Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Live celle analyse af Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58926
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, *4
1Department of Chemistry, Doane University, 2Department of Biology, Doane University, 3Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Physics and Engineering, Doane University
* These authors contributed equally

Summary

Her, beskriver vi brugen af en højere overførselshastighed mikrofluid bioreaktor kombineret med en fluorescerende mikroskop til analyse af shear stresspåvirkninger på Pseudomonas aeruginosa biofilm udtrykker grøn fluorescerende proteiner, herunder instrument oprette, bestemmelse af biofilm dækning, vækstrate og morfologiske egenskaber.

Abstract

En højere overførselshastighed mikrofluid i vitro bioreaktor kombineret med Fluorescens mikroskopi er blevet brugt til at studere bakterielle biofilm vækst og morfologi, herunder Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Her vil vi beskrive, hvordan systemet kan bruges til at studere vækst kinetik og de morfologiske egenskaber, såsom overfladeruhed og tekstur entropi af P. aeruginosa stamme PA01, der udtrykker en forbedret grøn fluorescerende proteiner (PA01-EGFP ). En detaljeret protokol vil beskrive, hvordan at dyrke og frø PA01-EGFP kulturer, hvordan du indstiller op mikroskop og autorun, og udføre billedanalyse Bestem vækstrate og morfologiske egenskaber ved hjælp af en række shear kræfter, der er kontrolleret af den mikrofluid enhed. Denne artikel vil give en detaljeret beskrivelse af en teknik til at forbedre undersøgelse af PA01-EGFP biofilm, der i sidste ende kan anvendes mod andre stammer af bakterier, svampe eller alger biofilm ved hjælp af mikrofluid platform.

Introduction

Her vil vi vise en metode til at måle effekten af shear stress på dannelsen af fluorescerende Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilm ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid system.

Biofilm er Fællesskaber af mikroorganismer, såsom bakterier, arrangeret af en ekstracellulære polymert stof, der er knyttet til en støtte, og findes typisk på grænsefladen mellem en væske og en solid overflade1. Disse biofilm samfund kan være gavnligt for miljøet, såsom forbedre vandkvaliteten i vandforsyning linjer og bioremediering af genstridige forbindelser2,3. Biofilm kan dog også være yderst skadelige for menneskers sundhed med uønskede konsekvenser. For eksempel, er medicinsk udstyr, såsom hofte og knæ implantater, en type af overfladen hvor biofilm ophobning har været en udfordring og forårsager alvorlige medicinske komplikationer4,5. Biofilm kan også indtaste naturlige vandsystemer, floder og søer, og infiltrere vandforsyning rør fører til bakterier forurening i drikkevand resulterer i infektioner6,7,8. Biofilm dannet i marine miljøer overholder skibe og andre menneskeskabte substrater og præsentere store økonomiske og miljømæssige problemer som øget friktion fører til at øge brændstof forbrug9,10. Antimikrobiel belægninger, såsom Tributyltin, er blevet udviklet for at forebygge disse problemer men er giftigt for marine liv11.

P. aeruginosa er en Gram-negative bakterien med høje blomstrende kapaciteter i en lang række miljø-og nutrimental12. P. aeruginosa er en almindelig årsag til Fællesskabet og hospitalserhvervede infektioner og fundet at være nært knyttet til skader, såsom alvorlige forbrændinger og immunkompromitterede værter, som i cystisk fibrose (CF)5,12, 13, AIDS og kræft patienter5,13. Dannelsen af P. aeruginosa biofilm har været mest alvorligt tilsluttet CF, hvor kroniske lungeinfektioner er den førende dødsårsag for denne sygdom5.

En referencestamme af P. aeruginosa, PA01, der bruges i denne rapport og er genetisk modificeret til at udtrykke en forbedret grøn fluorescerende proteiner (PA-EGFP). EGFP repræsenterer en mutant form for normal god landbrugspraksis med større fluorescens-egenskaber, som giver mulighed for i situ biofilm analyse ved hjælp af Fluorescens mikroskopi14,15,16. Denne type af fluorescens analyse er en fordel for studier af biofilm fordi normal god landbrugspraksis ikke griber væsentligt ind i cellevækst og funktion17. For eksempel, voksede Escherichia coli celler, der var mærket med normal god landbrugspraksis godt og løbende uden at have lidt nogen toksiske virkninger i forhold til kontrol bakterier17. Andre rapporter underbygge denne påstand18,19,20. Desuden brug af en fluorescerende reporter som EGFP er hurtig og enkel, men kun levende celler vil blive målt, fordi døde celler hurtigt ophører med at fluorescerer21.

Biofilm kan vokse under forskellige miljøforhold, herunder dem med forskellige strømningshastigheder. For eksempel, kan film vokse i høj shear stress, såsom i floder, hvor høj vand flow betingelser føre til en større mikrobiel diversitet22. Contrarily, stillestående vand i damme eller orale biofilm opleve en meget lavere shear kraft23. Ud over strømningshastighed, der er andre faktorer, der påvirker biofilm vedhæftning, herunder overfladeruhed og hydrophobicity, media sammensætning, og selv bakterielle cellens overflade1,4,7, 24. betingelser kan også forårsage variation i den rumlige struktur eller morfologi af en biofilm. Dette omfatter miljøforhold som shear stress udøves af en bevægende væske eller forløb i næringsstoftilgængelighed og biologiske faktorer som arterne, der findes i systemet, motilitet af celler og de særlige proteiner til stede i den ekstracellulære polymert stof25,26,27. På nogle vilkår, bliver biofilm græsplæne-lignende (glat og flad), mens andre betingelser biofilm vil være ru, bløde, eller endda svamp-lignende28. Mens den kvalitative forskel mellem biofilm græsplæner og champignon strukturer kan ses tydeligt i mikroskopiske billeder, kræver forstå forholdet mellem film struktur og biologiske processer inden for filmen en systematisk og kvantitative metoder til at beskrive morfologi. Morfologiske egenskaber foreslår undersøgelse af forskere omfatter porøsitet, fraktal dimension, diffusional længde, microcolony område på undergrundens, microcolony volumen, ruhed koefficient og tekstur entropi29,30 .

