도 당으로, 살 균 M9 소금 솔루션, 살 균 1 M MgSO4의 2 개 mL, 살 균 1 M CaCl2, 100 µ L 및 살 균 20% (w/v) 포도의 12.5 mL 200 mL에 추가 1 나의 마지막 볼륨에 물 (dH2O)
- 무 균 기술을 사용 하 여 무 균 병에 필요한 미디어를 전송. 사용 되는 채널의 수에 따라 필요한 금액을 준비 합니다. 일반적으로, 각 채널 24 시간 실험에 대 한 시드 및 1300 µ L 위해 300 µ L를 못쓰게 200 µ L을 필요 하다.
- 실험 온도 설정 인큐베이터 또는 물 목욕에 병을 배치 합니다. 미디어는 microchannels에서 형성 하는 거품을 피하기 위해를 사용 하기 전에 실험 온도 이어야 한다.
2. PA01 EGFP의 하룻밤 하 고 실험적인 문화 준비 합니다.
- 살 균 수급 플라스 크에 실험 미디어의 15 mL를 놓고 PA01 EGFP와 줄무늬 한 천 배지에서 하나 또는 두 개의 식민지와 접종 합니다. 12-16 h는 37 ° C와 180-220 rpm 인큐베이터/쉐이 커 테이블에 대 한 문화를 확장 합니다.
- OD600 의 숙박 문화를 측정 합니다. OD600 0.80 보다 크면, 37 ° C까지 미세 채널을 시드를 위한 필요에서 신선한 m M. 인큐베이터 또는 물 목욕에 실험적인 문화 장소를 사용 하 여 0.8의 최종 OD 하룻밤 문화를 희석. 그것은 변경 되지 크게 대상에서 OD600, 0.8이 경우에 뿌리기 직전 세600 다시 확인 합니다.
3. 장비 시동
- 그림1에서 설치와 비슷한 사용자 가이드에 따라 시스템 역을 설정 합니다. 소프트웨어 악기의 연결에서 오류를 방지 하려면 다음과 같은 순서로 악기 설정:
PC 워크스테이션
형광 모듈입니다. 형광 셔터 (셔터 버튼에 의해 블루 빛) 켜져 있는지 확인
하드웨어 컨트롤러
이미징 시스템 컨트롤러 ( 재료의 표참조)
CCD 카메라
영상 역 (현미경)
참고:가 열된 플레이트의 온도 원하는 실험 온도에 조정 되어야 한다. - 제어 응용 프로그램을 시작 하 고 접시의 측면 라벨에 번호를 입력 합니다.
참고: 응용 프로그램 시작 후 있을 것입니다 두 개의 별도 응용 프로그램 창, 현미경 영상 소프트웨어를 제어 하는 소프트웨어에 대 한 하나 펌프와 잘 플레이트 인터페이스를 제어 하는 제어 모듈에 대 한 하나. 이 그림 s 1, "다중 차원 인수" 메뉴 상단에 오픈 하 고 제어 모듈 하단에는 자동 실행에 대 한 설정에 표시 됩니다.
4. 못쓰게 하 고 미세 판 시드
참고: 애 벌 칠, 시드, 세균성 부착 및 성장 그림 3에서 설명.
- 접시의 바닥에 유리 표면을 만지지를 포장에서 48-잘 미세 플레이트를 제거 합니다. 렌즈 조직는 보풀이, 또는 저 린 지우기와 잘 접시의 바닥에 유리 슬라이드를 청소 합니다.
- 미세 채널을, 플라스틱 37 ° C m M의 200 µ L 출력으로 음, 거품을 피하기 위해 주의 되 고. 플레이트 단계에 접시를 놓고 에탄올, 판 단계에 그것을 밀봉 하기 전에 건조 수 있도록 인터페이스를 닦아.
- 제어 모듈에 수동 모드 설정 액체 LB로 37 ° C, 최대 전단 에서 5.00 다 인/c m2에서. 채널을 못쓰게 출력 웰 스 잘, 흐름 출력에서 입력을 활성화 하려면 클릭 합니다. 못쓰게 하는 5 분 후 시드에 대 한 준비 흐름을 일시 중지 합니다. 조심 스럽게 무대에서 접시를 제거 하 고 플라스틱 잔여 미디어 출력 하지만 미세 채널 리드 측근에서 미디어를 제거 하지.
- 실험적 채널 씨앗, 먼저 잘 잘 잘 출력으로 출력에 pipetting 300 µ L 세균성 문화의 선행 입력으로 m M의 300 µ L 플라스틱. 접시에 그것을 배치 하기 전에 인터페이스를 닦아 하 판 단계에 다시 접시를 놓습니다.
- 제어 모듈에서 현미경 스테이지에 접시 무대 배치 후 피드 라이브 카메라를 사용 하 여 단일 채널에 초점. 시각적으로 생중계 하 여 모니터링, 1.00-2.00 다 인/cm2 셀 실험 채널 입력을 허용 하도록 대략 2-4 s에 대 한 하지만 뱀 채널에서 흐름을 다시 시작 합니다. 셀 첨부 파일에 대 한 수 있도록 1 h에 대 한 온도 제어 단계에 접시를 남겨 주세요. 1 h 인큐베이션 기간 동안 자동 실행 (5 단계)에 대 한 제어 모듈 및 몽타주 소프트웨어 설정할 수 있습니다.
참고: 시드에 필요한 시간의 양을 달라 집니다 미디어와 유기 체, 그래서 생중계까지 최적화 된 일반적인 기간으로 사용에 의해 주의깊게 감시 되어야 한다. 접시에 걸쳐 시드 완전 한 시드를 위한 채널의 특정 열에 적용 된 흐름의 더 많은 시간을 필요로 하는 것을 달라질 수 있습니다. - 첨부 파일 기간 후 부드럽게 무대에서 접시를 제거 하 고 플라스틱 먼저 피하는 채널을 방해 하는 출력에서 박테리아. 새로운 피 펫 팁 입력된 우물에서 미디어를 제거 합니다.
그림 3 : 실험의 개요 못쓰게, 시드, 그리고 미세 채널 PA01 EGFP의 첨부. 애 벌 칠, 시드, 그리고 첨부 파일 설명입니다. 못쓰게의 첫 번째 단계는 출력을 도입 하는 신선한 미디어를 필요 합니다. 시드 수반 미디어와 세균성 문화는 입력에서의 볼륨을 동등 하 고 웰 스, 각각 출력. 문화는 뱀 채널 막힘 방지 실험 채널 (레드 라인)의 보기 세그먼트를 전달 하지 해야 합니다. 인큐베이션 기간이 끝난 후 신선한 미디어 지속적으로 흐름, 입력에서 보기 챔버를 콘센트에. 첨부 파일 및 세균의 biofilm의 성장을 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
5. 소프트웨어 설정
- 소프트웨어에서 "여러 차원 수집" 현미경 이미지 수집 제어를 엽니다. "메인" 메뉴에서 "Timelapse", "여러 단계 위치", 및 "여러 개의 파장" (그림 S1A)를 선택 합니다.
- 설정 저장 설정 간단한 기본 이름, 증분 기본 이름 파일이 선택 되어 있는지 확인 하 고 만듭니다. 폴더는 모든 파일을 저장 됩니다 선택 디렉터리 선택 을 클릭 합니다. 설명에 실험의 필수 세부 정보를 포함 합니다.
- Timelapse 탭 24 h 실험 시간의 기간 을 조정 합니다. 얼마나 자주 제어 이미지 인수, 이미지는 실험을 통해 5 분 마다 인수 시간 간격 설정. 시간 포인트의 번호를 자동으로 매개 변수 설정된으로 조정합니다.
- 밝은 분야 현미경, 정확한 위치 및 초점에 대 한 허용 피드 라이브 카메라를 사용 하 여 단계 위치를 설정 합니다. 접시에 새겨진 10 X 목적, 위 또는 채널 번호 아래에 있는 채널의 센터에 초점으로 시작. 최적의 보기 영역 및 채널 내의 초점 비행기를 찾는 20 X 목적으로 전환 합니다. 목록에 위치를 추가 하거나 미리 설정 된 채널 위치를 대체 하는 새로운 설정으로.
- 파장 에서 메뉴, 3 파장의 수를 설정 합니다. 1 (W1) 파장, FITC 100% 캠 10 ms 노출 시간을 선택 합니다. 2 (W2), 파장 선택 3 양 파장 3 (W3)에 대 한 모든 폐쇄 필터 설정의 최소 노출 시간으로 대물 50% 캠 50% 대 그래서 빛 수집 시간 사이 마지막 채널에 남아 있습니다.
- 제어 모듈을 설정할 때 수동 실행 중지 되도록 확인 합니다.
- 프로토콜 설정 탭 아래에 있는 편집 자동 실행 메뉴에서 원하는 전단 속도로 앞으로 방향에서 흐르는 기간 시간의 24 h에 대 한 새로운 프로토콜을 설정 합니다. 전단 속도 전단 속도 biofilm 성장의 효과 연구를 다양 합니다. 추가 하 고 다른 이름으로 저장 프로토콜을 클릭 합니다.
- 시퀀스 설정 탭에서 모든 채널에 대 한 기본 유체로 LB@37degrees 를 선택 하 여 새 시퀀스를 만듭니다. 채널 1-12 단계 반복 1에서 원하는 전단 속도 및 활성화 된 프로토콜 모든 채널을 선택 합니다. 채널 13-24에 대 한 두 번째 원하는 전단 속도 및 사용 프로토콜 모든 채널을 선택 합니다. 적용 하 고 다른 이름으로 저장 순서를 선택 합니다.
- 자동 실행 메뉴에는 자동 실행에 사용할 저장 된 시퀀스를 선택 합니다.
6. 타임된 Biofilm 성장 실험 설정
- 미세 접시의 입력으로 최대 1300 µ L 살 균 m M의 플라스틱. 플레이트 스테이지로 다시 접시를 놓고 에탄올, 에탄올 접시를 밀봉 하기 전에 완전히 건조 수 있도록 인터페이스를 닦아.
- 접시를 배치 현미경 무대에 무대 해야 하는 프로토콜 및 시퀸스 정확 하 게 설정 됩니다. 신속 하 게 취득 현미경 이미지 컬렉션 시작을 클릭 하 여 다음 자동 실행을 시작 하려면 시작 을 선택 합니다.
- 초점 및 이미지 acquirements 사이의 모든 무대 위치의 배치를 조정 합니다. 일시 중지 를 선택 하 고, 밝은 필드 파장에 라이브 이미지 모드를 사용 하 여, 선택 이동 각 단계 위치를 볼 수 있습니다. 전류로 설정을 선택 하 여 새로운 설정을 설정 합니다. 다음 예약 된 인수 시간 전에 다시 시작 을 클릭 합니다.
7. 검토 및 초과 Biofilm 성장 실험 후 이미지 시퀀스를 분석
- 24 시간에 따라 각 채널 검토 자동 실행, 소프트웨어에서 엽니다 다차원 데이터 검토, 분석 도구아래에 있습니다. 기본 파일 선택 클릭 | 디렉터리 선택 의 실험에 대 한 이미지 시퀀스와 폴더를 탐색 하. 데이터 집합 에 표시 되는 폴더의 목록에서 관심의 데이터의 기본 이름을 선택 합니다.
- 관심의 데이터를 선택이 데이터를 검토 하려면 보기 를 클릭 합니다. 파장 창 (그림 S2)에서 해당 데이터를 검토 하는 파장을 선택 합니다.
- 검토 단계 위치 에서 채널 번호를 선택 하 고 비디오 컨트롤을 사용 하 여 289 시간에 대 한 데이터를 분석 하 여 각 채널에 대 한 이미지 시퀀스 포인트 (가정 하 이미지 24 시간 시간 프레임 동안 5 분 마다 얻을 수 있습니다). 유용한 성장 데이터를 기록해 둡니다.
참고: 각 채널에서 공기 방울과 나 막 신에 영향을 미치는 데이터 채널 내에서 biofilm 성장 방해 합니다의 개발에 대 한 감시. 그러나, 이러한 이러한 상황 전에 실행된, 데이터의 뒷부분에 발생 하는 경우 찾을 수 있습니다 유용한. - 검토 하 고 분석을 위해 원하는 데이터를 선택, 후 각 채널에 대 한 이미지의 스택을 만듭니다. 파일 메뉴에서 오픈 특별 한 선택 | 스택을 구축 | 이름 번호. 빌드 스택 창에서 첫 번째 이미지 선택 버튼을 선택 후 파일 폴더; 스택에 대 한 첫 번째 이미지를 선택 마지막 이미지 선택 버튼을 선택 하 고 마지막 해당 하는 스택에서 이미지 파일을 선택 합니다. 확인 시간 순서 대로 채널의 모든 이미지와 스택의 열을 클릭 하십시오. 스택 아래 파일 메뉴의 다른 이름으로 저장 tiff 파일로 저장할 수 있습니다.
참고: 엄지 이미지 스택을 만들지 마십시오. 이러한 파일 매우 유용 하며 하드 드라이브에 공간을 저장 하는 삭제 된 수 있습니다. 또한, 이미지 파일은 다음과 같이 저장 됩니다.
기본 NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #입니다.
예를 들어 07062018_W1FITC 100_s12_t112 12 채널, 시간 포인트 112, 기본 이름 "07062018" 첫 번째 파장 FITC 100% 카메라 데이터에 있는 이미지입니다. - 마지막으로, tiff 스택으로 시퀀스를 저장 하려면 파일 드롭 다운 메뉴에서 다른 이름으로 저장 을 선택 합니다. 스택 또한 중첩 하 고 동영상으로 저장할 수 있습니다. 이 9 단계에서 해결 됩니다.
- % 표면 범위를 측정 하기 전에 이미지 거리 보정. 분석 도구에서 측정 거리에 클릭 합니다. 적절 한 교정 측정을 선택 하 고 열려 있는 모든 이미지에 적용을 클릭 합니다.
- 시퀀스의 첫 번째 이미지에는 스택을 실행 하는 동안 임계값 버튼 클릭 합니다. 밝은 필드에 임계값 형광 (FITC 파장) 신호와 어두운 개체에 대 한 자동 임계값 에 대 한 임계값 빛 개체에 대 한 자동 임계값 사용 합니다. 이미지의 범위를 나타내는 범위를 임계값을 조정 합니다.
- 형광 임계값에 대 한 어떤 배경 신호 및 신호를 제외 하 고 최소 임계값 감지,이 비 형광을 포함 하는 채널 신호 측정을 위해 셀은 설정 설정할 비 형광 세포와 채널 활용 하지의 형광 영역을과 대 평가. 이 다 수 있습니다 실행을 경우 비 형광 컨트롤에 대 한 더, 채널 하나 이상 사용 하는 것이 좋습니다 그래서.
- 밝은 분야 임계값에 대 한 모든 셀 오렌지 임계값 서명 적용 되지 않습니다, 만약 조정 슬라이딩 도구 모음 또는 모든 셀이 되도록 임계값 이미지 ( 분석 도구아래에서 발견)를 사용 하 여 통해 최대 임계값 덮여 있지만 어떤 배경 제외 됩니다.
참고: 이러한 임계값 이상적으로 것 이다 사용할 스택 내의 모든 이미지를 모든 채널에 대 한, 임계값 값 한 이미지/채널 선택 되지 않을 수 있습니다. 다른 이미지 또는 채널에 대 한 적절 한 따라서 사용자 임계값 범위를 조정 해야 할 수도 있습니다. 정기적으로. 이러한 이유로, 그것은 항상 최대를 기록 하는 것이 좋습니다 하 고 최소 임계값 사용 해야 나중에 검토 될 필요가 데이터.
- 계량 분석 도구에서 적용 지역 통계 표시를 클릭 합니다. 전체 이미지 를 선택한 사용 임계값 선택 되어 있는지 확인 하 고 얻은 데이터, 원하는 측정/설정 선택 되어 있는지 확인 (임계값 영역, 평균, 표준 편차, 최소, 최대, 및 % 임계값 지역)입니다. 로그 열기 에 클릭 하 고 DDE 파일 확인을 클릭 하기 전에 선택 되어 있는지 확인 합니다. Microsoft Excel 을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 열고, 자동으로 로그 데이터 를 클릭 하 여 스프레드시트에서 분석 되는 이미지의 측정 기록.
- 이 스프레드시트 열어두고, 단일 스택에 대 한 모든 이미지 분석 데이터를 수집 하려면 같은 시트를 사용 합니다. 스택의 4 이미지와 임계값 최적의 설정으로 이동 합니다. 지역 통계 표시 화면에서 로그 데이터 에 클릭 하 고 값은 스프레드시트에 기록 됩니다. 반복이 이미지의 분석에 대 한 모든 15 분.
8. Biofilm 형태학 스위트 룸에서 다른 분석을 포함 한 형태학 및 표면 범위 측정을 사용 하 여 파이썬 스크립트
- 아나콘다, https://www.anaconda.com/download에서 사용할 수 있는 같은 표준 과학 파이썬 배포를 사용 하 여 표준 과학적인 모듈을 포함 하는 파이썬 3.6의 배포를 설치 합니다.
- Https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git로 이동 하 여 브라우저에서 GitHub에서 Biofilm 형태학 스위트를 얻을 다음 복제 또는 다운로드 (녹색 버튼)을 선택 하 고 Zip 다운로드선택. 파일을 압축 해제 하 고 작업 디렉터리에 코드 폴더를 이동 합니다.
- 이미지 스택 "범위" 폴더에 복사 하 여 %thresholded 범위를 측정 합니다. 터미널 창을 사용 하 여 해당 폴더로 이동 하 고 다음 명령 사용 하 여 스크립트 실행
python bfCoverage.py tiffStackName.tif
하는 명령 라인 인터페이스, tiffStackName.tif 는 이미지의 tiff 스택을 포함 하는 파일의 이름. 으로 시간 함수는 이름으로 생성 됩니다 각 시간 지점에서 범위 측정을 포함 하는 텍스트 파일 이름을 tiffStackName.txt 및 보도의 음모와 그래픽 파일 생성 됩니다 tiffStackName.png. - 8.3 단계에서 지정한 동일한 절차를 사용 하 여 다른 형태학 상 특성을 측정: biofilm 축적, 거칠기 계수, 그리고 텍스처 엔트로피. 누적 측정에 대 한 bfAcc.py 스크립트, 거칠기 계수 측정에 대 한 roughCoef.py 스크립트와 TEvsTime.py 스크립트를 사용 하 여 텍스처 엔트로피 측정에 대 한.
9. 기타 소프트웨어 애플 리 케이 션-오버레이 및 동영상 만들기
- 여러 개의 파장을 사용 하는 경우 오버레이 스택이이 파장을 포함 하 여 만듭니다. 관심의 모든 스택을 열고 단계 7.6에서에서 해 서 거리를 보정 합니다.
- 분석 도구에서 오버레이 이미지를 선택 합니다. 관심의 더미로 소스를 설정 합니다. FITC 스택의 무지개 원에 클릭 하 고이 파장을 강조 하기 위하여 추가 될 녹색 색상 필터를 선택 합니다.
- 발 를 사용 하 여 오버레이 조정 하는 FITC 스택 이미지에 없었던 이유는. 모든 조정 한 후 모두 스택에 대 한 모든 비행기 를 선택 하 고 적용을 클릭 합니다. 7.5 단계에서 설명 하는 스택 또는 단계 9.2에서에서 설명한 동영상으로 같은 방식으로 오버레이 저장 합니다.
- MM 표준 및 스택, timelapse 동영상으로 스택 또는 오버레이 저장 하려면 동영상 만들기를 클릭 합니다. 스택 또는 원하는 오버레이 소스를 선택 합니다. 저장 을 클릭 하 고 70-80 사이 설정 품질 마이크로소프트 비디오 1 로 저장 합니다.
Representative Results
그림 4 보여줍니다 백분율 thresholded 지역 시간이 지남에 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에서 실행 하는 24 시간에서. Biofilm 범위 또는 % 임계값 영역 (C [%]) 모든 3 개의 전단 설정 달랐다. Biofilm 범위는 1.0 다 인/cm2 전단에서 가장 빠른 임계값 영역 2-5%에서 100로 증가 성장 200 분 후 %400 분 후 고정 단계에 도달 했습니다. 0.5 다 인/cm2, biofilm 범위 지연 됐다 고 800 분 후 100% 범위를 도달 하는 400 분에 증가 하기 시작 했다. 0.2 다 인/c m2 에서 가장 낮은 전단 명확 하 게 biofilm 범위, 백분율 범위 500 분에 증가 하기 시작 하지만 결코 넘어 65% 임계값 영역에 도달에서 가장 느린 증가 보여주었다. 이러한 결과 표시 전단 biofilm 표면 범위에 직접적인 영향을 미쳤다. 높은 전단 사실은 미디어는 biofilm 빨리 증식 할 수 있도록 더 많은 영양소와 박테리아를 제공 biofilm 성장 위한 더 최적의 상태를 가능 하 게 것 같았다.
그림 4: 사용 하 여 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/cm2 24 h 이상 기간 동안 백분율 임계값 영역, 총 biofilm 축적, 거칠기 계수, 및 텍스처 엔트로피. ) 백분율 임계값 영역 (C [%]). 데이터는 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. b) 기간에 24 h 이상 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2 를 사용 하는 시간의 기능으로 총 biofilm 축적 (상대 측정). 검은 라인은 최소 제곱 지 수 모델에 맞는. 데이터는 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. PA01 EGFP의 c) 거칠기 계수 0.2, 0.5, 1.0 다 인/cm의 전단 응력 값을 사용 하 여2 이상 24 h. 데이터 모니터링 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. d) 텍스처 엔트로피 PA01 EGFP의 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/cm2. 의 전단 응력 값을 사용 하 여 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 데이터 (Valquier-플 린, H. Sutlief, 앨 러 배 마, 웬트워스, C.D., 2018). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 b이 이다 그림 4는에 표시 된 결과와 일치. Biofilm 축적 (N[rel]) 시점 이미지에서 GFP 신호는 그 자리에서 살아있는 세포 밀도에 비례 하는 가정에 따라 측정 되었다. 총 상대 측정 biofilm 축적 기간, 24 h 이상 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2 을 사용 하는 시간의 기능으로 증가 하 고 낮은 전단 응력 높은 전단 응력에서 거부 했다 성장 율을 보여 줍니다. 양적 성장 율을 계산할 수 있는 지 수 성장 주는 명확한 기간 있다.
그림 4 c 는 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에 거칠기 계수 (Ra)을 보여 줍니다. 표면 거칠기, 표면 거칠기 계수에 의해 계량 측정 영화의 두께 프로 파일에 분산 합니다. 공식적인 정의
Ti 가 i-번째 두께 측정, T는는 평균 두께 이며 N 은 두께 측정30의 수 있습니다. 이 조사에 설명 된 절차는 살아있는 세포와 관련 된 두께 측정 합니다. 셀의 평면 배열 평균에서 두께의 중요 한 변이 거칠기 계수 1 보다 큰 얻을 것입니다 하는 동안 0의 거칠기 계수를 얻을 것입니다. 성장 속도 영화의 백분율 임계값 범위에 전단 영향와 마찬가지로, biofilms는 시간이 지남에 따라 다른 topographies 전시. 전반적으로, R는는 감소 모든 전단 조건을 나타내는 모든 표면 부드럽게 된 시간이 지남에. 그러나, 0.2 다 인/cm의 낮은 전단에 비해 0.5와 1.0 다 인/c m2 의 높은 전단 설정 결과 매끄러운 표면에 빠른 전단 흐름을 부드럽고 더 심지어 표면과 높은 전단 기여 나타내는 시간이 지남에 1.0 다 인/cm2 0.2 R는는아래에 도달.
부드럽게, 규칙, 또는 표면 거칠기 또한 텍스처 엔트로피 (테)에서 표현할 수 있습니다. 테는 이미지 분석에 2 차원 이미지에서 임의성의 정도 측정 하는 데 사용 하는 속성입니다. 그것의 계산 Haralick 외에의해 정의 된 회색 레벨 동시 발생 매트릭스에 따라., 픽셀 값을 한 위치에서 다른 위치44에서 픽셀 값으로 상관 여부에서 보이는. 상관 관계의 높은 수준의 낮은 엔트로피를 이어질 것입니다. 그림 4 d 묘사 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에서 테. 테 모든 전단 조건 하지만 1.0 다 인/cm 최대 테 (1.0) 보다 900 분 낮은 전단 응력에 도달에서 가장 높은 전단 응력에 대 한 시간이 지남에 따라 증가 합니다. 0.2 다 인/c m2 의 낮은 전단 낮은 테 (0.8) 1000 분 후 최대를 도달 했다. 그러나, 0.5 다 인/c m2 의 중간 전단 응력의 최대 테 (1.2) 높거나 낮은 전단 응력 조건 보다 훨씬 늦게 도달.
거칠기 계수와 테 다른 기능을 측정합니다. 편평한 필름 낮은 거칠기 계수와 낮은 엔트로피 것 동안, 두께에 상당한 변이 가진 영화 높은 거칠기 계수 했 하지만 수 낮은 엔트로피 변화는 무작위 보다는 오히려 정현파 경우. 이 경우에, R는는 감소 증가 전단 스트레스와 시간 동안 테 동향 시간이 지남에 biofilm 형성에 적용 하는 스트레스를 전단에 직접 관련이 있을 수 없습니다.
그림 S1 : 이미지 캡처 제어 소프트웨어 창의. 다중 차원 수집 메뉴 소프트웨어 창이 (맨 위). 제어 모듈 자동 실행 (하단)에 대 한 설정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S2 데이터를 검토 하기 위한 소프트웨어의 캡처 이미지. 관심 분석 도구 메뉴에서 검토 다중 차원 데이터 도구를 사용 하 여 데이터 집합을 선택한 후 응용 프로그램 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
미세 시스템 및 이미지 분석 절차 여기 confocal에서 일반적으로 발견 되는 전체 3 차원 정보를 필요로 하지 않는 형태학 속성을 확인 하는 미세 biofilm 실험 실행에 초점을 맞추고 논의 현미경 학문입니다. 이러한 포함 microcolony 층 범위 (% 범위), 표면 거칠기 거칠기 계수와 텍스처 엔트로피에 의해 측정 되었습니다. 총 상대 biofilm 세포 축적을 추정 하는 방법 또한 로그에 있는 성장 율에서 단계는 산출 될 수 있다 제공 됩니다.
이 방법에는 강조 표시 되어야 합니다 여러 작지만 중요 한 단계가 있습니다. 알코올로 인터페이스를 닦아 한 실험에서 실험에서 실험 하지만 잘 잘에서도가 다른 박테리아의 오염을 방지할 수 있습니다. 못쓰게 하 고 시드 아주 못쓰게 하면 어떤 채널 어떤 방해 없이 채널을 통해 흐르는 매체를 허용 하는 결정을 하기 때문에 중요 하 또는 막힘도 있습니다. 채널도 해서는 안 막힘 없는 기포와 함께 성공적인 실험의 기회를 높이기 위해 프라이 밍 후 (즉, 그들은 지속적으로 가득 해야 미디어) 방해. 시드 단계 박테리아의 종류에 따라 다양 한 수 있습니다 하 고 그래서 셀 첨부 파일에 대 한 최적화 되어야 합니다. 예를 들어 셀 되지 않는 경우 연결을, 표면 수정 뿌리기 전에 미세 접시에 발생 할 수 있습니다 또는 긴 외피 시간 필요할 수 있습니다. 그것은 또한 현미경에-초점 이미지를 올바르게 설정 되어는 이미지 품질을 얻을 수 있습니다 확신 하는 실험을 통해 주기적으로 모니터링 해야 합니다 있는지 확인 하는 중요 한. 초점을 경우, 현미경 및 실험 계속 조정 해야 합니다 수 있습니다. 이미지 수집 시간 동안 마지막 파장 필터와 이미지 인수 사이 발생 하는 대기 시간 동안 하나의 채널에 조명 노출을 피하기 위하여 모든 폐쇄 를 설정 해야 합니다. 몽타주 소프트웨어 매뉴얼 절차를 명시적으로 설명 하지 않았다 때문에 또한, % 표면 범위를 결정 하는 이미지 분석 집에서 설계 되었다. 또한, 이미지 분석에 확장 하 고 표면 거칠기, 등등과 같은 다른 특성을 결정 하기 위하여., 오픈 소스 코드를 파이썬 기반45 집 및 공유 gitHub 저장소에 개발 되었다. 또한 얼마나 많은 데이터를 저장 하 고 외부 하드 드라이브 또는 공유 하는 온라인 데이터 CyVerse46등 필요한 로컬 하드 드라이브에 관리 될 수에 제한이 있습니다.
CDC 원자로 등 물방울 흐름 반응 기34, 기존의 bioreactors 많은 미디어를 필요, 적은 샘플 크기를 제공 하 고 장비 살 균의 높은 금액을 요구. 반면,이 높은 처리량 플랫폼의 장점을 제어 전단, 유량, 수를 포함 하 고 가정 시험관 실험 밀접 하 게 닮은 비보에 조건. 시스템의 여러 액세서리를 포함 하 고 소프트웨어는 세심 한 설정이 필요로 하는 이벤트의 순서에 따라 수행 해야 합니다. 또한, 장비에 대 한 제공 되는 설명서 실험, 그리고 소프트웨어 명령을의 각 단계를 완전히 설명 하지 않습니다 하 고 많은 실수 채널, 성장 또는 첨부 파일의 부족의 막힘을 포함 하 여 실험 하는 동안 발생 하는 결과적으로, 또는 부족 고품질 현미경 이미지 또는 영화. 악기 자체 및 소모품, 미세 번호판 등 상대적으로 비싼 접시 당 200 달러의 가격 태그와 함께 있으며 재사용 되지 않습니다. 따라서, 기술은 강력한 결과 준다, 그러나 그것의 사용에 필요한 전문 기술 상대적으로 높은 고 분야의 전문가에 의해 반복된 훈련이 필요 합니다. 이 보고서는 biofilms 특성 연구를 이러한 bioreactors의 새로운 사용자에 게 가이드를 제공 하 여이 문제를 해결 하려고 합니다.
세포질 분석을 수행할 수 있는 미세 시스템 미생물학, 면역학, 혈액학, 종양학, 및 줄기 세포 연구에서와 같은 다양 한 과학적 modalities에 대 한 상당한 관심을 얻고 있다. 좀 더 구체적으로, 기술 의료 응용 프로그램37,47, 미생물 구두 접착48, 결정의 효과 포함 하 여 관련성이 높은 항목을 설명 하는 많은 간행물에서 결과 녹 농 균 및 황색 포도상구균49,50에 biosurfactants 호스트 병원 체 상호 작용 대장균51, 구 준수52, 및 치료 낭 성 섬유 증53. 의 이 미세 시스템은 매우 다양 한 사실을 감안할 때, 전 세계에 걸쳐 점점 더 많은 시스템을 배포 될 것입니다 예상 된다.
일부 특정 프로토콜 단계를 신중 하 게 고려해 야 합니다. 미디어 dH2O 거품과 막힘 방지 50% 희석 수 있습니다 그러나이 경우에 필요 하지 않았다. OD600 시드에 사용의 특정 값은 무슨 조건 사용의 특정 집합에 대 한 최고의 작품을 보고 성장 실험의 시운전을 사용 하 여 결정 되어야 합니다. 바다 표범 어업 이전 우물에 거품 미세 채널에 거품으로 이어질 수 있습니다 그리고 팝 또는 피 펫 팁 밖으로 빨려에 의해 제거 되어야 한다. 그것은 작은 뱀 채널에서 박테리아를 유지 하는 것이 중요입니다. 시드 프로세스 동안 입력 및 출력 미디어의 동일한 볼륨을 함으로써, 액체 볼륨에서 압력 흐름 흐름은 시스템에서 적용 되는 압력 때문 에서만 제어할 수 있습니다. 교정 거리 설치 하는 동안 회사의 대표에 의해 설정 되어야 합니다. 이러한 설정은 각 카메라에 대 한 특정 있습니다.
이미지에 대 한 가장 대표적인 임계값을 찾을 때 발생 하는 여러 가지 도전이 있다. 최대 임계값 설정 어려운 백그라운드의 지역에 걸쳐 평균 픽셀 강도 일치 하지 않는 경우에 파편 또는 채널의 센터에 단계 위치를 선택 하 여 발생 될 수 있습니다. MM 표준 프로세스를 클릭 하 고 이러한 불일치에 대 한 개정 배경 및 음영 보정 도구를 선택 합니다. 그러나,이 도구는 일반적으로 도움이 사용자 참조 이미지로 사용할 수 있는 뿌리기 전에 채널의 이미지를가지고는 경우만. 또는, 배경/음영 참조 하는 경우 이미지는 사용할 수 없습니다, 사용자는 자신의 판단을 사용 하 여 전체 이미지에 대 한 배경을 포함 하지 않고 가장 셀 영역을 커버 하는 임계값을 설정 해야 합니다. 또는 사각형 영역을 클릭 하 여 불일치, 타원 영역, 또는 추적 지역 영역을 선택 하 여 활성 영역 보다는 전체 선택 영역을 제외 하는 측정을 대표 영역을 선택 이미지 지역 통계 표시 창 ( 분석 도구) 아래에. 대표적인 지역 활용 하는 경우 임계 밝은 필드 이미지 처리를 위한 동일한 지역 해당 FITC 이미지의 측정을 위해 사용 해야 합니다. 그것은 특정 공간 통계 (왼쪽, 위쪽, 너비, 높이, 지역, 둘레) 지역과 관련 된 그 대표적인 같은 지역 찾을 것을 기록 하는 데 도움이 및 해당 FITC 이미지에 측정.
천천히 컴퓨터를 일으키는 원인이 될 하드 드라이브에 데이터의 축적을 방지 하기 위해, 외부 하드 드라이브를 데이터 저장소에 대 한 구입하실 수 있습니다. 데이터 저장 및 촉진 데이터 공유에 대 한 또 다른 옵션은 CyVerse 생물 정보학 플랫폼. Http://www.cyverse.org/로 이동 하 여 CyVerse 시스템에 계정을 만듭니다. 일단 로그인, 검색 환경 시작 다음 "로그에 CyVerse"를 선택 합니다. "데이터"를 선택 하 고 이동 하는 폴더를 당신이. 이미지 스택 로컬 컴퓨터에 있으면 "업로드" 다음 "데스크톱에서 간단한 업로드"를 선택 합니다. 이미지 스택 파일을 찾아서 업로드에 대 한 선택. 파일 또는 폴더 CyVerse 계정이 권한을 부여 받은 경우 공동 작업자와 공유할 수 있습니다. 일반 대 중에 데이터 폴더의 공유 메타 데이터 CyVerse 승인 표준 사용 하 여 각 파일에 대 한 추가 해야 합니다. 이 절차는 하지 논의 여기이이 작업의 범위에 포함 되지 않은 때문에.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작업 가능 하 게 되었다 교부 금에 의해 국립 연구소에서에 대 한 일반 의료 과학 (NIGMS) (5P20GM103427)의 국립 보건원 (NIH) 구성 요소
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Chloride, ACS | VWR | BDH9208-500G | Part of the minimal media composition |
| BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate | Fluxion Biosciences | 910-0047 | |
| BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System | Fluxion Biosciences | BF 1000Z | |
| Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade | VWR | 97061-904 | Part of the minimal media composition |
| Dextrose, Anhydrous, ACS | VWR | BDH9230-500G | Part of the minimal media composition |
| Magnesium Sulfate ACS Grade | VWR | EM-MX0070-1 | Part of the minimal media composition |
| Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade | VWR | BDH9268-500G | Part of the minimal media composition |
| Pseudomonas Aeurginosa GFP | ATCC | 15692GFP | Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study. |
| Sodium Chloride, ACS | VWR | BDH9286-500G | Part of the minimal media composition |
| Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade | VWR | 97061-942 | Part of the minimal media composition |
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