Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Förberedelse och genmodifiering av Nonhuman Primate hematopoetiska stamceller och stamceller

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

Målet med detta protokoll är att isolera ickemänskliga primater CD34+ celler från primade benmärg, gen-ändra dessa celler med lentiviral vektorer, och att förbereda en produkt för infusion i autologa värden. Totala protokoll längd är ca 48 h.

Abstract

Hematopoetiska stamceller och stamceller (HSPC) stamcellstransplantation har varit en hörnsten behandling för leukemi och andra cancerformer i nästan ett halvt sekel, ligger bakom den enda kända botemedlet av humant immunbristvirus (HIV-1) infektion och visar enorma löfte i behandling av genetiska sjukdomar såsom beta-thalassemi. Vår grupp har utvecklat ett protokoll till modell HSPC genterapin i icke-mänskliga primater (NHPs), tillåter forskare att optimera många av samma reagenser och tekniker som används i kliniken. Här, vi beskriver metoder för rening av CD34+ HSPCs och långsiktiga framhärdande hematopoetiska stamceller (HSC) delmängder från primade benmärg (BM). Identiska tekniker kan användas för rening av andra HSPC källor (t.ex. mobiliserade perifera stamceller [PBSCs]). Beskrivs är en 2 dagars protokoll där är celler renas, odlade, modifierad med lentivirus (LV) och förberett för infusion tillbaka i autologa värden. Nyckeln avläsning av framgång inkluderar renheten av CD34+ HSPC befolkning, renat HSPCs förmåga att bilda morfologiskt skilda kolonier i halvfasta media, och, viktigast av allt, gen ändring effektivitet. Den viktigaste fördelen att HSPC genterapi är förmågan att ge en källa till långlivade celler som ger upphov till alla typer av hematopoetiska celler. Som sådan, har dessa metoder använts till modell behandlingar för cancer, genetiska sjukdomar och infektionssjukdomar. I varje fall upprättas terapeutisk effekt genom att förbättra funktionen av distinkta HSPC avkomma, inklusive röda blodkroppar, T-celler, B-celler eller myeloisk delmängder. Metoder att isolera, ändra och förbereda HSPC produkter är direkt tillämpliga och översättningsbara till flera sjukdomar hos patienter.

Introduction

Stem cell genterapi är ett kraftfullt sätt att hantera en lång rad mänskliga sjukdomar. HSPC genterapi är en särskilt attraktiv inställning, på grund av (i) den relativa lätthet att samla dessa celler från patienter, ii) mängden kunskap som finns om cell surface fenotyper och ex vivo kultur parametrar, och, som fältet expanderar, eftersom iii) det presenterar forskare med en ständigt ökande verktygslåda av genen modifiering strategier anpassade till olika sjukdomar av intresse. Vi undersöker aktivt HSPC gen terapi metoder från flera vinklar, inklusive grundläggande vetenskapen av HSPC biologi, engraftment av gen-modifierat HSPCs i prekliniska in vivo modeller och ansökan till relevanta patientgrupper. Vi och andra har präglat cell surface fenotypen av funktionellt distinkta HSPC delmängder1,2,3, mobilisering och förbehandlingsregimer som maximerar HSPC avkastning och engraftment samtidigt minimera toxicitet4,5och genen modifiering och genredigering strategier som har skräddarsytts till ett brett utbud av maligna, genetiska och infektionssjukdomar6,7,8, 9,10. Funktion och engraftment av gen-modifierat HSPCs kan utvärderas i ett antal små - och stora-djur modeller, inklusive möss, hundar och NHPs. NHP modeller är särskilt fördelaktiga eftersom många reagenser, till exempel antikroppar specifika för HSPC cell ytproteiner som CD34 och CD90, kan användas omväxlande i mänskliga och NHP celler. Dessutom, i motsats till möss, stora djur som NHPs medge en närmare uppskattning av omfattningen av genmodifiering behövs för klinisk effekt. Slutligen NHPs är den gyllene standarden för modellering av mänskliga sjukdomar såsom HIV-1 infektion11 och en framväxande modellsystem för kandidat mot cancer och anti-hiv immunterapier12,13.

Syftet med detta protokoll är att beskriva metoder för rening, genetiskt modifiera och förbereda NHP HSPC infusion produkter. Även om inte omfattas av detta protokoll, har vi tidigare visat att dessa produkter engraft i autologa NHP värdar, ge upphov till alla hematopoetiska härstamningar och ge terapeutisk effekt i ett brett spektrum av sjukdom modeller1. Vi har också karakteriserat clonality av implantation HSPCs och byggt en plattform för att spåra kinetik, människohandel och fenotyp av individuella HSPCs och deras avkomma, följande autolog transplantation1,14. De metoder som presenteras här har utvecklats med följande mål: i) att isolera högt rena HSPCs och långsiktig implantation HSC delmängder, ii) att upprätthålla primitiva Förenta under ex vivo kultur och iii) effektivt gen-ändra antingen bulk HSPCs eller långsiktiga implantation HSC delmängder. Vi anställer magnetiska-assisted cell-sortering (Mac), samt fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), för att isolera fenotypiskt/funktionellt distinkta HSPC populationer, överensstämmer med metoderna för många grupper2,15, 16. Underhåll av primitiva Förenta i kultur (dvs minimera differentiering av dessa celler i engagerade stamfäder som ger upphov till fullt differentierade lymfoida och myeloida delmängder) är en viktig aspekt av det protokoll som beskrivs här. Även om vi tidigare karakteriserat strategier för att utöka HSPCs samtidigt behålla en primitiv fenotyp17,18, här beskriver vi ett protokoll som fokuserar på att upprätthålla Förenta via en minimal (48 h) och definieras ex vivo kultur.