Bioreaktorer bruges i studier af biofilm for at efterligne virkelige liv betingelser31. Drop flow reaktorer (DFR) repræsenterer en lav-shear miljø hvor næringsstoffer i medier løber langsomt på tværs af celler, der knyttet til en overflade over tid til at danne en biofilm med en høj celle tæthed32. CDC reaktorer er bioreaktorer, at skaber en høj shear stress væske miljø ved kontrol af en omrøring stang, der er konstant roterer inden for medierne fyldt tank33. Disse typer af bioreaktorer er enkel at sætte op, men de er begrænset på grund af den relativt lave stikprøvestørrelse, det store forbrug af medier, store mængder af biologisk affald fra media drop strømme spænder fra 125 µL/minut for drop flow reaktorer til mere end 1 mL/min. til CDC reaktorer, og nødvendigheden af at autoklave store mængder af glasvarer og affald media34. Biofilm dyrker ikke jævnt over hele overfladen i et drop flow reaktoren fordi den lave vrid af medier forårsager trailing langs de større konglomerater af P. aeruginosa bakterier derfor, biofilm vækst er ikke meget glat og ujævn prøverne må ikke være let analyseres med Fluorescens mikroskopi35,36 .

Nogle fælles bioreaktor begrænsninger er overvundet ved hjælp af en medium-overførselshastighed mikrofluid bioreaktor, hvor kun milliliter af medier er påkrævet, og reaktionen pladerne er små og let engangs efter autoklavering37. Desuden, afhængigt af antallet af brønde, mange replications kan udføres i bare én reaktor køre, som giver tilstrækkelig mængde af data til meningsfulde statistisk analyse. I figur 1, er de forskellige komponenter i mikrofluid-mikroskopi system, der giver mulighed for kontrollerede forhold, herunder temperatur og flow sats38,39,40, vist. Bioreaktor er kombineret med Fluorescens mikroskopi til at visualisere fluorescens af koden EGFP i PA01 under anvendes lavt gennem høj shear forhold, der vil efterligne mere realistiske scenarier, der er stødt på i miljøet eller på det biomedicinske område.

Figure 1
Figur 1 : Individuelle komponenter af ordningen med mikrofluid. De enkelte komponenter er listet fra venstre mod højre: 1. CCD kamera, 2. høje opløsning inverteret mikroskop med automatiserede fase, automatiseret fluorescens-modulet og autofokus modulet, 3. plade fase, 4: Imaging system Interface, 5: manuel mikroskop fase Kontrol, 6: Vapor fælde, 7: Imaging system Controller (herunder temperatur Controller), 8: Hardware controllere, 9: fluorescens Controller, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: ekstern Skrap Drive nemlig billede opbevaring, 12: PC arbejdsstation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Et uddrag af mikrofluid pladen er vist i figur 2. De mest almindeligt anvendte plader består af 48 brønde. Et eksperiment kræver én indgang og én outlet brønde, ialt 2 brønde. Dette giver mulighed for 24 samtidige eksperimenter, der kan udføres med forskellige eksperimentelle betingelser, såsom bakteriestammer, antimikrobiel behandlinger og medier varierede fra kanal til kanal og kontrolleret shear flow for hver kolonne i seks kanaler. Den eksperimentelle temperatur styres også med én temperaturindstilling i hele pladen. Mikrofluid kanalerne viser, at hver kanal har en serpentine region at give tilstrækkelig modtryk og kontrolleret shear.

Figure 2
Figur 2: visualisering af de mikrofluid kanaler og visningsvinduet. To indsugnings- og udstødningsporte brønde med de mikrofluid kanaler forbinder dem er fremhævet med rødt og grønt farvestoffer. Farvestoffet synliggør en serpentine region i hver kanal, der skaber tilstrækkeligt modtryk og kontrolleret shear under flydende flow. Hver visning kanal (i den røde cirkel) kan være afbildet med ønskede bølgelængder. Vist er lysfelt (øverst) og fluorescerende (nederst) mikroskopi billeder af en enkelt kanal med en PA01-EGFP biofilm ved hjælp af en 20 X mål. Skalalinjen = 80 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

En trin for trin guide er forudsat at brugerne af mikrofluid bioreaktorer, der er kombineret med Fluorescens mikroskopi til at udføre roman biofilm eksperimenter ved hjælp af forskellige shear miljøer. Denne metode vil give mulighed for udvidelse af eksperimenter, der involverer andre mikroorganismer end bakterier, svampe og alger, der har medicinsk og miljømæssige programmer41,42,43. Den detaljerede fremgangsmåde beskriver, hvordan kultur PA01-EGFP, podes en 48-godt plade og konfigurere mikrofluid enheden og softwaren, oprette fluorescerende mikroskop og demonstrere software analyse for at få biofilm dækning, vækst, og morfologiske egenskaber såsom overfladeruhed.

Protocol

1. medier forberedelse

  1. Forberede minimal medier (MM) med 0,25% glukose. For at gøre 1 L mm med 0,25% glukose, tilsættes 200 mL sterilt M9 saltopløsning, 2 mL sterilt 1 M MgSO4, 100 µL i sterile 1 M CaCl2og 12,5 mL sterilt 20% (w/v) glukose til vand (dH2O) på en endelige mængden af 1 L.
  2. Overføre krævede medier til en steril flaske med steril teknik. Forberede det beløb, der kræves afhængigt af antallet af kanaler bliver brugt. Typisk, hver kanal kræver 200 µL til grunding, 300 µL til såning og 1300 µL til 24 h eksperiment.
  3. Placere flasken i en inkubator eller vand bad sat på den eksperimentelle temperatur. Medierne bør være på eksperiment temperatur før brugen for at undgå boblerne danner i microchannels.

2. udarbejdelse af en Overnight og eksperimenterende kultur af PA01-EGFP.

  1. Placer 15 mL af eksperimentelle medier i en steril sidearm kolbe og podes med én eller to kolonier fra en agar plade stribet med PA01-EGFP. Udvid kultur for 12-16 h på en inkubator/shaker bord på 37 ° C og 180-220 rpm.
  2. Måle OD600 overnight kultur. Når OD600 er større end 0,80, fortyndes den overnight kultur til den endelige OD af 0,8 bruger friske MM. sted den eksperimenterende kultur i en inkubator eller vandbad ved 37 ° C indtil brug for såning mikrofluid kanaler. Kontrollere OD600 igen umiddelbart før såning for at sikre, at det ikke har ændret sig væsentligt fra målet OD600, 0,8 i dette tilfælde.

3. udstyr start

  1. Konfigurere systemet station ifølge brugervejledning, svarende til opsætning i figur 1. For at undgå en fejl i tilslutning af instrumentet til softwaren, tænde instrumentet i følgende rækkefølge:
    PC arbejdsstation
    Fluorescens-modulet. Sørg for, at fluorescens lukkeren er på (blåt lys af udløserknappen på)
    Hardware controllere
    Imaging system Controller (Se Tabel af materialer)
    CCD kamera
    Imaging Station (mikroskop)
    Bemærk: Temperatur af opvarmet plade bør justeres til den ønskede temperatur, eksperimenterende.
  2. Start programmet kontrol og Indtast plade nummeret på etiketten på den side af pladen.
    Bemærk: Efter kontrol program starter der vil være to separate programvinduer, for den software, der styrer mikroskop/billedbehandling software og for den kontrolmodul, der styrer pumpen og grænsefladen godt-plade. Dette er vist i Figur S1, hvor menuen "Multi Dimensional erhvervelse" er åben på toppen og kontrolmodulet er indstillet til en autorun på bunden.

4. priming og såning mikrofluid plade

Bemærk: Priming, såning, bakteriel vedhæftet fil og vækst er illustreret i figur 3.

  1. Fjerne 48-godt mikrofluid pladen fra emballage og sørg for at berøre glasoverfladen i bunden af pladen. Rene glas dias i bunden af pladen godt med en linse væv, en fnugfri klud eller en lav-lint tørre.
  2. For at prime mikrofluid kanaler, afpipetteres 200 µL af 37 ° C MM i output godt, være omhyggelig med at undgå boblerne. Pladen anbringes i stadiet plade og tørre interface med ethanol, giver mulighed for at tørre, før forsegling det på plade scenen.
  3. I Manuel tilstand på den kontrolmodul, skal du indstille væske som LB ved 37 ° C og Max Shear på 5,00 dyne/cm2. Klik på output brøndene for at aktivere flow fra output til input, priming af kanaler. Efter 5 min grunding, pause flow til at forberede sig til såning. Forsigtigt fjerne pladen fra scenen og tilsæt resterende medier fra output, men ikke at fjerne nogen af medier fra den inderste cirkel, der fører til mikrofluid kanalerne.
  4. For at frø de eksperimentelle kanaler, først afpipetteres 300 µL af MM ind i input godt efterfulgt af pipettering 300 µL af bakteriekulturen til output godt ind i output godt. Læg pladen tilbage i plade scenen og sørg for at tørre grænsefladen før du placerer det på tallerkenen.
  5. Kontrolmodulet, fokusere på en enkelt kanal ved hjælp af de levende kamera foder efter at placere plade scenen på mikroskop-scenen. Mens visuelt overvågning af den levende foder, genoptage flow på 1,00-2,00 dyne/cm2 for ca 2-4 s at tillade celler til at indtaste den eksperimentelle kanal men ikke i de serpentine kanaler. Forlade pladen på stadiet temperatur kontrolleret for 1 h til celle vedhæftet fil. Under 1 h inkubation, kan kontrolmodul og Montage softwaren være sat op for autorun (trin 5).
    Bemærk: Mængden af tid til såning varierer med medier og organisme, så det bør overvåges nøje af den levende foder indtil optimeret og bruges som en generel tidsramme. Såning i hele pladen kan variere, som ville kræve mere tid anvendt flow til visse kolonner af kanaler for komplet såning.
  6. Efter perioden vedhæftet fil, forsigtigt fjerne pladen fra scenen og afpipetteres bakterier fra output først at undgå at forstyrre kanalen. Med en ny pipette tip, skal du fjerne medier fra input brøndene.

Figure 3
Figur 3 : Eksperimenterende oversigt over priming, såning og fastgørelse af PA01-EGFP i mikrofluid kanalerne. Priming, såning og vedhæftet fil er skitseret. Det første trin i priming kræver friske medier introduceret til output. De seeding indebærer lige mængder af medier og bakteriel kultur i input og output wells, henholdsvis. Kultur bør ikke passere visning segment af den eksperimentelle kanal (rød linje) til at undgå tilstopning af serpentine kanaler. Efter Inkubationstiden er overstået, flyder friske medier løbende fra input, til visning kammer og til stikkontakten. Dette indleder vedhæftet fil og vækst af bakterielle biofilm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

5. indstilling af Software

  1. Softwaren, Åbn "Flere dimensionelle erhvervelse" for at kontrollere mikroskop billede erhvervelse. Under menuen "Main" Vælg "Timelapse", "Flere fase positioner" og "Flere bølgelængder" (Figur S1A).
    1. Opsætning af gemme indstillinger, skabe et simpelt Navn, og sørg for, at Increment basisnavn hvis filen findes er markeret. Klik på Vælg mappe for at vælge den mappe, hvor alle filer vil blive gemt. Omfatte væsentlige detaljer af eksperimentet i beskrivelsen.
    2. Under fanen Timelapse justere varigheden af den eksperimentelle til 24 h. For at kontrollere, hvor ofte billeder er erhvervet, angive Tidsintervallet , så billeder er erhvervet hvert 5 min hele eksperimentet. Antallet af tiden point justerer automatisk med de angivne parametre.
    3. Sæt stadie positioner ved hjælp af de levende kamera foder i lysfelt mikroskop, giver mulighed for korrekt placering og fokus. Start med 10 X mål, fokus på midten af kanalen, ligger over eller under kanalnumre indgraveret på pladen. Skifte til 20 X målet, at finde den optimale visningsområde og brændplanet inden for kanalen. Føje positionen til listen eller erstatte den forudindstillede kanal holdning med de nye indstillinger.
    4. Angiv antallet af bølgelængder til 3 under menuen bølgelængder . For bølgelængde 1 (W1), Vælg FITC 100% CAM med en 10 ms eksponeringstid. For bølgelængde 2 (W2), Vælg Brightfield 50% CAM 50% VIS med en minimal eksponeringstid på 3 ms. For bølgelængde 3 (W3), som Alle lukket filter så ingen lys forbliver på den sidste kanal mellem erhvervelse gange.
  2. Når du opretter kontrolmodulet, skal sikre, at manualen køre er blevet stoppet.
    1. Angiv en ny protokol for 24 timer af tid, varighed, flyder i de fremadgående retning på den ønskede shear rate i menuen Rediger Autorun under fanen Protokol opsætning . Shear rate er varieret for at studere effekten af biofilm vækst med shear rate. Klik på Tilføj og Gem som protokol.
    2. Opret en ny sekvens ved at vælge LB@37degrees som standard væsken for alle kanaler under fanen Rækkefølge Setup . Under Trin Iteration 1, for kanalerne 1-12, Vælg protokol med de ønskede shear sats og aktiverer alle kanaler. For kanaler 13-24, Vælg protokol med den anden ønskede shear sats og aktiverer alle kanaler. Vælg Anvend og Gem som sekvensen.
    3. Vælg den gemte sekvens skal bruges til autorun i menuen Autorun .

6. timet Biofilm vækst eksperiment Setup

  1. Der afpipetteres højst 1.300 µL sterilt mm i input godt af mikrofluid pladen. Placere plade tilbage på pladen scenen og tørre interface med ethanol, giver ethanol til at tørre helt, før forsegling pladen.
  2. Placere pladen fase på mikroskop-scenen, og vær sikker på at netværksprotokoller og sekvens(er) er indstillet korrekt. Vælg Start at starte autorun hurtigt efterfulgt af at klikke erhverve for at starte mikroskop billedsamling.
  3. Justere fokus og placering af fase positioner mellem billede kundskaber. Vælg Pause , og bruge tilstanden live billede i lysfelt bølgelængde, Vælg Gå til at se hver fase positioner. Angiv nye indstillinger ved at vælge Indstil til aktuel. Klik på Genoptag før den næste planlagte erhvervelse.

7. gennemgå og analysere billedsekvenser efter timet Biofilm vækst eksperiment

  1. For at gennemse hver kanal efter 24 h autorun, i software, åbne Anmeld flerdimensionelle Data, placeret under Analyseværktøjer. Klik på Vælg Base fil | Vælg bibliotek til at navigere til mappen med billedsekvenser til eksperiment af interesse. Listen over datasæt i den mappe, der vises, skal du vælge navnet base af data af interesse.
  2. Når data af interesse er valgt, skal du klikke på Vis for at gennemse disse data. Vælg en bølgelængde at gennemgå dataene under bølgelængde vindue (Figur S2).
  3. Anmeldelse billedsekvens for hver kanal ved at vælge kanalnummeret under Scenen holdning og ved hjælp af video kontroller til at analysere data for 289 tiden point (antages det, at billeder opnås hvert 5 min over en 24 h tidsramme). Læg mærke til brugbar vækstdata.
    Bemærk: I hver kanal, holde øje med udviklingen af luftbobler og træsko, der vil forstyrre biofilm væksten inden for den kanal, der påvirker dataene. Men hvis disse opstå senere i Kør, data, før disse omstændigheder kan være fundet nyttige.
  4. Efter gennemgang og vælge de ønskede data til analyse, Opret stakke af billeder for hver kanal. Under menuen fil , Vælg åbne særlige | Bygge Stack | Nummererede navne. I vinduet Bygge stak Vælg knappen Vælg første billede og vælge det første billede for stakken i mappe; Vælg knappen Vælg sidste billede og derefter vælge filen svarende til det sidste billede i stakken. Klik på OK for at åbne stakken med alle billederne af kanalen i kronologisk rækkefølge. Stakke kan gemmes under menuen filer Gem som som tiff-filer.
    Bemærk: Undlad at oprette stakke med tommelfinger billeder. Disse filer er ikke meget nyttigt og kan blive slettet for at spare plads på harddisken. Også, billedfiler er gemt som følgende:

    BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.

    For eksempel, er 07062018_W1FITC 100_s12_t112 for kanal 12, tidspunkt 112, billedet i første bølgelængde-FITC 100% Kameradata med navn "07062018".
  5. Endelig, Vælg Gem som fil henlægge-nede menu hen til opspare sekvensen som en tiff stak. Stakke kan også belagt og gemmes som en film. Dette er behandlet i trin 9.
  6. Før kvantificere % overfladedækning, kalibrere billede afstande. Under Analyseværktøjer, klik på Kalibrer afstande. Vælg den passende kalibrering måling og klik på Anvend på alle åbne billeder.
  7. Mens stakken er på det første billede af sekvensen, skal du klikke på knappen tærskel . Bruge Auto tærskel for lys objekter til tærskel for fluorescerende signal (FITC bølgelængde) og Auto tærskel for mørke objekter til tærskel i lysfelt. Justere tærsklen til den dækning, der repræsenterer dækning af billedet.
    1. For fluorescerende tærskler, udnytte en kanal med ikke-fluorescerende celler at etablere nogen baggrund signal og sæt værdien minimumstærskel for at udelukke signal opdaget i kanaler indeholdende disse ikke-fluorescerende celler at sikre signal måling gør ikke overvurdere området af fluorescens. Dette kan være forskellige fra køre til at køre så er det en god idé at bruge mindst én, hvis ikke mere, kanal (er) for ikke-fluorescerende objekter.
    2. Lysfelt tærskler, hvis alle celler ikke er omfattet af orange tærskel signaturen, justere den maksimale grænseværdi enten via værktøjslinjen glidende eller ved hjælp af Tærskel billede (findes under Analyseværktøjer), så alle celler er dækket men nogen baggrund er udelukket.
      Bemærk: Mens disse tærskelværdier ideelt ville blive brugt til alle billeder i en stak og for alle kanaler, tærskelværdier, der vælges for ét billede/kanal ikke være relevant for andre billeder eller kanaler, derfor brugeren muligvis justere området tærskel med jævne mellemrum. Derfor er det en god idé at altid optage maksimalt og minimumstærskel værdier bruges bør data skal revideres senere.
  8. For at kvantificere dækning under Analyseværktøjer, skal du klikke på Vis Region statistik. Sørg for at Bruge tærskel er markeret, Hele billedet er valgt, og kontroller under Indhentet Data, de ønskede målinger/indstillinger er markeret (tærskel område, gennemsnit, standardafvigelse, min, max og %-tærsklen område). Klik på Åbn Log og sørg for DDE-fil er valgt før du klikker på OK. Vælg Microsoft Excel , og klik på OK. I det regneark, der vil åbne, klik på Log Data til automatisk at registrere målinger af billedet ved at blive analyseret.
  9. Forlader dette regneark åben, bruge det samme ark til at indsamle alle billede analyse data i en enkelt stak. I stakken, gå til den fjerde billede og tærsklen til de optimale indstillinger. Klik på Log Data i skærmbilledet Vis Region statistikker og værdierne, der er logget ind i regnearket. Gentag dette for analyse af billeder hvert 15 min.

8. andre analyse herunder morfologi og overfladen dækning foranstaltning ved hjælp af Python scripts fra Biofilm morfologi Suite

  1. Installere en fordeling af Python 3.6, der omfatter videnskabelige standardmoduler ved hjælp af en standard videnskabelige Python distribution som Anaconda, tilgængelig på https://www.anaconda.com/download.
  2. Få Biofilm morfologi Suite fra GitHub i en browser ved at navigere til https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, så vælg klon eller download (grøn knap) og vælg Download Zip. Unzip fil og flytte mapperne kode til en arbejdsmappe.
  3. Måle procent thresholded dækning ved at kopiere billedstak til mappen "dækning". Bruge et terminalvindue til at navigere til denne mappe og derefter køre scriptet med kommandoen

    python bfCoverage.py tiffStackName.tif

    fra kommandolinjen interface, hvor tiffStackName.tif er navnet på den fil, der indeholder tiff stakken af billeder. En tekstfil, der indeholder dækning målinger på hvert tidspunkt bliver lavet med navn tiffStackName.txt og en grafikfil med et plot af dækning, som en funktion af tiden vil blive oprettet med navnet tiffStackName.png.
  4. Brug samme fremgangsmåde har angivet i trin 8.3 for at måle de andre morfologiske karakteristika: biofilm ophobning, ruhed koefficient og tekstur entropi. Bruge scriptet bfAcc.py for ophobning måling, scriptet roughCoef.py for ruhed koefficient måling og scriptet TEvsTime.py for tekstur entropi måling.

9. andre Software-applikationer - overlejringer og film

  1. Hvis der bruges flere bølgelængder, oprette overlay stakke herunder disse bølgelængder. Åbne alle stakke af interesse og kalibrere afstanden, som gjort i skridt 7,6.
    1. Under Analyseværktøjer, skal du vælge Overlay billeder. Angive kilder som stakke af interesse. Klik på regnbue cirkel i FITC stakken, og vælg grønne farve filter skal tilføjes for at fremhæve denne bølgelængde.
    2. Bruge bal justere overlejringen, så FITC stakken fremgår i billederne. Efter at have foretaget alle justeringer, Vælg Alle fly for begge stakke og klik på Anvend. Gem overlejringer på samme måde som stakke beskrevet taktfast 7.5 eller en film, der er beskrevet i trin 9.2.
  2. Hvis du vil gemme stakke eller overlejringer som en timelapse film under MM Standard og stak, skal du klikke på Gøre filmen. Vælg kilden som stakken eller overlay, der ønskes. Klik på Gem og gemme som en Microsoft Video 1 med en kvalitet, der ligger mellem 70-80.

Representative Results

Figur 4 en viser den procentvise thresholded område over tid fra en 24 h køre på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Biofilm dækning eller procent tærskel areal (C [%]) var anderledes for alle tre shear indstillinger. Biofilm dækning var hurtigst på 1,0 dyne/cm2 shear, hvor området tærskel steg fra 2-5% til 100% efter 200 min vækst og nåede en stationær fase efter 400 min. På 0,5 dyne/cm2, biofilm dækning var forsinket og begyndte at stige på 400 min. at nå 100% dækning efter 800 min. Den laveste shear på 0,2 dyne/cm2 tydeligt den langsomste stigning i biofilm dækning, hvor procent dækning begyndte at stige på 500 min men aldrig nået ud over området 65%-tærsklen. Disse resultater viste shear havde en direkte indflydelse i biofilm overfladedækning. Den højere shear syntes at være en mere optimal tilstand for biofilm vækst, muligvis skyldes, at medierne leveret bakterier med flere næringsstoffer, så biofilm kan formere sig hurtigere.

Figure 4
Figur 4: procent tærskel område, samlede biofilm ophobning, ruhed koefficient, og tekstur entropi. a) procent tærskel område (C [%]) over tid ved hjælp af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. b) samlet biofilm ophobning (relative foranstaltning) som en funktion af tid ved hjælp af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode. De sorte streger er mindste kvadraters passer til en eksponentiel model. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. c) ruhed koefficient på PA01-EGFP ved hjælp af shear stress værdier af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 overvåges over 24 h. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. d) tekstur entropi af PA01-EGFP ved hjælp af shear stress værdier af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 b er i overensstemmelse med resultaterne vist i fig. 4en. Biofilm ophobning (N[rel]) blev målt baseret på den antagelse, normal god landbrugspraksis signal på et punkt i et billede er proportional med den levende celle tæthed på denne holdning. Det viser at samlede relative måling biofilm akkumulering øges som funktion af tiden bruger 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode, og væksten faldt fra højeste shear stress til laveste shear stress. Der er en klar periode giver eksponentiel vækst som en kvantitativ vækst kan beregnes.

Figur 4 c viser ruhed koefficienten (Ren) på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Overfladeruhed, kvantificeres ved ruhed koefficient, måler variansen i profilen tykkelse af filmen. Den formelle definition er

Equation 1

hvor T,jeg er den jeg-th tykkelse måling, Tet er den gennemsnitlige tykkelse, og N er antallet af tykkelse måling30. Fremgangsmà ¥ den i denne undersøgelse måler tykkelsen forbundet med levende celler. En flad arrangement af celler vil give en ruhed koefficient på nul, mens betydelige variationer i tykkelse fra gennemsnittet vil give en ruhed koefficient større end 1. Svarende til shear indflydelsen på væksten og procent tærskel dækning af filmen, biofilm udstillet forskellige topografi over tid. Samlet set Ren faldt over tid for alle shear betingelser angiver, at alle overflader blev glattere. Men i forhold til den laveste shear 0.2 dyne/cm, højere shear indstillingerne for 0,5 og 1,0 dyne/cm2 resulterede i en glattere overflade over tid viser, at en hurtigere shear flow bidraget til glattere og mere jævn overflade, og den højeste shear af 1,0 dyne/cm2 til under 0,2 Ren.

Glathed, regelmæssighed eller råhed af en overflade kan også udtrykkes i tekstur entropi (TE). TE er en egenskab, der bruges i billedanalyse til at måle graden af tilfældighed i en to-dimensionelle billede. Beregningen er baseret på matrixen grå niveau samtidig forekomst defineret af Haralick mfl., som ser på om pixelværdier på ét sted er korreleret med pixelværdier på en anden placering44. En høj grad af korrelation vil føre til lav entropi. Figur 4 d skildrer TE på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. VÆVSCENTRET steget over tid for alle shear betingelser, men den højeste shear stress på 1,0 dyne/cm nåede den maksimale TE (1,0) tidligere end de lavere shear understreger på 900 min. Den laveste shear 0.2 dyne/cm2 havde den laveste TE (0,8) at nå sin maksimale efter 1.000 min. Men den mellemliggende shear stress af 0,5 dyne/cm2 nåede sin maksimale TE (1,2) meget senere end højt eller lavt shear stress betingelserne.

Ruhed koefficient og TE måle forskellige funktioner. Mens en flad film ville have en lav ruhed koefficient og lav entropi, en film med betydelig variation i tykkelse ville have en høj ruhed koefficient men kunne stadig lav entropi, hvis variationen er sinusformet snarere end tilfældige. I dette tilfælde Ren faldt med øget shear stress og tid mens TE tendenser ikke kan være direkte relateret til shear stress påføres Biofilmdannelse over tid.

Supplemental Figure 1
Figur S1 : Image capture control software Windows. Software vindue med Multi Dimensional erhvervelse menuen Åbn (øverst). Kontrolmodul til en AutoRun (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 2
Figur S2 Image capture software til at revidere data. Programvinduet efter at vælge Data, der af interesse ved hjælp af værktøjet Anmeldelse Multi Dimensional Data fra menuen Værktøjer til analyse . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Proceduren mikrofluid system og image analysis drøftet her fokuserer på udførelsen af mikrofluid biofilm eksperimenter til at bestemme morfologiske egenskaber, der ikke kræver det fuldt tre-dimensionelle oplysninger typisk findes fra Konfokal mikroskop undersøgelser. Disse omfattede microcolony undergrundens dækning (procent dækning), overfladeruhed målt ved ruhed koefficient og tekstur entropi. En metode til at anslå samlede relative biofilm celle ophobning præsenteres også fra hvilke vækstrater i log fase kan beregnes.

Der er flere små men vigtige skridt, der bør fremhæves i denne metode. Aftørring interface med alkohol hjælper med at undgå forurening af andre bakterier i at gå fra forsøg til eksperiment, men også fra godt til godt i et eksperiment. Priming og såning er også meget vigtigt, fordi priming tillader bruger hen til afgøre hvilke kanaler er at lade medierne til at flyde gennem kanaler uden nogen forstyrrelser eller tilstopning. Kanaler bør heller ikke være forstyrret (dvs. de skal være konstant fuld af medier) efter grunding for at øge chancerne for en vellykket eksperiment med ingen luftbobler eller tilstopning. Trinnet seeding kan varieres efter typen af bakterier og så skal optimeres for celle vedhæftet fil. For eksempel, hvis celler ikke synes at vedhæfte, overflade ændringer kan have at forekomme på mikrofluid pladen inden såning eller længere inkubationer gange kan være nødvendigt. Det er også afgørende for at sikre at mikroskopet er korrekt sat op til at få en i-fokus billede og bør overvåges periodisk under hele forsøget at forsikre, at kvalitetsbilleder er opnået. Hvis fokus er slukket, mikroskopet kan og bør reguleres som forsøget fortsætter. Under image erhvervelse tid, skal den sidste bølgelængde indstilles til Alle lukket for at undgå eksponering af filtre og belysning til kun én kanal under den ventetid, der opstår mellem billede erhvervelser. Også, billedanalyse, der bestemmer % overfladedækning blev designet i huset fordi Montage software manual ikke udtrykkeligt beskriver proceduren. Desuden, for at udvide billedanalyse og andre karakteristiske træk som overfladeruhed osv., åben kilde Python-baseret kode45 blev udviklet i hus og delt på gitHub opbevaringssted. Der er også begrænsninger på hvor meget data kan lagres og styres på den lokale harddisk, så en ekstern skrap drive eller online datadeling er nødvendig som CyVerse46.

Konventionelle bioreaktorer, såsom CDC reaktor og drop flow reaktor34kræver en masse medier, giver færre stikprøvestørrelser og kræver en stor mængde af sterilisering af udstyr. I modsætning, fordelene ved denne højere overførselshastighed platform omfatte evne hen til kontrol shear, strømningshastigheder, og den antagelse, at in vitro forsøg tæt ligner i vivo betingelser. Ulemper ved systemet omfatter flere tilbehør og software, der kræver en omhyggelig opsætning, der skal udføres i den korrekte rækkefølge af begivenheder. Desuden, den håndbog, der er fastsat for udstyret, der forklarer ikke fuldt hvert trin af eksperimenterne, og kommandoerne software, og dermed mange fejl opstår under eksperimenter, herunder tilstopning af kanaler, manglende vækst eller vedhæftet fil, eller den manglende høj kvalitet mikroskopi billeder eller film. Apparatet og hjælpematerialer, som mikrofluid pladerne, er også forholdsvis dyrt med en pris på over $200 per plade og kan ikke genbruges. Således, mens teknikken giver stærke resultater, den tekniske ekspertise, der kræves for dens anvendelse er forholdsvis høj og kræver gentagne uddannelse af eksperter på området. Denne betænkning forsøger at løse dette problem ved at give en guide til nye brugere af disse bioreaktorer for at studere biofilm karakteristika.

Mikrofluid system, som er i stand til at udføre cellulære analyse, har fået betydelig opmærksomhed til forskellige videnskabelige retningslinjer, som i mikrobiologi, immunologi, hæmatologi, onkologi og stamcelleforskning. Mere specifikt har teknologien resulteret i mange publikationer beskriver emner, der er særdeles relevante for medicinske anvendelser37,47, herunder mikrobielle mundtlige vedhæftning48, bestemmelse af virkningerne af biosurfactants på Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus49,50, vært patogen interaktioner i E. coli51, Streptococcus overholdelse52og behandling af cystisk fibrose53. I betragtning af at dette mikrofluid system er meget alsidig, forventes det, at flere og flere systemer bliver fordelt i hele verden.

Nogle specifikke protokol skridt bør overvejes nøje. Medierne kan blive udvandet til 50% med dH2O for at forhindre bobler og tilstopning men var ikke påkrævet i dette tilfælde. Den specifikke værdi af OD600 bruges til såning skal bestemmes ved hjælp af trial kørsler af en vækst eksperiment for at se, hvad der fungerer bedst for den bestemt sæt betingelser anvendes. Bobler i brøndene inden forsegling kan føre til bobler i mikrofluid kanalerne og bør fjernes ved enten affyret eller suget ud med en pipette spids. Det er vigtigt at holde bakterier ud af de lille serpentine kanaler. Ved at have lige store mængder af medier i input og output under seeding-processen, vil flow på grund af pres fra den flydende volumen blive kontrolleret så flow er kun på grund af den anvendte pres fra systemet. Kalibrering afstande bør oprettes under installationen af Virksomhedsrepræsentant. Disse indstillinger er specifikke for hvert kamera.

Der er flere udfordringer, der opstår, når at finde de mest repræsentative tærskel for et billede. Indstilling af maksimale grænseværdier kan være vanskeligt, hvis den gennemsnitlige pixel intensitet på tværs af regioner af baggrunden ikke er konsistente forårsaget ved enten at vælge en fase holdning, som ikke er på midten af kanalen eller fra snavs på pladen. Under MM Standard, klik på procesog derefter vælge baggrund og skygge korrektion værktøj til korrektion for disse uoverensstemmelser. Dette værktøj er dog generelt kun nyttigt, hvis brugeren har taget billeder af kanaler før såning, som de kan bruge som reference billeder. Eller hvis baggrundsskyggen reference billeder er ikke tilgængelige, brugeren skal bruge deres dom for at fastsætte en grænseværdi, der dækker de mest celle område uden herunder baggrunden for hele billedet. Alternativt, Vælg repræsentative områder til at måle, at udelukker regioner af inkonsekvens ved at klikke på Rektangulær Region, Ellipse Regioneller Spore Region at vælge et område og vælg Aktive Region snarere end hele Billede i vinduet Vis Region statistik (under Analyseværktøjer). Hvis en repræsentativ region er udnyttet for tærskel lysfelt billedet, samme region bør anvendes til måling af den tilsvarende FITC billede. Det er nyttigt at optage den specifikke rumlig statistik (venstre, Top, bredde, højde, område, afskærmet) forbundet med repræsentative området så samme region vil blive fundet og målt på tilsvarende FITC billedet.

For at forhindre en ophobning af data på harddisken, vil forårsage, at computeren til at bremse, kan en ekstern harddisk købes til lagring af data. En anden indstilling for lagring af data og lette datadeling er CyVerse Bioinformatik platform. Opret en konto på CyVerse systemet ved at gå til http://www.cyverse.org/. Når du er logget, lancere Discovery miljø og derefter vælge "Log i CyVerse". Vælg "Data" og Naviger til mappen er du. Hvis en billedstak er på den lokale computer skal du vælge "Upload" og derefter "Enkel Upload fra skrivebordet". Find filen billede stak og vælge for upload. Fil eller en mappe kan deles med samarbejdspartnere, hvis de har en CyVerse konto og gives tilladelse. Deling af mappen data til den brede offentlighed kræver, at metadata blive tilføjet for hver fil ved hjælp af CyVerse godkendte standarder. Denne procedure vil ikke blive diskuteret her fordi det ikke er omfattet af dette arbejde.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort af tilskud fra det nationale Institut for almen medicinsk videnskab (NIGMS) (5P20GM103427), en del af National Institutes of Health (NIH)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Chloride, ACS VWR BDH9208-500G Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate Fluxion Biosciences 910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System Fluxion Biosciences BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade VWR 97061-904 Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS VWR BDH9230-500G Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade VWR EM-MX0070-1 Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade VWR BDH9268-500G Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP ATCC 15692GFP Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS VWR BDH9286-500G Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade VWR 97061-942 Part of the minimal media composition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
  2. Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
  3. Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
  4. Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  5. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  6. Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
  7. Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
  8. Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1 (2018).
  9. Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
  10. Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
  11. Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
  12. LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
  13. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
  16. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
  17. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
  19. Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
  20. Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
  21. Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
  22. Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299 (2017).
  23. Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
  24. Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
  25. Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
  26. Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
  27. Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
  28. Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
  30. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  31. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  32. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
  33. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  34. Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470 (2010).
  35. Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  36. Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
  37. Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467 (2014).
  38. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  39. Kim, J., Park, H. -D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  40. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  41. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  42. Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
  43. Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9 (2014).
  44. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
  45. Wentworth, C. D. Biofilm Morphology Suite. , Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018).
  46. Cyverse. , Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018).
  47. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
  48. Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
  49. Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
  50. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  51. Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
  52. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
  53. Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 Pseudomonas aeruginosa forbedret grøn fluorescerende proteiner mikrofluidik shear biofilm minimal medier Fluorescens mikroskopi -lysfelt mikroskopi biofilm dækning billedanalyse
Live celle analyse af Shear Stress på <em>Pseudomonas aeruginosa</em> ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sutlief, A. L., Valquier-Flynn, H.,… More

Sutlief, A. L., Valquier-Flynn, H., Wilson, C., Perez, M., Kleinschmidt, H., Schofield, B. J., Delmain, E., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System. J. Vis. Exp. (143), e58926, doi:10.3791/58926 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter