Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.
Abstract
Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC) Stammzelltransplantation wurde ein Grundstein zur Therapie Leukämie und anderen Krebsarten seit fast einem halben Jahrhundert, das einzige bekannte Heilmittel des humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) Infektion zugrunde liegt, und zeigt große Versprechen in die Behandlung von Erbkrankheiten wie Beta-Thalassämie. Unsere Gruppe entwickelte ein Protokoll zum Modell HSPC Gentherapie bei nichtmenschlichen Primaten (NHP), so dass Wissenschaftler zur Optimierung vieler der gleichen Reagenzien und Techniken, die in der Klinik angewendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Reinigung von CD34+ HSPCs und langfristig anhaltenden hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Teilmengen aus grundiert Knochenmark (BM). Identische Techniken können für die Reinigung von anderen HSPC-Quellen (z. B. mobilisiertem peripherem Blutstammzellen [PBSCs]) eingesetzt werden. Dargestellt ist ein 2-Tages-Protokoll in der Zellen werden gereinigt, kultiviert, geändert mit Lentivirus (LV) und Infusionslösung zurück in die autologe Host vorbereitet. Wichtige Messwerte des Erfolgs sind die Reinheit der CD34+ HSPC Bevölkerung, die Fähigkeit der gereinigten HSPCs morphologisch unterschiedliche Kolonien in halbfesten Medien und vor allem Gen Modifikation Effizienz zu bilden. Der entscheidende Vorteil HSPC Gentherapie ist die Fähigkeit, eine Quelle der langlebigen Zellen, die alle blutbildenden Zelltypen hervorbringen. Als solche wurden diese Methoden zu Modell Therapien gegen Krebs, genetische Erkrankungen und Infektionskrankheiten eingesetzt. In jedem Fall wird die therapeutische Wirksamkeit von verbessern die Funktion der unterschiedlichen HSPC nachkommen, einschließlich der roten Blutkörperchen, T-Zellen, B-Zellen und/oder myeloische Teilmengen gegründet. Die Methoden zu isolieren, zu ändern, und bereiten HSPC Produkte sind direkt anwendbar und übersetzbar für mehrere Krankheiten bei menschlichen Patienten.
Introduction
Gen der Stammzelltherapie ist ein mächtiges Mittel, um ein breites Spektrum der Erkrankungen des Menschen. HSPC Gentherapie ist ein besonders attraktiver Ansatz, durch (i) die relative Leichtigkeit des Sammelns dieser Zellen von Patienten, (Ii) die Fülle des Wissens, die verfügbar ist, in Bezug auf Zelle Oberfläche Phänotypen und ex-Vivo-Kultur-Parameter, und, wie das Feld erweitert, denn Iii) Es stellt Wissenschaftler mit einer immer größer werdenden Toolbox Gen Modifikation Strategien abgestimmt auf verschiedene Krankheiten von Interesse. Wir sind aktiv HSPC gen Therapieansätze aus verschiedenen Blickwinkeln, darunter die grundlegende Wissenschaft der Biologie, das Engraftment gen veränderten HSPCs im vorklinischen in-vivo-Modelle und die Anwendung relevanten Patientenpopulationen HSPC untersucht. Wir und andere haben die Zelle Oberfläche Phänotyp der funktionell unterschiedliche HSPC Teilmengen1,2,3, die Mobilisierung und Klimaanlage-Regimen, die HSPC Ertrag und Engraftment bei gleichzeitiger Minimierung der maximieren gekennzeichnet Toxizität4,5, und das Gen Modifikation und gen-Bearbeitung-Strategien, die auf eine Vielzahl von bösartigen, genetische und Infektionskrankheiten6,7,8, zugeschnitten 9,10. Die Funktion und Engraftment gen veränderten HSPCs können in einer Reihe von kleinen und großen Tier-Modelle, darunter Mäuse, Hunde und NHP ausgewertet werden. NHP-Modelle sind insbesondere vorteilhaft, weil viele Reagenzien, z. B. Antikörper spezifisch für HSPC Zelle Oberflächenproteine wie CD34 und CD90, in Menschen- und NHP Zellen austauschbar verwendet werden. Außerdem gibt es im Gegensatz zu Mäusen, große Tiere wie NHP eine größere Annäherung der Skala der gentechnische Veränderung für klinische Wirksamkeit notwendig. Zu guter Letzt NHP sind der Goldstandard für die Modellierung von menschlichen Krankheiten wie HIV-1 Infektion11 und einer aufstrebenden Modellsystem für Kandidaten gegen Krebs und Anti-HIV-Immuntherapien12,13.
Der Zweck dieses Protokolls ist, Methoden zur Reinigung, genetisch verändern und Vorbereitung NHP HSPC Infusion Produkte zu skizzieren. Obwohl nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls haben wir bereits gezeigt, dass diese Produkte in autologen NHP Gastgeber weiterhin, Anlass zu allen hämatopoetischen Linien und therapeutische Wirksamkeit bei den unterschiedlichsten Krankheiten Modelle1 bieten. Wir haben auch charakterisiert die Infektionsstaus anwachsen HSPCs und bauten eine Plattform zur Verfolgung der Kinetik, Menschenhandel und Phänotyp der einzelnen HSPCs und deren Nachkommen, folgende autologe Transplantation1,14. Die hier vorgestellten Methoden wurden mit den folgenden Zielen entwickelt: (i) zum Isolieren von hochreinen HSPCs und langfristige anwachsen HSC Teilmengen, Ii) primitive HSCs während ex-Vivo-Kultur zu pflegen, und Iii) effizient gen ändern-entweder lose HSPCs oder langfristige anwachsen HSC Teilmengen. Wir beschäftigen magnetische unterstützt-Zellsortierung (MACS), sowie Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS), um phänotypisch/funktionell unterschiedliche HSPC Populationen, konsistent mit den Methoden der vielen Gruppen2,15, isolieren 16. Die Aufrechterhaltung der primitiven HSCs in Kultur (d. h. die Differenzierung der Zellen in engagierten Stammväter, die Anlass zu voll zu minimieren differenziert lymphatischen und myeloische Teilmengen) ist eine wesentliche Facette des hier beschriebenen Protokolls. Obwohl wir zuvor Ansätze gekennzeichnet haben, um HSPCs zu erweitern, unter Beibehaltung einer primitiven Phänotyp17,18, hier beschreiben wir eine Protokoll, die konzentriert sich auf die Erhaltung der HSCs über eine minimale (48 h) und ex-Vivo-Kultur definiert.
Die effiziente Modifikation von HSPCs und HSC Teilmengen ist ein zentrales Ziel dieses Protokolls. Unter mehreren Ansätzen haben wir berichtet, zwei sind bei weitem die am meisten untersuchten in klinischen Studien: LV-vermittelten gentechnische Veränderung und Nuklease-vermittelten gen Bearbeitung1,6,19. Gen-Bearbeitung Strategien verwenden Sie eine der Nuklease-Plattformen, um insbesondere eine gezielte gen von Interesse zu ändern, z. B. C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) für die Behandlung der HIV-Infektion7,19 oder Bcl11A für die Behandlung Hämoglobinopathien6. Hier konzentrieren wir uns auf LV-vermittelten gentechnische Veränderung, in denen transgene Ladungen Genom1,8,20semirandomly integrieren. Ein wesentlicher Vorteil von LV Ansätze ist die Fähigkeit, große Mengen von genetischem Material (bis zu 8 oder 9 Kilobases) liefern. Obwohl gen Bearbeitung Strategien entwickelt werden, um gezielt ein Transgen von Interesse, nur auf einen bestimmten Ort zu integrieren durch Spender homologe Rekombination (HDR), erfordern diese Methoden weiter Entwicklung in-vitro- und in kleiner Tiermodelle. Im Gegensatz dazu wurden LV Vektoren ausgiebig in NHP und Patienten21,22eingesetzt. Wichtig ist, kann das Protokoll hier beschrieben wird, welche Nutzung BM als Ausgangspunkt HSPC Quelle grundiert, leicht und im großen und ganzen, z. B. angepasst werden um PBSCs zu isolieren. Wie oben beschrieben, nutzen wir die hohe genetische Ähnlichkeit zwischen Menschen und NHP Reagenzien zu verwenden, die auf beide Arten anwendbar sind. Schließlich wurde dieser Ansatz angepasst, um anderen blutbildenden Teilmengen, nämlich T Zellen12,23,24zu ändern; das Aufkommen der wirksame Ansätze der T-Zell-Immuntherapie hat stark auf die gleiche LV-Plattform genutzt, die in diesem Protokoll verlassen. Diese Methoden eignen sich für jeden Forscher HSPC Biologie oder LV-vermittelten gentechnische Veränderung interessiert. Zum Beispiel das HSPC Reinigung Protokoll hier vorgestellten Roman HSC-angereicherten Teilmengen zu charakterisieren genutzt werden wie zuvor beschrieben,1,15,25. Ebenso werden die LV-Transduktion, die hier vorgestellte Methoden in ähnlicher Weise könnte angewendet und für zahlreiche andere Zelltypen und experimentelle Fragen, sowohl im in-vitro und in vivo Modellen weiterentwickelt.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir Ihnen Methoden zum isolieren und NHP HSPCs genetisch zu verändern. Diese Methoden können für andere Arten und anderen Quellen der HSPCs leicht angepasst werden. Dieses sorgfältig geprüfte Protokoll zeigt viel versprechend in der Modellierung von wirksamen Therapien für zahlreiche Krankheiten des Menschen.
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Protocol
Autologe NHP-Transplantationen, Grundieren (Mobilisierung), die Sammlung von Zellen und gentechnische Veränderung sind konsistent mit den zuvor veröffentlichten Protokolle26durchgeführt. Alle experimentelle Verfahren überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Fred Hutchinson Cancer Research Center und der University of Washington genehmigt (Protokoll #3235 - 01). Alle Studien erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health ("The Guide"); Tiere wurden zu den Studien randomisiert.
1. Anreicherung von CD34+ HSPCs und über Nacht Kultur (Tag-1)
- BM zu ernten und konditionieren.
- Mobilisieren Sie NHP mit Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (GCSF) für 4 Tage wie bisher26beschrieben.
- Beruhigen Sie die Tiere mit 100 mg/kg Ketamin und 0,03 mL/kg des Dexmedetomidin (0,5 mg/mL Brühe). Analgetika (z. B. Buprenorphin SR) zum Zeitpunkt der Auslosung zu verwalten.
- Mit Klipper, das Tier vom Haar das proximale Ende des Humerus und/oder Femur Bones und Peeling die Haut mit Jod-basierte Peeling oder eine ähnliche antiseptische Lösung, wechseln sich ab mit Alkohol, und 3 X wiederholen. Als Narkosemittel zusätzliche Infusion der Knochenhaut mit Bupivacain (2 mg pro Standort, 5 mg/mL Brühe).
- Positionieren Sie die Knochenmark-Aspiration-Nadel (16 G) über die periostalen Eintrag Website (Markhöhle) und durchbohren Sie die Haut durchdringen die Markhöhle mit einer drehenden Bewegung. Das Stilett die Aspiration-Nadel zu entfernen und in einem sterilen Bereich zur weiteren Verwendung zu reservieren.
Hinweis: Wählen Sie die periostalen Eintrag Website der Markhöhle in einem Bereich des Knochens, die nicht durch Muskeln abgedeckt ist und wo die Form/Landschaft des Knochens ist entweder, sichtbar oder spürbar werden leicht durch die Haut (häufig in Richtung der proximalen und distalen Ende des Knochens). - An die BM-Nadel befestigen eine vorgefüllte Spritze mit einer Mischung aus gerinnungshemmenden Citrat Dextrose-Lösung (ACD-A) und Heparin (20 USP/mL, 1 mL pro 9 mL Knochenmark gesammelt werden).
- Ziehen Sie den Kolben zurück, während sanft Schaukeln der Extremität und drehen, um die Spritze aufziehen und Antikoagulans zu mischen zu agitieren. Drehen Sie die Nadel und positionieren Sie es während der Aspiration und Rückzug auf einen größeren Prozentsatz der Zellen im Knochenmark Raum zugreifen.
- Sobald die Probe gesammelt werden, entfernen Sie die Nadel und üben Sie Druck auf die Aspiration-Website, bis die Blutung aufhört.
Hinweis: Je nach Volumen benötigt kann während einer einzigen Sammlung Knochenmark von einem bis vier Gliedmaßen (zwei Humeri, zwei Oberschenkelknochen) gezogen werden. Nicht mehr als 20 mL sollte von jedem Glied gesammelt werden, und das Gesamtvolumen gesammelt sollte nicht mehr als 10 % von dem Gewicht des Tieres (10 mL/kg) bilden. - Wenn Aspiraten aus mehreren Gliedern zu erhalten, kombinieren Sie und nehmen Sie die Lautstärke.
- Lassen Sie die NHP Recover Postanesthesia.
- Kehren Sie die Auswirkungen von Dexmedetomidin mit 0,03 mL/kg Atipamezol (5 mg/mL Brühe) nach dem Eingriff. Bieten Sie Analgetika (z. B. Buprenorphin SR) vom klinischen Tierärzten für mindestens 48 Stunden nach dem Eingriff oder mehr, nach dem Ermessen des klinischen Tierarztes vorgeschriebenen auf klinische Symptome.
- Zurückkehren Sie das Tier zu seinem Hause Käfig, nach dem Eingriff und überwachen Sie alle 15-20 Minuten, bis das Tier sitzen auf seine eigene ist. Überwachen Sie das Tier täglich durch Tierarzt Mitarbeiter, bis festgestellt wurde, dass die Site(s), die Aspiration geheilt werden. Darüber hinaus überwachen Sie irgendwelche Anzeichen von Entzündungen, Infektionen oder Schmerzen.
- Parallel zur Zelle Verarbeitung, Zustand der gleichen NHP mit Bolusinjektion Ganzkörper-Bestrahlung (TBI): 1.020 cGy mit einer Rate von 7 cGy/min. verwalten Bestrahlung in fraktionierten Dosen in den 2 Tagen vor der Zelle Infusion.
- Hemolyze BM.
- BM in 50 mL konische Röhrchen (10-12 mL pro Röhrchen) unterteilen und hämolytische Puffer um die Lautstärke auf 50 mL (Tabelle 1) zu bringen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT), bis sie lysierten aber nicht länger als 7 Minuten Zentrifugieren bei 800 X g für 5 min und des Überstands von Pellet(s) Aspirieren, 2-5 mL Volumen/Rohr verlassen. Das Pellet in das Restvolumen aufzuwirbeln.
Hinweis: Erfolgreich lysierten Proben ändern Farbe, von einem dunklen Rot, transparent hellrot. - 10-15 mL hämolytische Puffer/Pellet hinzugeben. Entfernen Sie Blutgerinnsel mit 70 µm Zelle Siebe. Fügen Sie hämolytische Puffer bis zu 50 mL und 5 min bei RT inkubieren mit 800 X g für 5 min drehen.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL MACS-Puffer (Tabelle 1). Erneut durch ein 70 µm Zelle Sieb filtern. Spülen Sie den Schlauch und Filter, die es mit 40 mL MACS-Puffer bis zu 50 mL.
- BM in 50 mL konische Röhrchen (10-12 mL pro Röhrchen) unterteilen und hämolytische Puffer um die Lautstärke auf 50 mL (Tabelle 1) zu bringen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT), bis sie lysierten aber nicht länger als 7 Minuten Zentrifugieren bei 800 X g für 5 min und des Überstands von Pellet(s) Aspirieren, 2-5 mL Volumen/Rohr verlassen. Das Pellet in das Restvolumen aufzuwirbeln.
- Bereichern die CD34+ Zellen von lipämischen weißen Blutkörperchen (Leukozyten) unter Verwendung von standard-Protokollen.
- Drehen der Zellen bei 800 X g für 15 min. Check die Rohre um sicherzustellen, dass keine Zelle wirbelt in der oberen/mittleren offensichtlich sind. Wenn Zellen oberhalb der Pellets vorliegen, spin wieder mit einer höheren Geschwindigkeit (bis zu 1.000 x g maximal) und für bis zu 10 Minuten.
- Den Überstand abgesaugt und in 10 mL Aufschwemmen oder weniger MACS-Puffer, feststellend, dass das genaue Volumen. Zählen der Zellen in eine 1: 100 oder 1:1,000 Verdünnung mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
Hinweis: Diese Gesamtzahl der WBC ist die Anzahl der Voranreicherung. - Fügen Sie MACS-Puffer um die Zellkonzentration bis 1 x 108 Zellen/mL zu bringen. Wenn nötig, zuerst wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 - 1.3.2 (z.B. aufgrund einer niedrigen Voranreicherung Graf). 5 x 106 Zellen in MACS-Puffer für HSC Teilmenge Färbung (Voranreicherung Probe) zu reservieren.
- Die verbleibenden Voranreicherung Zellen, eine Endkonzentration von 40 µg/mL (1 x 108 Zellen/mL) unconjugated Anti-CD34 Antikörper (Klon 12,8, Table of Materials)27 hinzufügen. Die Zellsuspension bei 4 ° C auf ein Rohr Rotator inkubieren (siehe die Tabelle der Materialien) für 25-30 min.
- Verwendung MACS Puffer zu bringen das Volumen 50 mL und drehen Sie die Zellen bei 800 X g für 5 min. Aspirieren den Überstand, Aufschwemmen der Zellen in 50 mL MACS-Puffer und Spin zu 800 X g für 5 min wieder.
- Degas 100 mL MACS-Puffer mit zwei Filterschläuche, Umhüllung des Lufteinlass mit Wachspapier, für 25-30 min oder bis zum Gebrauch.
- Berechnen Sie das benötigte Volumen des magnetischen Beads: 1 mL der Perlen/109 Zellen. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen bis 108 Zellen/mL, nachdem die Perlen hinzugefügt werden. Zum Beispiel: 3 x 109 Zellen + 3 mL Perlen + 27 mL Macs-Puffer zu 30 mL Gesamtvolumen.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 4 ° C auf ein Rohr-Rotator für 25-30 min.
- Während Magnete für die Spalten zu erwerben; 0,6 x 109 Zellen pro Spalte verwenden möchten. Platzieren Sie die Spalten auf den Magneten zu und positionieren Sie eine 50 mL konische Rohr unter jeder Spalte die Durchströmung zu sammeln. Bereiten Sie eine 15 mL konische Rohr und den Kolben für jede Spalte für Elution (Schritt
- Wenn die Inkubation in Schritt 1.3.8 abgeschlossen ist, 50 mL der MACS-Puffer hinzu und drehen sich mit 800 X g für 5 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zellen in entgastem MACS-Puffer (2 mL pro Spalte). Pipette vorsichtig zur Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
- Ohne dass die Spalte trocken laufen, zugeben Sie 1 mL entgast MACS-Puffer für jede Spalte, gefolgt von 2 mL Zellsuspension. Spülen Sie den Filter und original Rohr mit entgastem MACS-Puffer und teilen Sie die Lösung gleichmäßig zwischen Spalten (6 mL/Spalte); Fügen Sie dann 7 mL entgast MACS-Puffer für die letzte Wäsche.
- Vorsichtig ziehen Sie die Spalte Weg von den Magneten ("Push" hinten oben) und sammeln Sie die letzte Tropfen in den durchströmten Rohr. Jede Spalte 5 mL entgast MACS-Puffer hinzu und wenden Sie den Kolben um die Zellen in das sterile konische Rohr aus Schritt 1.3.9 eluieren. Sammeln Sie keine Flüssigkeiten nach Luftblasen.
- Zählen der Zellen in der angereichert und die Durchströmung (FT) Röhrchen bei einem Verdünnungsverhältnis von 01:10. Halten Sie die Zellen auf dem Eis. Aliquoten 1 x 106 Zellen aus dem CD34-angereicherten Bruchteil und 5 x 106 Zellen aus der FT-Fraktionen für die Analyse von Durchflusszytometrie. Den FT-Bruch bei 4 ° C zu speichern, bis die Qualitätskontrolle (Schritt 2) abgeschlossen ist.
Hinweis: Die Anzahl der CD34+ Zellen erforderlich für erfolgreiche multilineage Engraftment in der NHP abhängig von der Frequenz des HSC-angereicherten CD34 ist+CD90+CD45RA– Teilmenge. Basierend auf einer durchschnittlichen Frequenz von 3 % - 5 % und die Mindestanforderung von 122.000 CD34++CD45RA CD90– Zellen pro Kilogramm Gewicht1, es wird empfohlen, mit einer Gesamtfläche von mindestens 2,5 x 106 fahren bis zu 10 x 10 6 CD34+ Zellen pro Kilogramm Körpergewicht. - Fügen Sie MACS Puffer für die CD34+ bereichert Bruchteil bis 50 mL insgesamt, mit 800 X g für 5 min drehen, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen bis 106 Zellen/mL in HSPC Medien (Tabelle 1).
- Die Zellen bei einer Dichte von 106 Zellen/mL in gelüfteten, Gewebekultur (TC) Platte-T-75 Flaschen, 10-20 mL pro Flasche, behandelt und sie über Nacht in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren. Ruhen Sie die Flaschen in Längsrichtung (nicht aufstehen).
Hinweis: Falls gewünscht, zusätzliche CD34+ Zellen oder CD34– FT kann kryokonserviert in 90 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) + 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 1 x 106 , 5 x 106 Zellen/mL, dann bei - langsam-gekühlt 80 ° C (z. B. mittels Einfrieren Behälter). Die durchschnittliche Recovery-Ausbeute von kryokonservierten Zellen ist abhängig von der CD34+ Reinheit und häufig reicht von 50 % bis 80 % mit einer Tragfähigkeit von > 80 %.
- Die Zellen bei einer Dichte von 106 Zellen/mL in gelüfteten, Gewebekultur (TC) Platte-T-75 Flaschen, 10-20 mL pro Flasche, behandelt und sie über Nacht in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren. Ruhen Sie die Flaschen in Längsrichtung (nicht aufstehen).
2. Qualitätskontrolle von CD34-angereicherten Zellen (Tag-1)
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Proben für Durchflusszytometrie vorbereiten.
- Aufschwemmen Sie Proben von jeder Isolierung Phase erwähnt (Voranreicherung, FT und CD34 angereicherte Fraktionen) in FACS Puffer in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/mL reserviert und übertragen Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension (Tabelle 1) zu einem FACS-Schlauch.
Hinweis: Kontrollproben sollte ungefärbte Zellen aus jeder Phase der Isolation (z. B. 5 x 105 Zellen) für die Anpassung der forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) und Autofluoreszenz in jedem Fluoreszenz-Kanal enthalten. Darüber hinaus müssen einzelne gebeizt Entschädigung Perlen für jeden Fluorochrom konjugierten Antikörper für den Ausgleich zwischen benachbarten Kanälen (Tabelle 2 und Tabelle 3) einstellen. - Fügen Sie gewünschten Antikörper (z. B. Anti-CD45, Anti-CD34 Anti-CD45RA und Anti-CD90), gemäß den Anweisungen des Herstellers, für einen Test (1 x 106 Zellen in 100 µL) (Tabelle 3). 20 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie 3 mL des FACS-Puffer und Spin 800 X g für 5 min, Aspirieren des Überstands Aufschwemmen in 100 µL Puffer FACS und auf eine entsprechende Durchflusszytometer (Schritt 2.2) zu analysieren.
- Aufschwemmen Sie Proben von jeder Isolierung Phase erwähnt (Voranreicherung, FT und CD34 angereicherte Fraktionen) in FACS Puffer in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/mL reserviert und übertragen Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension (Tabelle 1) zu einem FACS-Schlauch.
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Bereiten Sie den Flow Cytometer/Zelle Sorter für die Analyse.
Hinweis: es wird empfohlen, die Analyse auf dem gleichen Computer ausführen, die für Zelle sortieren im Schritt 2.3 verwendet wird.- Erzeugen Sie ein Protokoll wie FSC/SSC, CD45/CD34 und CD45RA/CD90 (drei Fluss Grundstücke). Mit der rechten Maustaste auf einem Fluss-Grundstück und die Bevölkerung Hierarchie Layout hinzufügen.
- Klicken Sie auf das FSC/SSC-Grundstück, wählen Sie die Polygon-Gate-Funktion und zeichnen Sie ein Tor, Schmutz und abgestorbene Zellen auszuschließen. Markieren Sie das neue Tor zu, und benennen Sie sie zu streuen , im Inspektor-Fenster.
Hinweis: Dies wird automatisch als P1 bezeichnet. - Mit der rechten Maustaste in der Mitte des CD45/CD34 Fluss Plots, Populationenzeigen navigieren und Tor den Plot auf streuen. Verlosung einer rechteckigen Tor um CD45IntCD34+ Zellen ausschließen nicht CD34 Zellen und Nonhematopoietic Zellen, als auch als passives Thrombozyten und Erythrozyten (CD45–). Benennen Sie das Tor zum CD34+.
- CD45RA/CD90 Fluss Plots auf die CD34 Tor+ Bevölkerung. Zeichnen Sie drei unabhängige Subgates um CD90+CD45RA– Zellen (für HSCs angereichert), CD90–CD45RA– Zellen (angereichert für multipotent und Erythro-myeloischen Vorläuferzellen [MPPs/EMPs]) und CD90–CD45RA + Zellen (angereichert für Lympho-myeloischen Vorläuferzellen [LMPs]). Benennen Sie die Tore in HSC, MPP-EMPund LMP, beziehungsweise.
- Wenn Sie fertig sind, sicherzustellen, dass die Bevölkerung Hierarchie sechs hierarchisch organisierten Einträge in der folgenden Reihenfolge enthält: 1) alle Ereignisse; (2) streuen; (3) CD34+; (4) HSC; (5) MPP-EMP; (6) LMP. Stellen Sie sicher, dass die Strömung Grundstücke und die Form des Tores aussehen wie in Abbildung 4dargestellt.
- Ungefärbten Voranreicherung WBK passen Sie die Spannung für FSC, SSC und alle Kanäle in Fluoreszenz (Tabelle 2, Probe 5) laufen. Führen Sie Einzel-gefärbten Entschädigung Perlen um den Ausgleich zwischen benachbarten Kanälen (Tabelle 2, Proben 1-4) anzupassen. Alle verbleibenden ungefärbten und gefärbten Proben mit der eingestellten und ausgeglichen-Protokoll, um CD34 Bereicherung Effizienz (Tabelle 2, Proben mit 6-9) zu dokumentieren.
Hinweis: Halten Sie die endgültige Stichprobe (Tabelle 2, Probe 10) für die gleichzeitige Analyse und Sortierung im Schritt 2.4 Zelle.
-
Konfigurieren des Zelle Sorters zur Art-Reinigung von CD34-Teilmengen in koloniebildenden Zelle (CFC) Assays.
Hinweis: wenn eine andere Maschine für die Analyse (Schritt 2.2), richten Sie das Protokoll auf der Zelle Sorter wie zuvor beschrieben in Schritten 2.2.1 - 2.2.5 verwendet worden ist.- Passen Sie die Winkel/Spannung für die Links und rechts-Streams in der Zelle Sorter Software, Zellen auf 15 mL Röhrchen mit CFC Medium einzuzahlen. Konfigurieren Sie den Winkel der Nebenstrom um Fehlstellungen zu verhindern. Optimieren Sie den Winkel des Wildbaches abgeschrägten Seite schrittweise, bis der sortierten Zellen das CFC-Medium und nicht die Seite des Rohres getroffen, da sehr wenige Zellen sortiert werden.
- Öffnen Sie im Browser den Ordner Global Arbeitsblätter, und erstellen Sie ein neue Art-Layout mit dem Button in der oberen Menüleiste des Browser-Fensters. Ändern Sie den Eintrag in der Sammelvorrichtung Dropdown-Menü, 2 Röhren, der Eintrag in der Präzision-Drop-Down-Menü, 4-Wege-Reinheit oder einzelne Zelle und die Ziel-Ereignisse auf 800-1.200 Zellen festgelegt. Klicken Sie auf das Feld Art-Standort (links oder rechts), wählen Sie den Eintrag hinzufügen im Menü, und wählen Sie die Bevölkerung aus dem Menü sortieren.
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Sortieren Sie die Zellen für CFC-Assays.
Hinweis: Sortierung für die CFC-Assays erfolgt erst mit Zellen aus dem CD34 angereicherte Produkt (Tabelle 2, Beispiel 10).- Beispiel 10 laden, 2.000-3.000 Ereignisse aufzeichnen und Feineinstellung der Art Tore der Signal-Stärke und Ziel Bevölkerung angepasst.
- Wenn das Setup abgeschlossen ist, erwerben Sie Zellen (Tabelle 2, Beispiel 10). Daten zu erwerben, wie unter Punkt 2.2.3 beschrieben, einstellen die Durchflussmenge bis 500-1.000 Zellen/s und 800-1.200 Zellen aus (i) die Scatter-Tor, (Ii) die CD34 sortieren+ Tor, (Iii) die HSC Tor, iv) das MPP-EMP-Tor, und (V) die LMP-Tor in getrennten Röhren mit 3,6 mL FCKW Medien.
Hinweis: Sortierung für CFC-Assays erfolgt nur mit Zellen aus dem CD34 angereicherte Produkt (Tabelle 3, Beispiel 10). Zellen aus dem Scatter und CD34+ Tore müssen individuell sortiert werden, wohingegen HSCs, MPP-EMPs und LMPs gleichzeitig in die linken und rechten Rohr Halter Position sortiert werden können. - Wirbel und 1 mL Zellsuspension zu jedem der 3 x 3, 5 cm steril, Nontissue, Kultur-behandelten Petrischalen zu verzichten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem sekundären Behälter (z.B.eine 15 cm Petrischale) 10-14 Tage.
- Tage 10-11 postplating zählen Sie einzelne Kolonien aus allen drei Platten pro Zustand, basierend auf Kolonie Morphologie.
(3) gentechnische Veränderung von CD34+ HSPCs und über Nacht Erholung (Tag 0)
- Verdünnen Sie 2,5 mL 1 µg/µL CH-296-Lösung bis 50 µg/mL in 50 mL Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS, siehe die Tabelle der Materialien).
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Die LV-Transduktion Fläschchen vorbereiten.
- Ermitteln Sie die ungefähre Anzahl der Nontissue-Kultur (TC)-Flaschen benötigt (in der Regel von der Zellzahlen in Schritt 1.4 ermittelten) behandelt. Platte 1 x 107 Zellen in 10 mL Medien pro T-75 Kolben wollen (1 x 108 total Zellen müsste 10 Fläschchen) und beinhalten eine TC-unbehandelte 12-Well-Platte (mock Transduktion Zustand). Fügen Sie sterile HBSS und 50 µg/mL CH-296 bestand aus Schritt 3.1 auf jede Flasche/Platte, in einer Konzentration von 2 µg/cm2. Verwenden Sie für T-75 Flaschen 3 mL von 50 µg/mL CH-296 + 7 mL HBSS; Verwenden Sie für die 12-Well-Platte 160 µL 50 µg/mL CH-296 + 340 µL HBSS pro Bohrloch.
- Lassen Sie das Geschirr an RT ungestört sitzen, auf einer sauberen Werkbank oder in die Haube für 2 h Aspirat CH-296 und ersetzen Sie es mit einem ähnlichen Volumen von sterilen HBSS + 2 % Rinderserumalbumin (BSA). 30 min bei RT inkubieren, Aspirieren HBSS/BSA und den Abwasch mit einem ähnlichen Volumen von sterilen HBSS mit 2,5 % 1 M HEPES, pH 7,0. Aspirieren Sie unmittelbar vor der galvanischen Zellen (Schritt 3.4).
Hinweis: Folgender Schritt 3.2.2 lassen Sie nicht die Platten/Fläschchen zu trocknen. Platten mit sterilen HBSS + 2,5 % 1 M HEPES sind bei 4 ° C über Nacht gehalten (d. h., am Tag-1 vorbereiten).
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Ernten und die CD34 transduzieren+ Zellen von Tag-1.
- Mit einer 10 mL-Pipette, spülen Sie lose adhärente Zellen durch die wiederholten, sanfte Spülung von jeder Kultur-Kolben mit sterilen HBSS. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen lösen werden (ggf. Hahn/Schlag den Kolben um die Zellen zu lockern).
- Die Zellen bei 800 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand Aspirieren und Aufschwemmen der Zellen in Transduktion Medien zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL. Nachdem alle Zellen erfasst wurden, bestimmen Sie die Zellzahl, mit einem Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler.
- Geben Sie 1 mL Zellsuspension (1 x 10-6 -Zellen) in einer CH-296-beschichtete 12-Well-Platte (für die Mock-ausgestrahlt Kontrollprobe). Teilen den Rest der Zellen unter der T-75-Fläschchen (Schritt 3.2.2), Hinzufügen von ca. 10 mL pro Flasche (1 x 107 Zellen). Lassen Sie die Zellen, die CH-296-Beschichtung durch Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 30 min, mit den Kappen entlüftet einzuhalten.
- Tauen Sie Virus-bedingte Medien (VCM, Table of Materials auf) und bestimmen Sie die Titer in infektiösen Einheiten pro Milliliter (IU/mL)28,29,30,31,32 . Fügen Sie das entsprechende Volumen der VCM zu jedem T-75 Kolben aus Schritt 3.3.3 und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2.
Hinweis: Wenn Sie ein einzelnes Transduktion durchführen, brüten Sie über Nacht; Wenn Sie eine doppelte Transduktion durchführen, wiederholen Sie dieses Stepapproximately 6 - 8 h nach der ersten Transduktion ohne waschen/Recovery phase und dann über Nacht inkubieren. Fügen Sie beispielsweise für eine Flasche (1 x 107 Zellen) mit einer gewünschten Vielzahl von Infektion (MOI) 10, 1 mL der Virus hochinfizierende am 1 x 108 IU/mL.
4. Handy-Ernte und Vorbereitung für die Infusion (Tag 1)
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Ernte der Zellen.
- Ausgestrahlt und mock-Zellen zu sammeln, wie in den Schritten 3.3.1 - 3.3.2 beschrieben. Führen Sie sequentielle Waschungen mit 10 mL HBSS, Waschungen mit dem konischen Rohr mit den Zellen zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen aus den Kolben, klopfen/schlagen die Fläschchen, ggf. entfernt wurden.
- Zentrifugieren Sie Zellsuspensionen 800 X g für 5 min, aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 1 mL HBSS. Kombinieren Sie die Rohre mit Zellen aus dem gleichen Zustand. Spülen mit 10 mL HBSS und hinzufügen, dass die Zellsuspension. Die Zellzahlen unter Verwendung eines Hemocytometer zu bestimmen. 50 mL in HBSS und Zentrifuge bei 800 X g für 5 min bringen Sie die gesamte Zellvolumen.
-
Puls von Prostaglandin E2 (PGE2) und Reagenzien für die Infusion Produkt vorbereiten.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen transduced Zellen (nicht verspotten), 5 x 106/mL in HSPC Medien ohne Zytokine. Fügen Sie 10 mM PGE2, eine Endkonzentration von 10 µM die Zellen auf Eis für 2 h, sanft wirbeln sie alle 30 min inkubieren.
- Während Schritt 4.2.1, autologes Serum (Table of Materials) Wärme zu inaktivieren, die Container in Wachspapier wickeln und bei 56 ° C für 30 min Inkubation bereiten 2 % autologes Serum in HBSS (500 µL der Hitze-inaktivierten Serum + 24,5 mL HBSS), mischen sie gut, und Lagern Sie die Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung. Auch bei Schritt 4.2.1 ernten Sie Mock ausgestrahlt Zellen in einem 12-Well-Platte durch Pipettieren der Zellen nach oben und unten kräftig. Eine 15 mL konische Rohr die Zellsuspension hinzu, waschen Sie sie 3 X mit 1 mL HBSS, und das gleiche 15 mL konische Rohr Waschungen hinzufügen.
- Nach 2 h Inkubation PGE2, waschen Sie die Zellen 2 X indem sie 800 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verworfen. Nach der zweiten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in einem entsprechenden Volumen von HBSS zum zählen, mit einer Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
Hinweis: Zellen verklumpen häufig nach einem PGE2 Puls, die für weniger zuverlässig Zellenzahlen machen kann. Verwenden Sie gegebenenfalls die Zellzahl von Schritt 4.1.2 anstelle von Schritt 4.2.3.
- Mock und ausgestrahlt Zellen für die Qualitätskontrolle (Schritt 5) des Messguts Infusion zu reservieren: 5 x 105 bis 1 x 106 Zellen für Flow Cytometry/Zellsortierung (Schritt 5.1 und 5.3) und ca. 1 x 106 Zellen für Flüssigkultur (Schritt 5.2) und Kolonie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Schritt 5.4).
-
Vorbereiten der Infusion-Produkt.
- Führen Sie mit dem Rest der transduced Zellen eine dritte waschen in 50 mL HBSS, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL HBSS + 2 % autologes Serum (in Schritt 4.2.2 vorbereitet). Zeichnen Sie die 10 mL Lösung in eine 20 mL Spritze mit einer Nadel 16,5 G ausgestattet. Waschen Sie die Tube mit 10 mL HBSS + 2 % Auto Serum und zeichnen Sie die Wäsche in die gleiche Spritze 20 mL Gesamtvolumen zu. Die Spritze mit der Nadelschutzkappe Kappe, beschriften Sie die Spritze und legen Sie es auf dem Eis für Transport/Infusion.
- Die Infusion ausgestrahlt Zelle Produkt in die autologe Host befindet sich in einem akkreditierten Tier Forschungseinrichtung über einen zentralen Venenkatheter33,34. Überwachen Sie die transplantierten Tiere komplettes Blutbild (CBCs) und Blut Chemikalien und führen Sie studienspezifischen gen-Kennzeichnung Assays zugeschnitten auf das Projekt1,6,19.
5. Qualitätskontrolle
Hinweis: Flow Cytometry und Zellsortierung erfolgen, nachdem die Zellen in den Tieren im Rahmen des Follow-up im Schritt 4.4.2 beschrieben infundiert werden. Durchflusszytometrischen Bewegungsdaten wird unmittelbar nach der Transplantation zur Bestimmung der Zusammensetzung von phänotypisch definierten Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Teilmengen in der Aufguss-Produkt (Schritt 5.1 und 5.3), während die Analyse der CFC assays erfolgt 12-14 Tage Postinfusion Gen-Modifikation Effizienz von Colony PCR (Schritt 5.4) zu bestimmen.
-
Durchführen Sie Durchflusszytometrie und CFC Sortierung der Infusion Produkt.
- Analysieren Sie die Zellen, indem Durchflusszytometrie und reinigen Sie Art-CD34 Teilmengen für CFC-Assays, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Samen CFC Proben von mock und ausgestrahlt CD34-Zellen (Infusion Produkt nach dem PGE2-Impuls).
- Sortieren Sie maximal 800 Zellen pro Zustand und Wirbel, Platte, Kultur zu und zählen Sie CFC-Assays wie unter Punkt 2.4 beschrieben. Wählen Sie nach Auszählung die Kolonien aus der CFC-Assays Kolonie PCR wie unter Punkt 5.4 beschrieben durchführen.
-
Flüssigkultur
- Platte Zellen für Flüssigkultur in HSPC Medien auf 1 x 106/mL in TC-unbehandelten Platten. Am Tag 2, 5 und 12 Posttransduction ernten Sie und zählen Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie. Zelle Sortierung für CFC-Assays ist nicht erforderlich.
- An den Tagen 2 und 5 replate 33 % der Zellen im frischen HSPC Media bei 1 x 106/mL. 33 % der Zellen im DNA-Extraktionspuffer für quantitative Real-Time PCR einfrieren. Verwenden Sie 33 % der Zellen für Durchflusszytometrie, wie in 2.1 und 2.2 beschrieben.
- Verwenden Sie diese Daten aus Schritt 5.2.2 die phänotypische Zusammensetzung der hämatopoetischen nachkommen zu analysieren. Die Häufigkeit von CD34 + Zellen und phänotypisch definierten Teilmengen zu bestimmen, wie in Schritt 2.2.2 innerhalb jeder Probe beschrieben. Vergleichen Sie die Zusammensetzung der CD34+ Zellen zwischen den Bedingungen, die Wirkung der gentechnische Veränderung bestimmen.
Hinweis: CD34+ Zellen sollten ihren Ausdruck in der gesamten Kultur pflegen und enthalten alle phänotypische Teilmengen. Ein Verlust von CD90+CD45RA– Zellen oder eine Überrepräsentation der phänotypischen Teilmengen kann mittelbare oder unmittelbare Auswirkungen der gentechnische Veränderung hinweisen.
-
Transgene Ausdruck (z. B.., grün fluoreszierendes Protein [GFP]) durch Durchflusszytometrie (optional und abhängig von der Versuchsaufbau), Anpassung des Protokolls vom Schritt 2.2 zu quantifizieren.
- Fügen Sie drei Fluss-Grundstücke zeigen SSC/Transgen (z. B. SSC/GLP). Tor dem erste Grundstück auf HSCs, die zweite am MPPs-EMPs und der dritte auf LMPs. Grundstück jedes gegen Transgen (z. B. GFP) und Tore namens HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+und LMP-GFP+, bzw. zu erstellen.
- Wenn Sie fertig sind, hat die Bevölkerung Hierarchie zu neun hierarchisch organisierten Einträge in der folgenden Reihenfolge enthalten: 1) alle Ereignisse; (2) streuen; (3) CD34+; (4) HSC; (5) HSC-GFP+; (6) MPP-EMP; (7) MPP-EMP-GFP+; (8) AMP; (9) LMP-GFP+.
Hinweis: Jede Transgene Ausdruck später in Flüssigkultur (z. B. Tag 5 und 12) wird die Gen Modifikation Effizienz durch Kolonie PCR im Schritt 5.4 bestimmt besser widerspiegeln. Früheren Zeitpunkten in Flüssigkultur können den Transgen-Ausdruck durch Anlagenbereichen LVs überschätzen. In ähnlicher Weise führt Fluss-Sortierung GFP+ Zellen für CFC-Assays am 1. Tag viele falsche positive Kolonien.
-
Durchführen Sie Kolonie PCR.
- Nach der Auszählung in den Schritten 2.4.4 und 5.1.1, wählen Sie einzelne Kolonien in 50 µL DNA Extraktionspuffer, mit einer 10 µL oder 20 µL Pipette und Pipette rauf und runter, die Kolonien auf eine Röhre von einer 8-Röhre PCR übertragen Streifen Cap. Wählen Sie acht Kolonien aus dem mock Zustand und 88 Kolonien aus dem transduced Zustand, eine volle 96-Well-Platte zu generieren. Jede Vertiefung 50 µL DNA Extraktionspuffer hinzufügen.
- Extrahieren von DNA aus den Kolonien, mit einem Thermocycler und das folgende Programm: 65 ° C/20 min, 99 ° C/10 min und 4 ° C zu halten. Möchten Sie die DNA auf-20 ° C so schnell wie möglich für eine optimale Qualität zu bewegen.
- Führen Sie Kolonie PCR, LV-ausgestrahlt Zellen, vergleicht man die Anzahl der LV+ Kolonien, unter Verwendung von Lenti F/R Zündkapseln, total Kolonien, mit Aktin F/R und Kontrolle Primern (Table of Materials) zu quantifizieren.
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Representative Results
Das oben beschriebene Protokoll soll isolieren und gen-ändern NHP CD34+ HSPCs, die anschließend wieder in die autologe Host (Abbildung 1 und Abbildung 2) infundiert werden können. Wenn Sie dieses Protokoll folgen, wir in der Regel erhalten bis zu 8 x 109 insgesamt Leukozyten von grundiert BM aus Zopf Makaken und, manchmal, das Doppelte von Rhesus-Makaken. Bei beiden Spezies, die Anzahl der CD34+ HSPCs, die wir bereichern ist proportional zum Eingang des WBC Gesamtanzahl (Abbildung 3). Bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die gesamte CD34+ HSPC Produkt enthält Zellen, die nicht wahr, langfristige anwachsen HSCs. also, wir haben Flow-Zytometrie-basierte Techniken (Abbildung 4) entwickelt und CFC-Assays (Abbildungen 5-6) identifizieren Sie langfristige HSCs und engagierte Stammvater Teilmengen in Kulturen. Im Gegensatz zu echter HSCs bleibt engagierte Stammväter bestehen, für einen relativ kurzen Zeitraum in-vivo. Zu guter Letzt die LV-vermittelten Gen Modifikation Strategie Ergebnisse im robusten gen Kennzeichnung in kultivierten CD34+ HSPCs. Diese Zellen werden überwacht, über bis zu 2 Wochen in Kultur, teilweise Verringerung die Zahl der "false Positive" Zellen, die GFP aus nonintegrated LV Vektoren ausdrücken. Da diese Zellen nicht stabil integrierte Kopie des Vektors LV in das zelluläre Genom tragen, werden sie sich über die 12-Tage-Flüssigkultur Assay (Abbildung 7) verdünnen.
Abbildung 1: Produktion eines autologen, gen-veränderte NHP HSPC Produkts. Das Protokoll isoliert CD34+ HSPCs (Tag-1), gen-ändert diese Zellen (Tag 0) und bereitet eine Aufguss-Produkt (Tag 1) 48 h Zeit Laufe. Kolonie Bildung, flüssigen Kultur und ex-Vivo Tests für weitere 2 Wochen, weiter um diese Produkte zu charakterisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Chronologie der Ereignisse. Die durchschnittliche Zeit, jeder einzelnen Schritt des Protokolls, in ca. 2 Tagen durchzuführen. Das Timing der einzelnen Schritte hängt von der Stammzell-Quelle (Schritt 1 des Protokolls) und/oder Art der gentechnische Veränderung (Schritt 3 des Protokolls). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: weißen Blutkörperchen und CD34 Ausbeute aus grundiert Zopf und Rhesus-Makaken Knochenmark. CD34 bereichert+ HSPC zählt (Schritt 1.4 des Protokolls) als Funktion der gesamten weißen Blutkörperchen (Schritt 1.3.3 des Protokolls) von 10 Zopf Makaken (Quadrate) und sechs Rhesus-Makaken (Dreiecke). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Strategie für die Qualitätskontrolle von CD34-bereichert und gen-modifizierte Produkte Gating. Total weiße Blutkörperchen ("Voranreicherung") und anschließend CD34-angereicherten HSPCs sind gefärbt mit Antikörper spezifisch für CD34, CD45 und CD90 CD45RA, um die Anzahl der HSC, MPP, EMP und LMP-angereicherten CD34 Teilmengen zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Morphologie der CD34+ Zellen vor und nach der Änderung der gen. Top-Platten: drei repräsentativen Hellfeld-Bilder von HSPC-Kolonie-Assays. Untere Verkleidungen: GFP Fluoreszenz entspricht jede Hellfeld-Bild oben. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: koloniebildenden Zelle (CFC) Potenzial von CD34+ Zellen und Art-gereinigte Teilmengen. Nach der Art Reinigung für CFC von HSPC Teilmengen am Tag-1 (§ § 1 und 2 des Protokolls) assays und Tag 1 (Abschnitt 5 des Protokolls), einzelne Kolonien sind erzielte basierend auf morphologische Merkmale. KBE-MIX = Mischung aus myeloischen (weiß) und erythroiden (rot) Zellen; BFU-E = nur erythroiden Zellen; KBE-G = Granulozyten; CFU-GM = Granulozyten und Makrophagen/Monozyten; KBE-M = Makrophagen/Monozyten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: repräsentative durchflusszytometrischen Bewegungsdaten von gen-modifizierten Zellen in Flüssigkultur. Prozentsatz der CD34+ HSPCs nach Transduktion mit einer GFP exprimierenden LV Vektor. Zellen sind bis zu 2 Wochen nach Transduktion kultiviert. Eine Abnahme der GFP+ Ereignisse im Laufe der Zeit spiegelt einen Verlust des GFP-Signals aus Zellen tragen nonintegrated LV-Vektoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Inhalt |
| Hämolytische Puffer | 150 mM Ammoniumchlorid, 12 mM Natriumbicarbonat, 0,1 mM EDTA in bidestilliertem Wasser (DdH2O) |
| Kommerzielle Puffer | Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 X) pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA |
| FACS-Puffer | Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 X) pH 7,2, 2 % fötalen Rinderserum |
| HBSS + 2 % BSA | Hank Salzlösung, 2 % Rinderserumalbumin ausgeglichen |
| HSPC Medien | StemSpan SFEM II, 1 % Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL rekombinanten menschlichen TPO, SCF, FLT-3 |
| Transduktion Medien | StemSpan SFEM II, 1 % Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL rekombinanten menschlichen TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL Cyclosporin, 4 Ug/mL Protamin Sulfat |
Tabelle 1: Puffer und Medien Formulierungen.
| ID | PE | PECF594 | APC-Cy7 | V450 | Beschreibung |
| 1 | CD90 | Ersatz-Perlen | |||
| 2 | CD34 | Ersatz-Perlen | |||
| 3 | CD45RA | Ersatz-Perlen | |||
| 4 | CD45 | Ersatz-Perlen | |||
| 5 | Ungefärbten Leukozyten vor CD34-Anreicherung | ||||
| 6 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Gefärbten Leukozyten vor CD34-Anreicherung |
| 7 | Ungefärbten Leukozyten von Flow-through (FT) | ||||
| 8 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Gefärbten Leukozyten von Flow-through (FT) |
| 9 | Ungefärbten WBKs CD34 angereicherte Produkt | ||||
| 10 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Gefärbten Leukozyten von CD34-angereicherte Produkt |
Tabelle 2: Repräsentative Flow Panel für die Qualitätskontrolle von CD34-bereichert und gen-modifizierte Zelle Produkte.
| Antigen | Klon | Fluorochrom | Laser | Filter |
| CD45 | D058-1284 | V450 | 395 nm | 450/40 nm |
| CD90 | 5.00E + 10 | PE | 488 nm oder 532 nm | 585/42 nm |
| CD34 | 563 | PE-CF594 | 488 nm oder 532 nm | 610/20 nm |
| CD45RA | 5H 9 | APC-Cy7 | 633 nm | 780/60 nm |
| V450: Violett 450 nm; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: Markenname von Biotium; APC: Allophycocyanin-Cyanin 7 | ||||
Tabelle 3: Antikörper-Färbung Panel für Qualitätskontrolle durch Durchflusszytometrie und Zellsortierung.
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Discussion
LV-Vektor Engineering ist die am besten charakterisierten Methode zum gen ändern-Zelltypen wie CD34+ HSPCs, für die anschließende Transplantation in-vivo. Das hier beschriebene Protokoll soll maximiert die Anzahl der gen-modifizierte HSPCs, die langfristig in Vivo beibehalten und bieten klinischen Vorteile für Patienten mit verschiedenen malignen, infektiöse und genetischen Krankheiten. Obwohl gen Bearbeitung Strategien im letzten Jahrzehnt entstanden, LV-modifizierten Zellen sind die besten studierte in vitro in Tiermodellen und Patienten1,8,20,21,22.
Basierend auf unserer langjährigen Erfahrung mit diesem Protokoll, die Anreicherung von reinen CD34+ HSPCs (d. h. > 80 % der CD34+ Zellen in der sortierten Zelle Produkt) ist ein wichtiger Aspekt für den Erfolg. Da diese Zellen aus einer gemischten Population von insgesamt BM WBKs abgeleitet werden, können niedrig-Reinheit Kulturen Zellen enthalten, die nicht weiterhin wird auf lange Sicht wiederum Senkung der Dosis des wahren Stammzellen, die in der autologen Host infundiert werden. Darüber hinaus garantieren qualitativ hochwertige LV VCM die höchste Effizienz der gentechnische Veränderung.
Um Defizite in der Reinheit der angereicherten CD34+ HSPC Produkte, ist es oft nützlich, überprüfen die Qualität der Reagenzien verwendet, um diese Zellen, nämlich der Anti-CD34-Antikörper (die unsere Gruppe im eigenen Haus von einer Hybridom-Zelllinie reinigt), zu isolieren und magnetische Beads die Antikörper-markierten Zellen zu binden. Wir empfehlen eine MOI von 10, mit einer Option auf dieser Transduktion (MOI 10 x 2) wiederholen. Wichtig ist, sollte das MOI nach einer Qualitätsbewertung von VCM, einschließlich der Titration jedes Vektors auf eine standardisierte verschoben-Zelllinie wie HT108029empirisch ermittelt werden. Wichtig ist, können verschiedene VCM-produzierenden Labors unterschiedliche verschoben-Zell-Linien, einschließlich HOS30, HeLA31und 293T32, wodurch die Fähigkeit, Titer zwischen Einrichtungen vergleichen eingeschränkt werden kann. Wir bevorzugen es, Retiter ein Vektors mit dem Assay, um die genaueste Berechnung des VCM effizient gen ändern-CD34+ HSPC Zellen. Einmal qualitativ hochwertige CD34+ HSPCs und VCM gewonnen wurden, Transduktion Effizienz und Engraftment in drei verschiedene Schritte weiter verstärkt werden. Erstens zwingt die Zugabe von Cyclosporin Transduktion Medien AIDS in den frühen Schritten der Vektor Transduktion und Integration ins Ziel Zellen35,36, während Protamin Sulfat abstoßend sinkt zwischen der Lentivirale Vektor Partikel und die Zelle Oberfläche33,37. Zweitens: Behandlung von Platten mit einem rekombinanten Fibronektin Fragment (z. B. RetroNectin, CH-296) steigert die Transduktion Effizienz und verbessert auch die in-vivo Engraftment Potenzial von gen-modifizierte HSPCs 33,38, 39. Frühere Studien zufolge vor allem CH-296 ist nur während wichtig, aber nicht vor, Transduktion33,38. Zu guter Letzt wir Puls gen veränderten Zelle Produkte mit PGE2 Engraftment und Persistenz in Vivo zu verbessern, wie zuvor für menschlichen und nichtmenschlichen Primaten CD34 gezeigt hat+ HSPC Produkte40,41.
LVs integriert zufällig in das Genom, wie ihre Vorgänger, gammaretroviralen Vektoren (RVs). Obwohl weniger klinische Daten verfügbar sind, für LVs als für Wohnmobile, aktuelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass LV Ansätze wesentlich geringere Risiken der Zelle Transformationen durch LV insertional Mutagenese tragen; RV-Strategien sind weniger häufig wegen dieser Gefahr42verwendet. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Effizienz der gentechnische Veränderung weniger als 100 %, und ein Teil der gen-modifizierten Zellen nicht, in-vivo bestehen bleibt. Z. B. möglicherweise ein 60 % gen geändert HSPC Produkt in 30 % langfristige Einpflanzen, gen veränderten Zellen. Wann immer möglich, sind die gen-Therapiestrategien, die hier vorgestellten entworfen, um diese Einschränkung zu überwinden, durch die Einführung von transgenen, die therapeutische Wirksamkeit zu bieten, auch wenn in einer Minderheit der hämatopoetischen Ursprungs Zellen8,43 ausgedrückt .
Die Zukunft ist rosig für LV-basierte HSPC Modifikation Ansätze. Wir verwenden routinemäßig dieses Protokoll, "gen-Mark" Zellen ermöglicht tracking in-vivo-1. Wir haben auch diese Strategie um LV Varianten innerhalb der selben Tier vergleichen angepasst. Solche "wettbewerbsfähigen" Transplantationen ermöglichen einen Vergleich der verschiedenen Vektoren (z. B. zur Kennzeichnung derjenigen mit besseren Wirkungsgrad) und transgene (z. B. verschiedene HSPC Teilmengen zu verfolgen oder in Krankheitsmodellen zu vergleichen). Nach vorne verschieben, glauben wir, dass LV Gentherapie in HSPCs ein wichtiges Instrument neben gen Bearbeitung Ansätze, vor allem in Situationen bleiben wird, wo große genetische Ladungen stabil während der Lebenszeit einer Einzelperson ausgedrückt werden muss.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Helen Crawford für die Vorbereitung dieses Manuskript, Jim Woolace für Grafik-Design, und Veronica Nelson und Devikha Chandrasekaran für die Teilnahme an der Entwicklung des Protokolls. Die Entwicklung dieses Protokolls wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (R01 AI135953 und AI138329, H.P.K.) und der National Heart, Lung and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 und U19 HL129902, H.P.K.), sowie NIH P51 OD010425 und teilweise durch das NIH/NCI Cancer Center, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. ist ein Markey molekulare Medizin Ermittler und unterstützt als erste Empfänger der José Carreras/E. Donnall Thomas Stiftungslehrstuhl für Krebsforschung und Fred Hutch-Stiftungsprofessur für Zellen und Gene Therapy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
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