Effektiv ändringen av HSPCs och HSC delmängder är ett centralt mål i detta protokoll. Bland flera metoder vi har rapporterat, två är överlägset den mest undersökta i kliniska prövningen: LV-medierad genmodifiering och nuclease-medierad gen redigering1,6,19. Genredigering strategier använder en av ett antal nuclease plattformar specifikt ändra en riktade gen av intresse, till exempel C-C chemokine receptor typ 5 (CCR5) för behandling av HIV infektion7,19 eller Bcl11A för behandling hemoglobinopathies6. Här fokuserar vi på LV-medierad genmodifiering, där transgena laster integrera semirandomly i genomet1,8,20. En viktig fördel av LV metoder är förmågan att leverera stora mängder genetiskt material (upp till 8 eller 9 kilobases). Även om genredigering strategier utvecklas för att rikta en transgen av intresse att integrera endast på en viss locus av homologa givare rekombination (HDR), kräver dessa metoder ytterligare utveckling in vitro och i små djurmodeller. Däremot har LV vektorer använts flitigt i NHPs och patienter21,22. Ännu viktigare, kan i protokollet som beskrivs här, som använder primas BM som börjar HSPC källa, enkelt och allmänt anpassas, till exempel isolera PBSCs. Som beskrivits ovan, dra vi nytta av den höga graden av genetisk likhet mellan NHPs och människor att använda reagenser som gäller för båda arterna. Slutligen, detta tillvägagångssätt har anpassats för att ändra andra hematopoetiska delmängder, nämligen T celler12,23,24; tillkomsten av effektiv T-cell immunterapi metoder har förlitat sig tungt på samma LV plattform utnyttjas i detta protokoll. Dessa metoder är lämpliga för alla forskare som är intresserade av antingen HSPC biologi eller LV-medierad genmodifiering. Exempelvis HSPC rening protokollet presenteras här kunde användas för att karaktärisera roman HSC-berikad delmängder, som tidigare beskrivits1,15,25. Likaså den LV transduktion metoder som presenteras här kan på motsvarande sätt tillämpas och utvecklas ytterligare för många andra celltyper och experimentella frågor, både i in vitro- och in vivo modeller.

Sammanfattningsvis presenterar vi metoder för att isolera och genetiskt modifiera NHP HSPCs. Dessa metoder kan lätt anpassas för andra arter och andra källor av HSPCs. Detta noggrant kontrollerats protokoll visar mycket lovande i modellering av effektiva behandlingar för många mänskliga sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Autologa NHP transplantationer, priming (mobilisering), insamling av celler och genmodifiering genomförs konsekvent med tidigare publicerade protokoll26. Alla experimentella rutiner granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén för Fred Hutchinson Cancer Research Center och University of Washington (protokoll #3235 - 01). Alla studier genomförs i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health (”The Guide”); djur lottades till studierna.

1. berikning av CD34+ HSPCs och övernattning kultur (dag -1)

  1. Skörda BM och vårda den.
    1. Mobilisera NHPs med granulocyt granulocytkolonistimulerande faktor (GCSF) för 4 dagar som tidigare beskrivits26.
    2. Lugna djur med 100 mg/kg av ketamin och 0,03 mL/kg av dexmedetomidin (0,5 mg/mL lager). Administrera analgetika (t.ex. buprenorfin SR) vid tidpunkten för dragningen.
    3. Med hjälp av clippers, raka djurets hår från den proximala änden av humerus eller lårbenet benet(-en) och skrubba huden med jod-baserade scrub eller en liknande antiseptisk lösning, alternativ med alkohol, och upprepa 3 x. Som en ytterligare bedövning, ingjuta periostet med bupivakain (2 mg per plats, 5 mg/mL lager).
    4. Placera benmärg aspiration nålen (16 G) över webbplatsen periost inträde (medullär hålighet) och genomborrar huden, tränger den medullär hålighet med roterande rörelser. Avlägsna mandrängen aspiration nålspetsen och reservera den i ett sterilt fält för vidare användning.
      Obs: Välj webbplatsen periost inträde till märghålan i ett område av benet som inte omfattas av muskler och där formen/landskap av benet är antingen synligt eller kan kännas lätt genom huden (ofta mot den proximala eller distala änden av benet).
    5. BM nålen, fäster en förfylld spruta innehållande en blandning av antikoagulerande citrat glukoslösning (ACD-A) och heparin (20 USP/mL, 1 mL per 9 mL benmärg samlas).
    6. Dra kolven tillbaka medan försiktigt gungande extremiteten och rotera den, för att skaka sprutan för att blanda aspirera och antikoagulant. Rotera nålen och flytta det hela aspiration och uttag tillgång till en större andel av cellerna i benmärgen utrymmet.
    7. När provet är samlat, ta bort nålen och tryck till aspiration platsen tills blödningen upphör.
      Obs: Beroende på den volym som krävs, kan benmärg från en till fyra lemmar (två överarmsben, två lårbenet) dras under en enda samling. Mer än 20 mL bör samlas in från varje lem, och den totala volymen samlas in bör utgöra högst 10% av djurets vikt (10 mL/kg).
    8. Om får enkelarmade från flera lemmar, kombinera och spela in volymen.
    9. Låt den NHP återvinna postanesthesia.
      1. Upphäva effekterna av dexmedetomidin med 0,03 mL/kg atipamezol (5 mg/mL lager) efter ingreppet. Ge smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin SR) som föreskrivs av kliniska veterinärpersonal för minst 48 h efter ingreppet eller längre, efter bedömning av klinisk veterinär, baserat på kliniska tecken.
      2. Tillbaka djuret till dess buren efter ingreppet och övervaka det varje 15-20 min, tills djuret är kunna sitta på egen. Övervaka djuret dagligen av veterinär personal tills det bestäms att aspiration industriområden är läkt. Dessutom övervaka för tecken på inflammation, infektion eller smärta.
    10. I parallell till cell bearbetning, villkora det samma NHP med myeloablativ kroppens totala bestrålning (TBI): 1 020 cGy med en hastighet av 7 cGy/min. administrera bestrålning i fraktionerade doser under de 2 dagarna före cellen infusion.
  2. Hemolyze BM.
    1. Dela BM i 50 mL koniska rör (10-12 mL per rör) och lägga till Hemolytiskt buffert för att få volymen till 50 mL (tabell 1). Inkubera cellerna vid rumstemperatur (RT) tills de är lyserat men inte längre än för 7 min. Centrifugera vid 800 x g i 5 min och Aspirera supernatanten från den pellet(s), lämnar 2-5 mL volym/tube. Återsuspendera pelleten i den resterande volymen.
      Obs: Framgångsrikt lyserat prover ändra färg, från en mörkröd till en transparent ljus rött.
    2. Tillsätt 10-15 mL Hemolytiskt buffert/pellet. Ta bort eventuella blodproppar som använder 70 µm cell silar. Lägg till Hemolytiskt buffra upp till 50 mL, inkubera i 5 min på RT och snurra vid 800 x g i 5 min.
    3. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL av MACS buffert (tabell 1). Filtrera igen genom en sil med 70 µm i cellen. Skölj röret och filter det med 40 mL Macar buffra upp till 50 mL.
  3. Berika CD34+ celler från de hemolyserade vita blodkroppar (WBCs) använder standardprotokoll.
    1. Snurra cellerna vid 800 x g i 15 min. Kontrollera rören för att kontrollera att ingen cell virvlar är uppenbara i toppen/mitten. Om det finns celler ovanför pelleten snurra igen vid en högre hastighet (upp till 1 000 x g maximal) och för upp till 10 min.
    2. Aspirera supernatanten och återsuspendera det i 10 mL eller mindre av MACS buffert, att notera den exakta volymen. Räkna cellerna på en 1: 100 eller 1:1,000 utspädning med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
      Obs: Denna totala WBC räkning är antalet före berikning.
    3. Lägg till Mac-buffert för att cellkoncentrationen till 1 x 108 celler/mL. Om det behövs först Upprepa steg 1.3.1 - 1.3.2 (t.ex. på grund av en låg före berikning räkna). Reserv 5 x 106 celler i MACS buffert för HSC delmängd färgning (före berikning prov).
    4. Lägga till okonjugerat anti-CD34 antikropp (klon 12,8, Tabell för material)27 återstående före berikning celler till en slutlig koncentration på 40 µg/mL (1 x 108 celler/mL). Inkubera cellsuspension vid 4 ° C på en tube rotator (se Tabell för material) för 25-30 min.
    5. Använd Mac-buffert att få volymen till 50 mL och snurra cellerna vid 800 x g i 5 min. Aspirera supernatanten, resuspendera cellerna i 50 mL MACS buffert och snurra igen vid 800 x g i 5 min.
    6. Degas 100 mL MACS buffert med två filter tubes, inslagning luftintaget med vax papper, för 25-30 min eller tills klar att använda.
    7. Beräkna den nödvändiga volymen av magnetiska pärlor: 1 mL pärlor/109 celler. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna till 108 celler/mL, efter pärlorna läggs. Till exempel: 3 x 109 celler + 3 mL av pärlor + 27 mL Macar buffert till 30 mL av totala volymen.
    8. Inkubera cellsuspension vid 4 ° C på en tube rotator för 25-30 min.
    9. Under förvärva magneter för kolumner; tänker du använda 0,6 x 109 celler per kolumn. Placera kolumnerna på magneten och placera en 50 mL konisk tub nedanför varje kolumn att samla flödet genom. Förbereda en 15 mL koniska rör och kolven för varje kolumn för eluering (steg
    10. När ruvningen i steg 1.3.8 är klar, tillsätt MACS bufferten till 50 mL och snurra på 800 x g för 5 min. Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i avgasade MACS buffert (2 mL per kolumn). Pipetten försiktigt för att undvika att införa bubblor.
    11. Utan att låta kolumnen att köras torr, tillsätt 1 mL avgasade MACS buffert till varje kolumn, följt av 2 mL cellsuspension. Skölj filtret och ursprungliga tube med avgasade MACS buffert och dela upp lösningen lika mellan kolumner (6 mL/kolumn). Lägg sedan till 7 mL avgasade MACS buffert för den sista tvättningen.
    12. Dra kolumnen bort från magneten (push övre ryggen) försiktigt och samla in de sista droppet i genomflöde röret. Tillsätt 5 mL av avgasade MACS buffert till varje kolumn och använd kolven för att eluera cellerna i sterila koniska röret från steg 1.3.9. Samlar inte in någon vätska efter bubblor visas.
  4. Räkna cellerna i både den berikad och genomströmning (FT) samling rören vid en utspädningsfaktor på 1:10. Hålla cellerna på is. Alikvotens 1 x 106 celler från CD34-berikad bråkdel och 5 x 106 celler från de FT fraktionerna för analys med flödescytometri. Store FT fraktion vid 4 ° C tills kvalitetskontroll (steg 2) är avslutad.
    Obs: Antalet CD34+ celler som krävs för framgångsrik Multilinjärt engraftment i NHP är beroende av frekvensen av den HSC-berikad CD34+CD90+CD45RA– delmängd. Baserat på en genomsnittlig frekvens av 3% - 5% och den minsta kraven på 122.000 CD34+CD90+CD45RA– celler per kilogram av kropp vikt1, det är rekommenderat att gå vidare med sammanlagt minst 2,5 x 106 och upp till 10 x 10 6 CD34+ celler per kilo kroppsvikt.
  5. Lägg till Mac-datorer buffert till CD34+ berikad bråkdel till en 50 mL totalt, snurra vid 800 x g i 5 min, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna till 106 celler/mL i HSPC media (tabell 1).
    1. Platta celler med en täthet på 106 celler/mL i ventilerade, vävnad-kultur (TC)-behandlade T-75 kolvar, 10-20 mL per flaska och inkubera dem över natten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Vila kolvarna på längden (inte stående).
      Obs: Om så önskas ytterligare CD34+ celler eller CD34– FT kan fryst tillstånd i 90% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) + 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) vid en koncentration på 1 x 106 5 x 106 celler/ml, sedan långsam-kyld på - 80 ° C (t.ex. med frysning behållare). Den genomsnittliga återhämtning avkastningen av frysförvarade celler är beroende av CD34+ renhet och vanligen varierar från 50% till 80% med en livskraft > 80%.

2. kvalitetskontroll av CD34-berikad celler (dag -1)

  1. Förbereda prover för flödescytometri.
    1. Återsuspendera prover som reserverats från varje isolering steg som nämns ovan (före berikning, FT och CD34-berikad fraktioner) i FACS buffert vid en koncentration på 10 x 106 celler/mL och överför 100 µL av varje cellsuspension (tabell 1) till en FACS tube.
      Obs: Kontrollproverna bör omfatta ofärgade celler från varje isolering skede (t.ex. 5 x 105 celler) för justering av framåt scatter (FSC), side scatter (SSC) och autofluorescens i varje fluorescens-kanal. Singel-färgade ersättning pärlor för varje fluorokrom-konjugerad antikropp kommer dessutom behöva justera för kompensation mellan intilliggande kanaler (tabell 2 och tabell 3).
    2. Lägg till önskad antikroppar (t.ex. anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA och anti-CD90), enligt tillverkarens instruktioner, för ett test (1 x 106 celler i 100 µL) (tabell 3). Inkubera i 20 min vid 4 ° C. Tillsätt 3 mL FACS buffert och spinn vid 800 x g i 5 min, Aspirera supernatanten, Återsuspendera i 100 µL av FACS buffert och analysera på ett lämpligt flödescytometer (steg 2.2).
  2. Förbereda den flöde cytometer/cell Sorteraren för analys.
    Obs:     det rekommenderas att utföra analysen på samma maskin som ska användas för cellen sortera i steg 2,3.
    1. Generera ett protokoll inklusive FSC/SSC, CD45/CD34 och CD45RA/CD90 (tre flöde tomter). Högerklicka på en flöde tomt och Lägg till layouten befolkningen hierarki .
    2. Vänsterklicka på FSC/SSC tomten, Välj funktionen polygon gate och rita en grind för att utesluta skräp och döda celler. Markera den nya porten och döp om den till Scatter i granskningsfönstret.
      Obs: Detta betecknas automatiskt som P1.
    3. Högerklicka i mitten av CD45/CD34 flöde tomten, navigera till Visa populationeroch gate tomten på scatter. Rita en rektangulär grind runt CD45intCD34+ celler att exkludera icke-CD34 celler och nonhematopoietic celler, som väl som kvarstående trombocyter och erytrocyter (CD45–). Byt namn på porten till CD34+.
    4. Gate CD45RA/CD90 flöde tomten på CD34+ befolkning. Rita tre oberoende subgates runt CD90+CD45RA– celler (berikad för Förenta), CD90–CD45RA– celler (berikad för multipotenta och erythro-myeloida föräldraparets [MPPs/EMPs]) och CD90–CD45RA + celler (berikad för lympho-myeloida [arbetsmarknadspolitiska]). Byt namn på grindarna till HSC, MPP-EMPoch LMP, respektive.
    5. När du är klar, se till att befolkningen hierarki innehåller sex hierarkiskt organiserade poster i följande ordning: 1) alla händelser; (2) scatter; (3) CD34+; (4) HSC; (5) MPP-EMP; (6) LMP. Se till att flödet tomterna och formen på porten ser som illustreras i figur 4.
    6. Kör ofärgade före berikning WBCs för att justera spänningen för FSC, SSC och alla fluorescens kanaler (tabell 2, prov 5). Kör singel-färgade ersättning pärlor för att justera kompensationen mellan intilliggande kanaler (tabell 2, prover 1-4). Kör alla återstående ofärgade och färgade prover med den justerade och kompenseras protokoll, för att dokumentera CD34 anrikning effektivitet (tabell 2, prover 6-9).
      Obs: Hålla det slutliga provet (tabell 2, prov 10) för samtidig Flödesanalys och cellen sortera i steg 2,4.
  3. Konfigurera den cell Sorteraren för sortera-rening av CD34 delmängder till kolonibildande cell (CFC) analyser.
    Obs:     om en annan maskin har använts för analys (steg 2.2), ställa in protokollet om cellen Sorteraren som tidigare beskrivits 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Justera vinkel/spänningen för vänster - och höger strömmar i cell sorterare programvara sätta in celler på 15 mL rör som innehåller CFC medium. Konfigurera vinkeln på sida dataströmmen för att förhindra förskjutning. Överläggsgrafer, finjustera vinkeln på den utbuktande sida strömmen tills sorterade cellerna träffar CFC medium och inte sidan av röret eftersom mycket få celler sorteras.
    2. Öppna mappen globala kalkylblad i webbläsaren, och skapa en ny sorts-layout med hjälp av knappen i menyn längst upp i webbläsarfönstret. Ändra posten i samlingen enheten nedrullningsbara menyn till 2 rör, posten i Precision nedrullningsbara menyn till 4-vägs renhet eller enskild cell och ange målet händelserna till 800-1.200 celler. Vänsterklicka på fältet Sortera-läge (vänster eller höger), Välj den post lägga till i menyn och välja befolkningen att sortera från menyn.
  4. Sortera cellerna för CFC analyser.
    Obs:     sortering för CFC analyserna utförs endast med celler från CD34-berikad produkt (tabell 2, prov 10).
    1. Ladda prov 10, 2000-3000 händelser registreras och finjustera sortera grindarna för att passa de signal styrka och målet populationerna.
    2. När installationen är klar, förvärva celler (tabell 2, prov 10). Förvärva data enligt beskrivningen i steg 2.2.3, justera flödet till 500-1 000 celler/s och sortera 800-1.200 celler från i) Scatter porten, ii) CD34+ gate, iii) utfärda utegångsförbud för HSC, iv) MPP-EMP grinden och v) LMP grinden in separata rören som innehåller 3,6 mL CFC Media.
      Obs: Sortering för CFC analyser utförs endast med celler från CD34-berikad produkt (tabell 3, prov 10). Celler från Scatter och CD34+ grindar måste sorteras individuellt, medan Förenta, MPP-EMPs och arbetsmarknadspolitiska kan sorteras samtidigt in i vänster och höger tube hållare placerar.
    3. Vortex och fördela 1 mL cellsuspension till var och en av de 3 x 3,5 cm sterila, nontissue, kultur-behandlade petriskålar. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 10-14 dagar i en sekundär behållare (t.ex., en 15 cm petriskål).
    4. På dagarna 10-11 postplating, räkna enskilda kolonier från alla tre plattor per tillstånd, baserat på kolonin morfologi.

3. genmodifiering av CD34+ HSPCs och övernattning återhämtning (dag 0)

  1. Späd 2,5 mL av 1 µg/µL CH-296 lösning på 50 µg/mL i 50 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS, se Tabell för material).
  2. Förbereda kolvar för den LV transduktion.
    1. Avgöra det ungefärliga antalet nontissue-kultur (icke-TC)-behandlade kolvar som behövs (oftast från de blodkroppar som anges i steg 1.4). Planerar att tallrik 1 x 107 celler i 10 mL av media per T-75 kolv (1 x 108 totalt celler skulle kräva 10 kolvar) och inkluderar en icke-TC-behandlade 12-well platta (mock transduktion tillstånd). Lägga till sterila HBSS och 50 µg/mL CH-296 lager från steg 3.1 till varje kolv/platta, med en koncentration på 2 µg/cm2. För T-75 kolvar, använda 3 mL 50 µg/mL CH-296 + 7 mL HBSS; för 12-väl plåt, Använd 160 µL av 50 µg/mL CH-296 + 340 µL HBSS per brunn.
    2. Tillåta rätter att sitta ostört på RT på en ren bänk eller i huven för 2 h. aspirera på CH-296 och ersätta den med en liknande volym av steril HBSS + 2% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera vid RT i 30 min, aspirera HBSS/BSA och diska med en liknande volym av steril HBSS innehållande 2,5% 1 M HEPES, pH 7,0. Aspirera omedelbart före plätering cellerna (steg 3,4).
      Obs: Följande steg 3.2.2, tillåter inte plattor/kolvar att torka ut. Plattor som innehåller steril HBSS + 2,5% 1 M HEPES hålls vid 4 ° C över natten (dvs., förbereda dag -1).
  3. Skörda och transduce av CD34+ celler från dag -1.
    1. Skölj med 10 mL pipett löst vidhäftande celler av varje kultur kolv med steril HBSS Filtersköljningen upprepade, mild. Se till att alla celler kommer loss (om nödvändigt, tryck/slap kolven för att lossa cellerna).
    2. Centrifugera cellerna vid 800 x g i 5 min, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i transduktion media till en koncentration av 1 x 106 celler/mL. När alla celler har samlats, avgöra antalet cell, med en hemocytometer eller automatiserade cell räknare.
    3. Tillsätt 1 mL cellsuspension (1 x 106 celler) till en brunn av CH-296-coated 12-väl plattan (för det mock-sensorik stickprov). Dela resten av cellerna bland T-75 kolvar (steg 3.2.2), lägga till ca 10 mL (1 x 107 celler) per kolv. Att cellerna att följa CH-296 beläggning genom inkubation vid 37 ° C, 5% CO2 för 30 min, med mössor ventilerade.
    4. Tina virus-villkorade media (VCM, Tabell av material) och bestämma titern i infektiösa enheter per milliliter (IE/mL)28,29,30,31,32 . Tillsätt lämplig volym av VCM i varje T-75 kolv från steg 3.3.3 och inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2.
      Obs: Om en enda transduktion, inkubera över natten; om utför en dubbel transduktion, upprepa detta stepapproximately 6 - 8 h efter den första transduktion utan en tvätt/återhämtning fas och, sedan, inkubera över natten. Till exempel för en kolv (1 x 107 celler) med en önskad multiplicity av infektion (MOI) 10, tillsätt 1 mL av virus titrerade på 1 x 108 IU/mL.

4. cell skörd och beredning för Infusion (dag 1)

  1. Skörda cellerna.
    1. Samla Sensorik och håna celler som beskrivs i steg 3.3.1 - 3.3.2. Utföra sekventiella tvättar med 10 mL HBSS, överföra tvättarna till konisk röret med celler. Se till att alla celler har avlägsnats från kolvar, knacka/dunka kolvar vid behov.
    2. Centrifugera cellsuspensioner vid 800 x g i 5 min, Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL HBSS. Kombinera rören som innehåller celler från samma skick. Skölj med 10 mL HBSS och tillägga att cellsuspensionen. Fastställa de blodkroppar som använder en hemocytometer. Ta den totala cellvolym till 50 mL HBSS och centrifugera vid 800 x g under 5 minuter.
  2. Puls prostaglandin E2 (PGE2) och förbereda reagenser för infusion produkten.
    1. Aspirera supernatanten och återsuspendera transduced celler (inte håna) till 5 x 106/ml i HSPC media utan cytokiner. Lägga till 10 mM PGE2 till en slutlig koncentration av 10 µM. Inkubera cellerna på is för 2 h, försiktigt snurra dem varje 30 min.
    2. Under steg 4.2.1, värme-inaktivera autologt serum (Tabell för material), inslagning behållaren i vax papper och inkubation det på 56 ° C i 30 min. Förbered 2% autologt serum i HBSS (500 µL av Värmeinaktiverade serum + 24,5 mL HBSS), blanda dem väl, och Förvara blandningen på is fram till användning. Också, under steg 4.2.1, skörda mock-sensorik celler i en 12-well platta av pipettering cellerna upp och ner kraftigt. Tillsätt cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör, tvätta dem 3 x med 1 mL HBSS, och lägga tvättarna till samma 15 mL koniska rör.
    3. Efter 2 h PGE2 inkubation, tvätta cellerna 2 x genom centrifugering dem vid 800 x g i 5 min och kasta bort supernatanten. Efter den andra tvätten, resuspendera cellerna i en lämplig volym av HBSS för inventering, med en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
      Obs: Cellerna klumpar ofta efter en PGE2 puls, som kan göra för mindre tillförlitliga blodkroppar. I så fall använda celltalet från steg 4.1.2 istället för den från steg 4.2.3.
  3. Reservera håna och sensorik celler för kvalitetskontroll (steg 5) produktens infusion: 5 x 105 till 1 x 106 celler för flöde flödescytometri deponicell sortering (steg 5.1 och 5.3) och ca 1 x 106 celler för flytande kultur (steg 5.2) och kolonin polymeraskedjereaktion (PCR) (steg 5,4).
  4. Förbereda infusionen produkten.
    1. Med resten av transduced celler, utföra en tredje tvätt i 50 mL HBSS, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL HBSS + 2% autologt serum (bereddes i steg 4.2.2). Dra den 10 mL lösningen i en 20 mL spruta med en 16,5 G nål. Tvätta röret med 10 mL HBSS + 2% auto serum och dra in tvätten i samma spruta för att få den totala volymen till 20 mL. Förslut sprutan med nålskyddet, märk sprutan och placera den på is för transport/infusion.
    2. Ingjuta sensorik cell produkten i autologa värden ligger inom en anläggning för ackrediterade djurförsök och via en central venkateter33,34. Övervaka transplanterade djurens komplett blodkroppar (CBCs) och blod kemiska sammansättningar och utföra studie-specifik gen-märkning analyser skräddarsydda till projektet1,6,19.

5. kvalitetskontroll

Obs: Flödescytometri och cell sortering utförs efter cellerna är infunderas i djuren som del av den uppföljning som beskrivs i steg 4.4.2. Flödescytometrisk flödesdata används omedelbart efter transplantation för att bestämma sammansättningen av fenotypiskt definierade stamceller och stamceller cell delmängder i infusion produkten (steg 5.1 och 5.3), medan analysen av CFC-analyser utförs 12-14 dagar postinfusion att bestämma genmodifiering effektiviteten av kolonin PCR (steg 5,4).

  1. Utföra flödescytometri och CFC sortering av produktens infusion.
    1. Analysera cellerna genom flödescytometri och sortera-rena CD34 undergrupper för CFC analyser, som beskrivs i avsnitt 2. Utsäde CFC-analyser från håna och sensorik CD34 celler (infusion produkten efter PGE2 puls).
    2. Sortera högst 800 celler per skick, vortex, plattan, kultur, och räkna CFC analyser som beskrivs i steg 2,4. Efter inventering, plocka kolonierna från CFC analyserna att utföra kolonin PCR som beskrivs i steg 5,4.
  2. Flytande kultur
    1. Platta celler för flytande kultur i HSPC media på 1 x 106/ml i icke-TC-behandlade plattorna. På dagar 2, 5 och 12 posttransduction, skörd och räkna cellerna för flödescytometri. Cell sortering för CFC analyser krävs inte.
    2. På dag 2 och 5, replate 33% av cellerna i färsk HSPC media på6/1 x 10 ml. Frysa 33% av cellerna i DNA extraktion buffert för kvantitativ realtids-PCR. Använda 33% av cellerna för flödescytometri som beskrivs i steg 2.1 och 2.2.
    3. Använd dessa data från steg 5.2.2 för att analysera fenotypiska sammansättningen av hematopoetiska avkomma. Bestämma frekvensen av CD34 + celler och fenotypiskt definierade undergrupper som beskrivs i 2.2.2 steg inom varje prov. Jämföra sammansättningen av CD34+ celler mellan villkor för att bestämma effekten av genmodifiering.
      Obs: CD34+ celler bör upprätthålla sina uttryck i hela hela kulturen och innehålla alla fenotypiska grupper. En förlust av CD90+CD45RA– celler eller en överrepresentation av fenotypiska grupper kan indikera indirekta eller direkta effekter av genmodifiering.
  3. Kvantifiera transgenens uttryck (e.g., grönt fluorescerande protein [GFP]) av flödescytometri (valfritt och beroende på experimentella inställningarna), anpassning av protokollet från steg 2.2.
    1. Lägg till tre flöde tomter visar SSC/transgenens (t.ex. SSC/GFP). Gate den första tomten på Förenta, andra på MPPs-EMPs och tredje på arbetsmarknadspolitiska. tomt varje kontra transgenens (t.ex. god Jordbrukarsed) och skapa gates namnet HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+och LMP-GFP+, respektive.
    2. När du är klar, befolkningen hierarki måste innehålla nio hierarkiskt organiserade poster i följande ordning: 1) alla händelser; (2) scatter; (3) CD34+; (4) HSC; (5) HSC-GFP+; (6) MPP-EMP; (7) MPP-EMP-GFP+; (8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Obs: Alla transgenens uttryck senare i flytande kultur (t.ex. dag 5 och 12) kommer att bättre spegla gene modifiering effektivitet bestäms av kolonin PCR i steg 5,4. Tidigare tidpunkter i flytande kultur kan överskatta transgenens uttryck, på grund av ointegrerade LVs. Likaså kommer att flöde-sortering GFP+ celler för CFC analyser på dag 1 resultera i många falskt positiva kolonier.
  4. Utföra kolonin PCR.
    1. Efter rösträkningen i steg 2.4.4 och 5.1.1, plocka enstaka kolonier till 50 µL av DNA extraktion buffert, använder en 10 µL eller 20 µL Pipettera och Pipettera upp och ner för att överföra kolonierna till en tub med en 8-tube PCR strip cap. Plocka åtta kolonier från villkoret håna och 88 kolonier från transduced villkora att generera en fullständig 96-bra platta. Tillsätt 50 µL av DNA extraktion buffert till varje brunn.
    2. Extrahera DNA från kolonierna, använder en termocykler och följande program: 65 ° C i 20 min, 99 ° C i 10 min och en 4 ° C håller. Tänker du flytta DNA till-20 ° C så snart som möjligt för optimal kvalitet.
    3. Utföra kolonin PCR att kvantifiera LV-sensorik celler, jämföra antalet LV+ kolonier, använder Lenti F/R primers, till totalt kolonier, använder aktin F/R och kontroll primers (Tabell för material).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det protokoll som beskrivs ovan är utformad för att isolera och gen-ändra NHP CD34+ HSPCs, som kan därefter infunderas tillbaka till autolog värden (figur 1 och figur 2). När du följer detta protokoll, vi få brukar upp till 8 x 109 totala WBCs från primade BM från tofsar makaker och, ibland, dubbla beloppet från rhesus makaker. Hos båda arterna, antalet CD34+ HSPCs som vi berikar är proportionell till ingången på den totala WBC-räkningen (figur 3). Tidigare fynd visar att den totala CD34+ HSPC produkten innehåller celler som inte är sant, långsiktig implantation Förenta. därav, vi har utvecklat flow-flödescytometri-baserade tekniker (figur 4) och använda CFC analyser (siffrorna 5-6) för att identifiera långsiktiga Förenta och engagerade stamceller delmängder i kulturer. Till skillnad från Sant Förenta kvarstår engagerade stamfäder för en relativt kort tidsperiod invivo. Slutligen, LV-medierad gen ändring strategi resultaten i robust gen märkning i odlade CD34+ HSPCs. Dessa celler övervakas över upp till 2 veckor i kultur, delvis för att minska antalet ”falskt positiva” celler som uttrycker GFP från mjukvarupaket LV vektorer. Eftersom dessa celler inte bär en stabilt integrerad kopia av LV vektorn i den cellulära arvsmassan, kommer de späda ut över 12 dagar flytande kultur analysen (figur 7).

Figure 1
Diagram 1: produktion av en autolog, gen-modifierade NHP HSPC produkt. Protokollet isolerar CD34+ HSPCs (dag -1), gen-ändrar dessa celler (dag 0) och förbereder en infusion produkt (dag 1) över en 48 h tid kurs. Kolonin bildandet, flytande kultur, och relaterade ex vivo analyser fortsätta i ytterligare 2 veckor, för att karaktärisera dessa produkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: tidslinje av händelser. Genomsnittlig tid för att utföra varje enskilt steg i protokollet, under cirka 2 dagar. Tidpunkten för enskilda stegen varierar beroende på stamceller källan (steg 1 i protokollet) och/eller typen av genmodifiering (steg 3 i protokollet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: vita blodkroppar och CD34 avkastning från primade tofsar och rhesus makaker benmärg. Berikad CD34+ HSPC räknar (steg 1.4 i protokollet) som en funktion av totala vita blodkroppar (steg 1.3.3 i protokollet) från 10 tofsar Makaker (torg) och sex rhesus Makaker (trianglar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Gating strategi för kvalitetskontroll av CD34-berikad och gen-modifierade produkter. Totala vita blodkroppar (”före anrikning”) och därefter CD34-berikade HSPCs färgas med antikroppar specifika för CD34, CD45, CD90 och CD45RA, för att kvantifiera antalet HSC-, MPP-, EMP- och LMP-berikad CD34 delmängder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: morfologi av CD34+ celler före och efter genmodifiering. Topp paneler: tre representativa brightfield bilder från HSPC koloni analyser. Botten paneler: GFP fluorescens motsvarar varje brightfield bild ovan. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: kolonibildande cell (CFC) potential av CD34+ celler och sortera-renat deluppsättningar. Efter sortera rening för CFC-analyser från HSPC delmängder dag -1 (avsnitt 1 och 2 i protokollet) och dag 1 (avsnitt 5 i protokollet), enstaka kolonier poängsätts baserat på morfologiska kännetecken. CFU-MIX = blandning av myeloisk (vit) och erytroid (röd) celler. BFU-E = endast erytroid celler; CFU-G = granulocyter; CFU-GM = granulocyter och makrofager/monocyter; CFU-M = makrofager/monocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa flödesdata flödescytometrisk från gen-modifierade celler i flytande kultur. Procentandel av CD34+ HSPCs efter transduktion med en GFP-uttryckande LV vektor. Celler odlas i upp till 2 veckor efter transduktion. En minskning av GFP+ händelser över tid avspeglar en förlust av GFP signal från celler som bär mjukvarupaket LV vektorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namn Innehåll
Hemolytiskt buffert 150 mM ammoniumklorid, 12 mM natriumbikarbonat, 0,1 mM EDTA i dubbeldestillerat vatten (ddH2O)
Kommersiella buffert Fosfatbuffrad saltlösning (1 X) pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
FACS buffert Fosfatbuffrad saltlösning (1 X) pH 7,2, 2% fetalt bovint Serum
HBSS + 2% BSA Hanks balanserad saltlösning, 2% bovint serumalbumin
HSPC Media StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL varje rekombinant humant TPO, SCF, FLT-3
Transduktion Media StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL varje rekombinant humant TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL ciklosporin, 4 ug/mL protaminsulfat

Tabell 1: Buffert och media formuleringar.

ID PE PECF594 APC-Cy7 V450 Beskrivning
1 CD90 Ersättning pärlor
2 CD34 Ersättning pärlor
3 CD45RA Ersättning pärlor
4 CD45 Ersättning pärlor
5 Ofärgade WBCs innan CD34-anrikning
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 Färgade WBCs innan CD34-anrikning
7 Ofärgade WBCs av genomströmmande (FT)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 Färgade WBCs av genomströmmande (FT)
9 Ofärgade WBCs av CD34-berikad produkt
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 Målat WBCs av CD34-berikad produkt

Tabell 2: Representativa flöde panel för kvalitetskontroll av produkter CD34-berikad och gen-modifierade celler.

Antigen Klon Fluorokrom Laser Filtret
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 nm
CD90 5.00E + 10 PE 488 nm eller 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 nm eller 532 nm 610/20 nm
CD45RA 5H 9 APC-Cy7 633 nm 780/60 nm
V450: violett 450 nm. PE: Fykoerytrin; PE -CF594: varumärke namn från Biotium; APC: Allophycocyanin-cyanin 7

Tabell 3: Antikropp-färgning panel för kvalitetskontroll av flödescytometri och cell sortering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV vektor engineering är metoden bäst kännetecknas gen-ändra celltyper som CD34+ HSPCs, för efterföljande transplantation invivo. Protokollet beskrivs här är utformad för att maximera antalet gen-modifierat HSPCs som kvarstår långsiktiga i vivo, och ger kliniska fördelar för patienter med olika maligna, infektiös och genetiska sjukdomar. Även om genredigering strategier har dykt upp under det senaste decenniet, LV-modifierade celler är bäst studerade in vitro i djurmodeller och i patienter1,8,20,21,22.

Baserat på vår omfattande erfarenhet med detta protokoll, berikning av ren CD34+ HSPCs (dvs. > 80% av CD34+ celler i produktens sorterade cell) är en viktig aspekt för framgång. Eftersom dessa celler härrör från en blandad befolkning av totala BM WBCs, kan låg-renhet kulturer innehålla celler som inte kommer engraft långsiktigt, i sin tur sänka dosen av sann stamceller som är infunderas i autologa värden. Dessutom säkerställer hög kvalitet LV VCM högsta effektivitet av genmodifiering.

Att åtgärda brister i renhet av berikade CD34+ HSPC produkter, är det ofta användbart att validera kvaliteten på de reagens som används för att isolera dessa celler, nämligen den anti-CD34 antikropp (som vår grupp renar internt från en hybridom cellinje), och magnetiska pärlor som binder antikropp-märkt celler. Vi rekommenderar en MOI 10, med möjlighet att upprepa denna transduction (MOI 10 x 2). Ännu viktigare, bestämmas MOI empiriskt, efter en kvalitetsbedömning av VCM, inklusive titrering av varje vektor på en standardiserad patientserumprov cellinje såsom HT108029. Ännu viktigare, kan olika VCM-producerande laboratorier använder distinkta patientserumprov cellinjer, inklusive HOS30, HeLA31och 293T32, vilket kan begränsa möjligheten att jämföra antikroppnivåer mellan faciliteter. Vi föredrar att retiter en vektor med analys, för att beräkna den mest exakta mängden VCM effektivt gen-ändra CD34+ HSPC rikta celler. En gång högkvalitativa CD34+ HSPCs och VCM har erhållits, transduktion effektivitet och engraftment är ytterligare förstärkta i tre olika steg. Först, tillägg av ciklosporin transduktion media aids i de tidiga stegen i vektor transduktion och integration i målet celler35,36, medan protaminsulfat minskar motbjudande tvingar mellan lentiviral vector partiklar och cellen ytbehandlar33,37. Andra behandling av plattor med en rekombinant Fibronektin fragment (t.ex. RetroNectin, CH-296) ökar transduktion effektiviteten och förbättrar också gen-modifierat HSPCs 33,38, invivo engraftment potential 39. Särskilt, tyder tidigare studier på att CH-296 endast är viktigt under, men inte innan, transduktion33,38. Slutligen, vi puls gen-modifierade celler produkter med PGE2 att förbättra engraftment och persistens i vivo, som har tidigare visats för mänskliga och icke-mänskliga primater CD34+ HSPC produkter40,41.

LVs integrerar slumpmässigt i genomet, liksom sin föregångare, gammaretroviral vektorer (RVs). Även mindre kliniska prövningsdata är tillgänglig för LVs än för husvagnar, tyder aktuella fynd på att LV metoder medför betydligt lägre risker av cell omformningar på grund av LV: s insertionsmutationer; RV strategier används mindre ofta på grund av denna risk42. En ytterligare begränsning är att effektiviteten av genmodifiering är mindre än 100% och en andel av gen-modifierade celler finns inte kvar i vivo. Exempelvis en 60% gen-modifierat HSPC produkten kan resultera i 30% långsiktig implantation, gen-modifierade celler. Om möjligt är de gen terapi strategier som presenteras här utformade för att kringgå den här begränsningen genom att införa transgener som tillhandahåller terapeutisk effekt, även när uttryckt i en minoritet av hematopoetiska-ursprung celler8,43 .

Framtiden är ljus för LV-baserade HSPC modifiering metoder. Vi använder rutinmässigt detta protokoll att ”gen-märke” celler, aktivera spårning i vivo1. Vi har också anpassat denna strategi för att jämföra LV varianter inom samma djur. Sådana ”konkurrerande” transplantationer möjliggöra en jämförelse av olika vektorer (t.ex. att identifiera dem med bättre effektivitet) och transgener (t.ex. att spåra olika HSPC undergrupper eller jämföra dem i sjukdomsmodeller). Går framåt, tror vi att LV genterapi i HSPCs kommer att förbli ett viktigt verktyg tillsammans med genredigering tillvägagångssätt, särskilt i situationer där stora genetiska laster stabilt måste uttryckas för livslängden för en individ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Helen Crawford för att förbereda detta manuskript, Jim Woolace för grafisk design, och Veronica Nelson och Devikha Chandrasekaran för att delta i utvecklingen av protokollet. Utvecklingen av detta protokoll stöds genom bidrag från NIH nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (R01 AI135953 och AI138329 till H.P.K.) och den nationella hjärta, Lung- och Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 och U19 HL129902 till H.P.K.), samt NIH P51 OD010425 och, delvis genom NIH/NCI cancercentrum, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. är en Markey molekylär medicin utredare och fick stöd som konstituerande mottagare av José Carreras/E. Donnall Thomas begåvad stolen för cancerforskning och Fred Hutch begåvad stolen för Cell- och Gene Therapy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

Genetik fråga 144 hematopoetiska stamceller och stamceller celler genterapi blodbildning ickemänskliga primater modell cell isolering lentiviral vektorer
Förberedelse och genmodifiering av Nonhuman Primate hematopoetiska stamceller och stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter