Summary
Цель настоящего Протокола заключается в изоляции нечеловеческие приматов CD34+ клеток от загрунтовать костного мозга, ген изменить эти клетки с лентивирусные векторы и подготовить продукт для вливания в аутологичной хозяина. Длина общего протокола составляет около 48 часов.
Abstract
Трансплантация гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) был краеугольным камнем терапия лейкемии и других раковых заболеваний для почти половины столетия, лежит в основе только известного лечения заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и показывает огромные перспективы в лечение генетических заболеваний, таких как бета-талассемия. Наша группа разработала протокол к модели HSPC генной терапии в нечеловеческих приматов (Евросоюзе), позволяя ученых оптимизировать многие из те же реагенты и методы, которые применяются в клинике. Здесь мы описываем методы для очистки CD34+ HSPCs и долгосрочные сохранение подмножества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) загрунтовать костного мозга (БМ). Идентичные методы могут быть использованы для очистки других HSPC источников (например, мобилизованных периферической крови стволовые клетки [PBSCs]). Приводится 2 день протокол, в котором клетки очищенный, культивированный, изменение с человека (LV) и подготовил для инфузии обратно в аутологичной принимающей. Ключевые индикацию успеха включают в себя чистоту CD34+ HSPC населения, очищенный HSPCs способность образовывать морфологически различные колонии в полутвердых средств массовой информации и, самое главное, эффективности генной модификации. Ключевым преимуществом HSPC генной терапии является способность предоставлять источник долгоживущих клеток, которые порождают все типы гемопоэтических клеток. Таким образом эти методы использовались для модели лечения для рака, генетических заболеваний и инфекционных заболеваний. В каждом случае Терапевтическая эффективность устанавливается путем усиления функции различных HSPC потомства, включая красные кровяные клетки, Т-клетки, клетки B или миелоидной подмножеств. Методы для изоляции, изменять и подготовить HSPC продукты непосредственно применимыми и переводимых для множественных заболеваний человека больных.
Introduction
Генная терапия стволовой клетки является мощным средством для решения широкого круга человеческих патологий. HSPC генная терапия является особенно привлекательным подход, благодаря i) относительная простота сбора эти клетки от больных, ii богатство знаний, которая доступна относительно клеток поверхности фенотипы и ex vivo культуры параметры и, как и поле расширяется, потому что iii) он представляет ученых с возрастающей toolbox генной модификации стратегий с учетом различных заболеваний, представляющих интерес. Мы активно изучаем HSPC генной терапии подходы с нескольких точек зрения, включая основные науки HSPC биологии, приживления генно модифицированных HSPCs в доклинических моделях в естественных условиях, и применение соответствующих групп пациентов. Мы и другие характеризовали поверхности фенотипа клетки функционально различных HSPC подмножеств1,2,3, мобилизации и принадлежности схем, которые максимально HSPC урожайности и приживления при минимизации токсичности4,5и генной модификации и Джин редактирования стратегии, которые были адаптированы к широкий спектр злокачественных, генетических и инфекционных заболеваний6,,78, 9,10. Функция и приживления генно модифицированных HSPCs может быть оценен в ряд малых и крупных животных моделей, включая мыши, собаки и Евросоюзе. В частности NHP модели выгодно, потому что многие реагентов, например, антител специфических для HSPC клеток поверхности белки как CD34 и CD90, могут использоваться попеременно в человека и NHP клетки. Кроме того в отличие от мышей, крупных животных, таких как Евросоюзе позволяют приближением шкалы генной модификации необходимые для клинической эффективности. Наконец Евросоюзе являются золотым стандартом для моделирования человеческих патологий, таких как ВИЧ-1 инфекции11 и формирующейся модели системы для кандидата противоопухолевой и анти-ВИЧ immunotherapies12,13.
Целью настоящего Протокола является наметить методы для очистки, генетического изменения и подготовку NHP HSPC инфузии. Хотя в сферу применения настоящего Протокола, мы ранее показали, что эти продукты привито в аутологичной NHP хостов, порождают все гемопоэтических линии и предоставлять терапевтическую эффективность в широкий спектр болезней модели1. Мы также характеризуется clonality голокоренные HSPCs и построил платформу для отслеживания кинетики, торговлей и фенотип отдельных HSPCs и их потомства, следующие аутологичной трансплантации1,14. Представленные здесь методы были разработаны с целью: i) чтобы изолировать высоки чисто HSPCs и долгосрочный голокоренные HSC подмножеств, ii) для поддержания примитивных СКК во время ex vivo культуры и iii) эффективно ген изменить либо массовая HSPCs или долгосрочный отлаживание HSC подмножеств. Мы используем магнитные помощь сортировки клеток (ПДК), а также активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS), чтобы изолировать фенотипически/функционально различных HSPC населения, в соответствии с методами многих групп2,15, 16. Поддержание примитивных СКК в культуре (то есть, минимизации дифференцировка этих клеток в совершено прародителей, которые порождают полностью дифференцированной лимфоидных и миелоидного подмножеств) является важным аспектом протокола, описанных здесь. Хотя мы ранее характеризовались подходы к расширению HSPCs при сохранении примитивных фенотип17,18, здесь, мы описываем протокол, который фокусируется на поддержание СКК через минимальный (48 ч) и определены ex vivo культуры.
Эффективное модификации HSPCs и HSC подмножества является главной целью настоящего Протокола. Среди нескольких подходов, мы уже сообщали, два являются на сегодняшний день наиболее исследованных в клинических испытаниях: LV-опосредованной генной модификации и нуклеиназы опосредованной гена редактирования1,6,19. Джин редактирования стратегии использовать один из ряда нуклеиназы платформ для специально изменения целевого гена интереса, например, C-C хемокиновых рецепторов типа 5 (CCR5) для лечения ВИЧ инфекции7,19 или Bcl11A для лечения hemoglobinopathies6. Здесь мы сосредоточены на LV-опосредованной генной модификации, в котором трансгенных грузов интегрировать semirandomly в геном1,8,20. Ключевым преимуществом LV подходов является возможность доставить большое количество генетического материала (до 8 или 9 kilobases). Хотя Джин редактирования стратегии разрабатываются Целевой трансген, представляющие интерес для интеграции только в указанном локусе гомологичных доноров рекомбинации (HDR), эти методы требуют дальнейшего развития в пробирке и в небольших животных моделях. В отличие от LV векторов широко использовались в Евросоюзе и пациентов21,22. Важно отметить, что протокол, описанных здесь, который использует загрунтовать BM как отправной HSPC источника, может быть легко и широко адаптирована, например, изолировать PBSCs. Как описано выше, мы воспользоваться высокой степени генетического сходства между Евросоюзе и людей использовать реагенты, которые применимы для обоих видов. Наконец этот подход был адаптирован для изменения других гемопоэтических подгруппы, а именно T клетки12,,2324; с появлением эффективных подходов Т-клеточной иммунотерапии полагались на той же платформе LV, используемые в настоящем Протоколе. Эти методы являются подходящими для любой исследователь заинтересован в биологии HSPC или LV-опосредованной генной модификации. Например, протокол очистки HSPC, представленные здесь могут использоваться для характеристики Роман HSC-обогащенный подмножеств, как описано ранее в1,15,25. Аналогичным образом LV трансдукции, что представленные здесь методы могут также применяться и дальнейшее развитие для многих других типов клеток и экспериментальных вопросов, как в модели в vitro и in vivo.
Таким образом мы представляем методы изолировать и генетически модифицировать NHP HSPCs. Эти методы могут быть легко адаптированы для других видов и других источников HSPCs. Этот тщательно исследованные протокол показывает большие надежды в моделировании эффективной терапии для многочисленных заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Аутологичной трансплантации NHP, грунтовка (мобилизации), коллекции клеток и генной модификации, проводятся в соответствии с ранее опубликованные протоколы26. Все экспериментальные процедуры рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использования Комитетом центр исследования рака Фреда Хатчинсона и Университет Вашингтона (протокол #3235 - 01). Все исследования проводятся в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здравоохранения («Guide»); животные были рандомизированы для исследования.
1. обогащение CD34+ HSPCs и на ночь культуры (день -1)
- Урожай BM и условие его.
- Мобилизовать Евросоюзе с гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Африканское) за 4 дня, как было описано ранее26.
- Степенный животных с кетамина 100 мг/кг и 0,03 мг/кг dexmedetomidine (0,5 мг/мл бульона). Применять анальгетики (например, бупренорфин SR) во время розыгрыша.
- Использование кусачки, брить волосы животного от проксимального конца плечевой кости и/или бедренной bone(s) и вымыть кожу скраб на основе йода или же антисептическим раствором, чередуются с алкоголем и повторять 3 x. Как дополнительной анестезии наполнить надкостницы с бупивакаин (2 мг на сайте, 5 мг/мл бульона).
- Наведите костного аспирационная игла (16 G) периостальная запись сайта (медуллярного полость) и проколоть кожу, проникая медуллярного полости с помощью вращая движение. Удаление стилет аспирационная игла и зарезервировать его в стерильных поле для дальнейшего использования.
Примечание: Выберите сайт периостальная вход к полости мозгового в районе кости, которая не охватывается мышцы и где форма/пейзаж кости либо видимых или может быть легко чувствовал через кожу (обычно в конце проксимальных и дистальных костей). - В BM иглы, прикрепить предварительно заполненный шприц, содержащие смесь раствора декстрозы антикоагулянт цитрат (ACD-A) и гепарина (20 USP/мл, 1 мл на 9 мл костного мозга, чтобы быть собраны).
- Потянуть поршень обратно осторожно тряся конечности и поворачивая ее, чтобы агитировать шприц смешивать аспирата и антикоагулянта. Поверните иглу и переместить его на протяжении аспирации и вывода для доступа к больший процент клеток костного мозга пространстве.
- После проб, удалите иглу и применить давление на стремление сайт до остановки кровотечения.
Примечание: В зависимости от объема необходимых костного мозга от одного до четырех конечностей (два электрошокер, два бедра) может быть задействован в одной коллекции. Не более чем 20 мл должны быть собраны из каждой конечности, и общий объем собранных должны составлять не более 10% от веса животного (10 мл/кг). - Если получение пунктаты от нескольких конечностей, объединить и фиксируют объем.
- Пусть postanesthesia восстановить НПЗ.
- Ликвидировать последствия dexmedetomidine с Атипамезола 0,03 мг/кг (5 мг/мл бульона) после процедуры. Обеспечивают анальгетиков (например, бупренорфин SR) как предписано клинической ветеринарной сотрудников для по крайней мере 48 часов после процедуры или больше, на усмотрение клинических ветеринар, основанные на клинических признаков.
- Вернуть его домой клетка животного после процедуры и контролировать его каждые 15-20 мин, пока животное не сможет сидеть своих собственных. Мониторинг животных ежедневно ветеринар сотрудников до тех пор, пока он определяется, что стремление сайтом исцелились. Кроме того монитор для каких-либо признаков воспаления, инфекции или боль.
- Параллельно для обработки клеток, условие же NHP с myeloablative облучение всего тела (TBI): 1020 КГИ в размере 7 СГР/мин администрирование облучения в дозах, фракционированный за 2 дня перед вливанием клеток.
- Hemolyze BM.
- Разделите БМ на 50 мл конические трубы (10-12 мл трубки) и добавить гемолитический буфера довести объем до 50 мл (Таблица 1). Инкубируйте клетки при комнатной температуре (RT), пока они лизированных, но не более чем на 7 мин центрифуги на 800 x g 5 мин и аспирационная супернатант от pellet(s), оставляя 2-5 мл тома/трубки. Ресуспензируйте гранулы в остаточный объем.
Примечание: Успешно лизированных образцы изменить цвет, от темно-красного до прозрачной светло-красный. - Добавьте 10-15 мл гемолитический буфера/гранул. Удалите любые сгустки крови, с использованием 70 мкм ячейки сита. Добавить гемолитический буфера до 50 мл, Проинкубируйте 5 мин на RT и спина на 800 x g за 5 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл MACS буфера (Таблица 1). Фильтр снова через стрейнер ячейки 70 мкм. Промойте трубку и фильтр с 40 мл MACS буфера до 50 мл.
- Разделите БМ на 50 мл конические трубы (10-12 мл трубки) и добавить гемолитический буфера довести объем до 50 мл (Таблица 1). Инкубируйте клетки при комнатной температуре (RT), пока они лизированных, но не более чем на 7 мин центрифуги на 800 x g 5 мин и аспирационная супернатант от pellet(s), оставляя 2-5 мл тома/трубки. Ресуспензируйте гранулы в остаточный объем.
- Обогатить CD34+ клеток от Опаковые белых клеток крови (лейкоцитов) с помощью стандартных протоколов.
- Вращайте клетки на 800 x g для 15 минут проверить трубы, чтобы убедиться, нет клеток сучки очевидны в середине верхней. Если клетки присутствуют выше гранулы, спина снова на более высокой скорости (до 1000 x g максимальная) и до 10 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте в 10 мл или меньше ПДК буфера, отмечая точный объем. Подсчет ячеек при разбавлении 1: 100 или 1:1,000, с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
Примечание: Это общее количество Лейкоцитов является граф предварительного обогащения. - Добавьте буфер MACS довести концентрацию клеток до 1 x 108 клеток/мл. В случае необходимости, сначала повторите шаги 1.3.1 - 1.3.2 (например, из-за низкой количество предварительного обогащения). Заповедник 5 х 106 клеток в буфере MACS для подмножества HSC, окрашивание (образец предварительного обогащения).
- Добавьте неконъюгированной анти CD34 антитела (клон 12.8, Таблица материалов)27 оставшихся предварительного обогащения клеток до конечной концентрации 40 мкг/мл (1 x 108 клеток/мл). Инкубировать суспензию клеток на 4 ° C на вращателе трубки (см. Таблицу материалов) для 25-30 мин.
- Использование MACS буфера доводят объем до 50 мл и спина клетки на 800 x g 5 мин аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте клетки в 50 мл MACS буфер и спина снова на 800 x g за 5 мин.
- Дега 100 мл буфера MACS с двумя трубами фильтра, упаковка воздухозаборник с вощеной бумагой, за 25-30 минут, или до готовой к использованию.
- Рассчитать необходимый объем магнитной бусины: 1 мл бусы/109 клеток. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки 108 клеток/мл, после добавления бисера. Например: 3 х 109 клеток + 3 мл бусы + 27 мл MACS буфера до 30 мл общего объема.
- Инкубируйте суспензию клеток на 4 ° C на вращателе трубки для 25-30 мин.
- Во время приобрести магниты для столбцов; планируете использовать 0,6 x 109 ячеек в столбце. Разместите столбцы на магните и положение 50 мл Конические трубки ниже каждого столбца для сбора через поток. Подготовка 15 мл Конические трубки и поршень для каждого столбца для элюции (шаг
- После инкубации в шаге 1.3.8 завершения, добавьте буфер MACS 50 мл и спина на 800 x g 5 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте клетки в дегазации MACS буфера (2 мл на колонки). Пипетка осторожно, чтобы избежать пузырей.
- Не позволяя столбце иссякать, добавьте 1 mL дегазацию MACS буфера для каждого столбца, а затем 2 мл суспензии клеток. Промойте фильтр и оригинальный трубка с дегазацию MACS буфера и разделить раствор поровну между столбцов (6 мл /); Затем добавьте 7 мл дегазацию MACS буфера для окончательной стирки.
- Осторожно потяните столбце от магнита (push топ обратно) и собирать последний капельной трубу через поток. Добавить 5 мл дегазацию MACS буфера для каждого столбца и применять поршень элюировать клетки в стерильную пробирку конические с шагом 1.3.9. Не собирать любую жидкость, после того, как появятся пузырьки.
- Подсчитать ячейки в обогащенных и проточные (FT) коллекции трубок на коэффициент разбавления 1:10. Держите клетки на льду. Аликвота 1 x 106 клеток от CD34-обогащенный дроби и 5 х 106 клеток от FT фракций для анализа проточной цитометрии. Магазине FT дроби при 4 ° C до завершения контроля качества (шаг 2).
Примечание: Количество CD34+ клеток, необходимых для успешного мультилинейного приживления в НПЗ зависит от частоты HSC-обогащенный CD34+CD90+CD45RA подмножество– . На основе средней частоты 3% - 5% и минимальное требование 122,000 CD34 CD90+CD45RA+– клетки на килограмм тела вес1, это рекомендуется приступить в общей сложности по крайней мере 2,5 х 106 и до 10 x 10 6 CD34+ клеток на килограмм массы тела. - Добавить MACS буфер CD34+ обогащенные фракция до 50 мл в общей сложности, спина на 800 x g 5 мин, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки 106 клеток/мл в HSPC СМИ (таблица 1).
- Пластина клетки на плотность 106 клеток/мл в вентилируемые, культуры тканей (TC)-лечение T-75 Колб, 10-20 мл за флакон и инкубировать их на ночь в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Отдых колбы продольная (не стоя).
Примечание: При необходимости, дополнительные CD34+ клетки или CD34– FT может быть замораживают в 90% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) + 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 1 x 10-6 -5 х 106 клеток/мл, а затем медленным охлаждением на - 80 ° C (например, с помощью морозильные контейнеры). Урожайность средняя восстановления криоконсервированных клеток зависит от CD34+ чистоту и обычно колеблется от 50% до 80% с жизнеспособности > 80%.
- Пластина клетки на плотность 106 клеток/мл в вентилируемые, культуры тканей (TC)-лечение T-75 Колб, 10-20 мл за флакон и инкубировать их на ночь в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Отдых колбы продольная (не стоя).
2. контроль качества CD34-обогащенный клеток (день -1)
-
Подготовка образцов для проточной цитометрии.
- Ресуспензируйте образцов защищены от каждой стадии изоляции, упомянутых выше (предварительного обогащения, FT и CD34-обогащенный фракций) в буфере СУИМ в концентрации 10 х 106 клеток/мл и передать трубку СУИМ 100 мкл суспензии каждой ячейки (Таблица 1).
Примечание: Примеры элементов управления должны включать неокрашенных клетки от каждой стадии изоляции (например, 5 x 105 клеток) для регулировки вперед точечной (FSC), стороны точечной (SSC) и аутофлюоресценция в каждом канале флуоресценции. Кроме того бусины сингл окрашенных компенсации для каждого флюрохром конъюгированных антител будет необходимо скорректировать компенсацию между соседними каналами (в таблице 2 и таблице 3). - Добавьте требуемый антител (например, анти CD45, анти CD34, анти CD45RA и анти CD90), согласно инструкциям изготовителя, для одного теста (1 х 106 клеток в 100 мкл) (Таблица 3). Проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C. Добавить 3 мл буфера СУИМ и спина на 800 x g 5 мин, аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте в 100 мкл буфера СУИМ и анализировать на соответствующие проточный цитометр (шаг 2.2).
- Ресуспензируйте образцов защищены от каждой стадии изоляции, упомянутых выше (предварительного обогащения, FT и CD34-обогащенный фракций) в буфере СУИМ в концентрации 10 х 106 клеток/мл и передать трубку СУИМ 100 мкл суспензии каждой ячейки (Таблица 1).
-
Подготовка потока цитометр/ячейку сортировщик для анализа.
Примечание: рекомендуется для выполнения анализа на той же машине, которая будет использоваться для сортировки на шаге 2.3 ячейки.- Создание протокола, включая FSC/SSC, CD45/CD34 и CD45RA/CD90 (три потока участков). Щелкните правой кнопкой мыши на участке потока и добавить раскладку населения иерархии .
- Щелкните левой кнопкой мыши на участке FSC/SSC, выберите функцию ворота полигона и привлечь ворота исключить мусор и мертвые клетки. Выделите новые ворота и переименовать его в разброс в окне инспектора.
Примечание: Это называется автоматически P1. - Щелкните правой кнопкой мыши в центре сюжета потока CD45/CD34, перейдите чтобы Показать населениюи ворот участка на разброс. Обратить клетки прямоугольной ворота вокруг CD45intCD34+ исключить не CD34 клетки и клетки nonhematopoietic, как хорошо как остаточная тромбоцитов и эритроцитов (CD45–). Переименование ворот CD34+.
- Ворота CD45RA/CD90 потока участок на CD34+ населения. Нарисуйте три независимых subgates вокруг CD90+CD45RA– клетки (обогащенные для СКК), CD90–CD45RA– клетки (обогащенные для Multipotent с и Эритрею миелоидного прародителями [MPP/EMPs]) и CD90–CD45RA + клетки (обогащенные для лимфо миелоидного прародителями [ПРТ]). Переименование ворот HSC, MPP-EMPи LMP, соответственно.
- Когда закончите, убедитесь, что население иерархия содержит шесть иерархически организованной записей в следующем порядке: 1) все события; 2) Блуждающий; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Убедитесь, что на участках потока и форма ворот выглядеть как показано на рисунке 4.
- Запустите неокрашенных предварительного обогащения белых кровяных телец для регулировки напряжения FSC, ККК и все флуоресценции каналов (Таблица 2, пример 5). Запуск одного окрашенных компенсации бусины скорректировать компенсацию между соседними каналами (Таблица 2, образцы 1-4). Запуск всех оставшихся незапятнанное и витражи образцы с скорректированные и компенсацию протокол, к документу CD34 обогащения эффективности (Таблица 2, образцы 6-9).
Примечание: Держите окончательного образца (Таблица 2, пример 10) для анализа одновременных потоков и ячейку Сортировка в шаге 2.4.
-
Настройка ячейки сортировщик для сортировки очистки CD34 подмножества в колонии формирование клеток (ХФУ) анализов.
Примечание: если различные машина была использована для анализа (шаг 2.2), настроить протокол о сортировщик ячеек, как описано в шагах 2.2.1 - 2.2.5.- Отрегулируйте угол/напряжение для левой и правой стороне потоков в программное обеспечение сортировщик ячейки депозитные ячейки в 15 мл пробирки, содержащие ХФУ среднего. Настройте угол стороне потока для предотвращения смещения. Пошагово отрегулировать угол поток деформированного стороне до тех пор, пока сортировки клеток ударил среднего ХФУ и не на стороне трубки, потому что очень немногие клетки будут отсортированы.
- В браузере откройте папку глобального листов и создание нового рода макета с помощью кнопки в верхнем меню окна браузера. Измените запись в раскрывающемся меню коллекции устройства в две пробирки, запись в раскрывающемся меню точность 4-полосная чистоты или одну ячейку и задать целевой события до 800-1 200 клеток. Левой кнопкой мыши на поле сортировки расположение (слева или справа), выберите Добавить запись в меню и выберите населения для сортировки в меню.
-
Сортировать клетки для ХФУ анализов.
Примечание: сортировки для анализов ХФУ выполняется только с ячейками от CD34-обогащенного продукта (Таблица 2, пример 10).- Загрузить образец 10, записывать события 2000-3000 и штраф Отрегулируйте ворота Сортировка по размеру сигнала прочность и целевых групп населения.
- Когда установка завершена, приобрести клетки (Таблица 2, пример 10). Получение данных, как описано в шаге 2.2.3, отрегулировать скорость потока до 500-1000 клеток/s и сортировать клетки 800-1200 от i) точечные ворот, ii CD34+ ворота, ворота iii HSC, iv MPP-EMP ворота и v LMP в отдельные Пробирки, содержащие 3,6 мл ХФУ средства массовой информации.
Примечание: Сортировка для ХФУ анализов выполняется только с ячейками от CD34-обогащенного продукта (Таблица 3, пример 10). Клетки из точечных и CD34+ ворота должны быть отсортированы индивидуально, тогда как СКК, MPP-EMPs и ПРТ можно сортировать одновременно в положение держателя левой и правой трубки. - Вортекс и отказаться от 1 мл суспензии клеток в каждой из 3 x 3.5 см стерильная, nontissue, Культура лечение Петри. Инкубации клеток при 37 ° C для 10-14 дней в вторичного контейнера (например, 15 см Петри).
- На дней 10-11 postplating граф отдельных колоний от всех трех пластин на условие, основанный на словотолковании колонии.
3. генная модификация CD34+ HSPCs и на ночь восстановления (день 0)
- Разбавьте 2,5 мл раствора 1 мкг/мкл CH-296 до 50 мкг/мл в 50 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS, смотрите Таблицу материалов).
-
Подготовьте колбы для LV трансдукции.
- Определить приблизительное количество nontissue культура (не TC)-лечение колбы (обычно от клеток, определенный на шаге 1.4). План для пластины 1 x 107 клеток в СМИ за T-75 флакон 10 мл (1 x 108 всего клетки потребует 10 флаконов) и включают в себя один из не TC-лечение 12-ну пластины (макет трансдукции условие). Добавьте стерильные HBSS и 50 мкг/мл CH-296 складе от шаг 3.1 Каждый флакон/пластины, в концентрации 2 мкг/см2. Для T-75 Колб используйте 3 мл 50 мкг/мл CH-296 + 7 мл HBSS; для 12-ну пластины используйте 160 мкл 50 мкг/мл CH-296 + 340 мкл HBSS за хорошо.
- Разрешить блюда сидеть спокойно на RT на лавочке чистой или в капот для 2 h. аспирата CH-296 и заменить его на аналогичный объем стерильных HBSS + 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Инкубируйте 30 мин на RT, аспирационная HBSS/BSA и мыть посуду с объемом аналогичные стерильные HBSS, содержащие 2,5% 1 М HEPES, pH 7.0. Аспирационная непосредственно перед покрытие клетки (шаг 3.4).
Примечание: Следующий шаг 3.2.2, не позволяют пластины/колбы высохнуть. Пластины содержащие стерильные HBSS + 2,5% 1 М HEPES проводятся на 4 ° C на ночь (т.е., приготовляют на день -1).
-
Собирают и передают CD34+ клетки от дня -1.
- С помощью пипетки 10 мл, промойте слабо адэрентных клеток, неоднократные, нежный промыв каждой культуры колбу с стерильных HBSS. Убедитесь, что все клетки отделит (при необходимости, нажмите/пощечину колбу ослабить клетки).
- Центрифуга клетки на 800 x g 5 мин, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в трансдукции СМИ к концентрации 1 х 106 клеток/мл. После того, как были собраны все клетки, определите количество клеток, используя Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
- Добавьте 1 мл суспензии клеток (1 х 106 клеток) в одной скважиной CH-296-покрытием 12-ну пластины (для образца преобразованы макет элемента управления). Разделить на оставшуюся часть клетки среди T-75 колбы (шаг 3.2.2), добавив примерно 10 мл (1 x 10-7 -клетки) за флакон. Позволяют клеткам придерживаться CH-296 покрытие инкубации при 37 ° C, 5% CO2 на 30 мин, с заглушки отверстий.
- Оттепель вирус кондиционером СМИ (VCM, Таблица материалов) и определить титр в инфекционных единиц на миллилитр (МЕ/мл)28,29,,3031,32 . Добавьте соответствующий объем VCM каждого T-75 фляга из шага 3.3.3 и инкубации клеток при 37 ° C, 5% CO2.
Примечание: Если выполнение одного трансдукции, Инкубируйте на ночь; Если выполнение двойной трансдукции, повторите этот stepapproximately 6 - 8 ч после первого трансдукции без мытья/восстановления фазы и, затем, инкубировать на ночь. Например для одной колбе (1 x 10-7 -клетки) с требуемой кратностью инфекции (МВД) 10, добавьте 1 mL вируса titered в 1 x 10-8 МЕ/мл.
4. клетки урожая и подготовки для инфузии (1 день)
-
Урожай клетки.
- Сбор transduced и Макет ячеек, как описано в шагах 3.3.1 - 3.3.2. Выполните последовательный автомойки с 10 мл HBSS, передачи стирок Конические трубки с клетками. Убедитесь, что все клетки были удалены из колбы, нажав/хлопая колбы, при необходимости.
- Центрифуга для клеточных суспензий на 800 x g 5 мин, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл HBSS. Объединить пробирки, содержащие клетки от то же состояние. Промойте с 10 мл HBSS и добавить, что к суспензии клеток. Определите клеток с помощью Горяева. Довести объем общей ячейки до 50 мл в HBSS и центрифуги на 800 x g за 5 мин.
-
Пульс простагландин E2 (PGE2) и подготовить реагентов для инфузии продукта.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте transduced клетки (не макет) до 5 x 10-6/мл в HSPC СМИ без цитокинов. Добавить 10 мм PGE2 в конечной концентрации 10 мкм. Инкубируйте клетки на льду 2 h, осторожно вращая их каждые 30 мин.
- Во время шага 4.2.1, тепло инактивирует аутологичной сыворотки (Таблица материалов), упаковка контейнера в промасленную бумагу и инкубации на 56 ° C на 30 мин подготовить 2% аутологичной сыворотки в HBSS микс (500 мкл тепла инактивированная сыворотки + 24,5 мл HBSS), их хорошо, и Храните смесь на льду до использования. Кроме того во время шага 4.2.1, урожай преобразованы Макет ячеек в пластине 12-Ну, закупорить клетки энергично вверх и вниз. Суспензию клеток в 15 мл Конические трубки, мыть их 3 x с 1 мл раствора HBSS и добавить стирок же 15 мл Конические трубки.
- После 2 ч инкубации PGE2, вымыть клетки 2 x, центрифугирование их на 800 x g 5 мин и отменяя супернатант. После второго мыть Ресуспензируйте клетки в соответствующий объем HBSS для подсчета, используя Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
Примечание: Клетки часто комок после PGE2 импульса, который может сделать для менее надежным клеток. Если это так, используйте число ячеек из шага 4.1.2 вместо одного из шага 4.2.3.
- Заповедник макет и transduced клетки для контроля качества (шаг 5) инфузии продукта: 5 x 105 до 1 x 10-6 ячеек для потока цитометрии/ячейку Сортировка (шаги 5.1 и 5.3) и примерно 1 х 106 клеток для жидких культуры (шаг 5.2) и колонии полимеразной цепной реакции (ПЦР) (шаг 5.4).
-
Готовят настой продукта.
- С остатком transduced клеток выполните третий мыть в 50 мл HBSS, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл HBSS + 2% аутологичной сыворотки (подготовленных на шаге 4.2.2). Привлечь 10 мл раствора в 20 мл шприц с иглой 16.5 G. Промойте трубку с 10 мл HBSS + 2% Авто сыворотки и привлечь мыть в же шприц довести объем до 20 мл. Колпачок шприца с иглой шапочкой, этикетки шприца и поместите его на льду для транспорта/инфузии.
- Влить transduced ячейки продукта в аутологичной хост, расположенных в пределах объекта исследования аккредитованных животных через Центральный венозный катетер33,34. Контролировать пересаженных животных полный кровяных телец (РБСГ) и химия крови и выполнить исследование конкретных генов маркировка анализов с учетом проекта1,6,19.
5. контроль качества
Примечание: Проточная цитометрия и сортировки клеток выполняются после того, как клетки переплетаются в животных в рамках последующей деятельности, описанной в шаге 4.4.2. Гранулярных потока данных используется для определения состава фенотипически определенных подмножеств стволовых и прогениторных клеток в инфузии продукта (шаги 5.1 и 5.3) сразу же после трансплантации, тогда как анализ ХФУ assays проводится 12-14 дней postinfusion для определения эффективности генной модификации колонии PCR (шаг 5.4).
-
Выполняйте проточной цитометрии и ХФУ сортировка настой продукта.
- Анализировать клетки проточной цитометрии и сортировка очистить CD34 подмножества для ХФУ анализов, как описано в разделе 2. Семя ХФУ assays от макет и transduced CD34 клеток (настой продукт после импульса PGE2).
- Сортировка максимум 800 клеток на состояние и вихрь, пластины, культуры и количество анализов ХФУ, как описано в шаге 2.4. После подсчета, выберите колоний от ХФУ анализов для выполнения колонии PCR как описано в пункте 5.4.
-
Жидкий культура
- Плита клетки для жидких культуры в средствах массовой информации HSPC на 1 х 106/мл в не TC-лечение пластины. На posttransduction дней, 2, 5 и 12 урожай и подсчитать количество ячеек для проточной цитометрии. Ячеек, сортировка для ХФУ анализов не требуется.
- В дни, 2 и 5 replate 33% ячеек в свежих HSPC СМИ в 1 x 10-6/мл. Заморозить 33% ячеек в буфер экстракции ДНК для количественной ПЦР в реальном времени. Использовать для проточной цитометрии 33% клеток, как описано в шагах 2.1 и 2.2.
- Используйте эти данные из шага 5.2.2 для анализа фенотипические состав кроветворных потомства. Определите частоту CD34 + клеток и фенотипически определенных подмножеств, как описано в шаге 2.2.2 в пределах каждого образца. Сравнить состав CD34+ клетки между условия, чтобы определить эффект генной модификации.
Примечание: CD34+ клетки должны сохранять свое выражение на протяжении всей культуры и содержат все подгруппы фенотипическую. Потеря CD90+CD45RA– клетки или чрезмерной фенотипические подмножеств могут указывать прямые или косвенные последствия генной модификации.
-
Количественно трансген выражение (например., Зеленый флуоресцирующий белок [GFP]) подачей cytometry (опциональный и в зависимости от экспериментальной установки), адаптация протокола от шаге 2.2.
- Добавьте три потока участки показаны SSC/трансген (например, SSC/GFP). Ворота первый участок на СКК, второй на MPP-EMPs и третий на ПРТ. сюжет каждой против трансген (например, GFP) и создать ворота, названный HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+и LMP-GFP+, соответственно.
- Когда закончите, население иерархии должен содержать девять иерархически организованной записей в следующем порядке: 1) все события; 2) Блуждающий; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
Примечание: Любое выражение трансген позднее в жидком культуре (например, дни 5 и 12) будет лучше отражать эффективность изменения гена, определяется в шаге 5.4 колонии PCR. Ранее время точек в жидком культуры могут переоценивать выражение трансген, благодаря неинтегрированные LVs. Аналогично поток сортировка клеток GFP+ для ХФУ анализов на 1 день приведет к много ложных положительных колоний.
-
Выполняйте колонии PCR.
- После подсчета шагов 2.4.4 и 5.1.1, выбрать один колоний в 50 мкл буфера экстракции ДНК, используя 10 мкл и 20 мкл Пипетка, Пипетка вверх и вниз передать одной трубы колпачок газа 8-Тюбе PCR колонии. Выберите восемь колоний от макет состояния и 88 колоний от transduced условие для создания одного полного 96-луночных пластины. Добавьте 50 мкл буфера экстракции ДНК каждой скважины.
- Извлечь ДНК из колоний, используя Термоциклер и Следующая программа: 65 ° C/20 мин, 99 ° C/10 мин и 4 ° C провести. План для перемещения ДНК до-20 ° C как можно скорее для обеспечения оптимального качества.
- Выполняйте колонии PCR для количественного определения LV-преобразованы клетки, сравнивая количество колоний LV+ , с помощью грунтовки Lenti F/R, для всего колоний, используя праймеры актина F/R и контроля (Таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанные выше протокол предназначен для изоляции и Джин изменить NHP CD34+ HSPCs, которые впоследствии могут быть проникнуты обратно в аутологичной узла (рис. 1 и рис. 2). Когда после этого протокола, мы обычно получить до 8 х 109 всего белых кровяных телец загрунтовать BM от косичка макак и, иногда, двойной эту сумму из макак резус. В обоих видов, количество CD34+ HSPCs, которые мы обогащаем пропорциональна входу всего лейкоцитов (рис. 3). Предыдущие выводы показывают, что общая CD34+ HSPC продукт включает в себя клетки, которые не являются true, долгосрочный голокоренные СКК. Таким образом, мы разработали на основе потока цитометрии методы (рис. 4) и использовать ХФУ анализов (рисунки 5-6) Определите долгосрочные СКК и совершено прародитель подмножества в культурах. В отличие от истинной СКК совершено прародителями будет сохраняться за относительно короткий период времени в естественных условиях. Наконец, результаты стратегии изменения LV-опосредованной гена гена надежной маркировки в культивированный CD34+ HSPCs. Эти клетки являются контроль над до 2 недель в культуре, отчасти для того, чтобы уменьшить количество «ложных положительных» клеток, которые выражают GFP от nonintegrated LV векторов. Потому что эти клетки не переносите стабильно комплексного копии LV вектора в геноме сотовой, они будут разбавляют вне над Пробирной жидкости культуры 12-дневный (рис. 7).
Рисунок 1: Производство аутологичных, генно модифицированных продуктов NHP HSPC. Протокол изолирует CD34+ HSPCs (день -1), ген изменяет эти клетки (день 0) и готовит настой продукта (1 день) за 48 ч время курс. Формирования колонии, жидкие культура и связанные с ними ex vivo анализов продолжают еще 2 недели, для того чтобы характеризовать эти продукты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Хронология событий. Среднее время для выполнения каждый этап протокола, примерно 2 дня. Сроки проведения отдельных шагов варьируется в зависимости от источника стволовых клеток (шаг 1 из протокола) и/или тип генной модификации (шаг 3 из протокола). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: белых кровяных клеток и CD34 доходность от загрунтовать косичка и резус макака костного. Обогащенный CD34+ HSPC подсчитывает (шаг 1.4 протокола) как функция общего белых кровяных телец (шаг 1.3.3 протокола) от 10 косичка макак (квадраты) и шесть макак резус (треугольники). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: стробирования стратегия для контроля качества обогащенный CD34 и генно модифицированных продуктов. Всего белые кровяные клетки («предварительное обогащение») и впоследствии CD34-обогащенные HSPCs витражи с антител специфических для CD34, CD45, CD90 и CD45RA, для того, чтобы подсчитать количество HSC-, MPP-, EMP- и LMP-обогащенный CD34 подмножеств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: морфология CD34+ клеток до и после модификации ген. Топ групп: три представителя brightfield изображения от HSPC колонии анализов. Нижней панели: GFP флуоресценции соответствующего каждой brightfield изображение выше. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: образуя колонии клеток (ХФУ) потенциал CD34+ клеток и сортировка очищенная подмножеств. После очистки сортировки для ХФУ assays от подсовокупностей HSPC на день -1 (разделы 1 и 2 протокола) и день 1 (статья 5 протокола), односпальные колоний забил основаны на морфологические характеристики. КОЕ-MIX = смесь миелоидного (белый) и клетки эритроидные (красный); BFU-E = только эритроидные клетки; КОЕ-G = гранулоцитов; КОЕ-GM = гранулоцитов и макрофагов/моноциты; КОЕ-M = моноцитов/макрофагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: представитель потока данных гранулярных из генно модифицированных клеток в жидком культуры. Процент CD34+ HSPCs, после трансдукция с GFP-выражая LV вектор. Клетки культивировали на срок до 2 недель после трансдукции. Снижение GFP+ события со временем отражает потерю GFP сигнала от клетки, несущие nonintegrated LV векторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Содержание |
| Гемолитической буфер | 150 мм аммония хлорид, 12 мм бикарбонат натрия, 0,1 мм ЭДТА в двойной дистиллированной воды (ddH2O) |
| Коммерческих буфера | Фосфат амортизированное saline (1 X) рН 7,2, BSA 0,5%, ЭДТА 2 мм |
| СУИМ буфер | Фосфат амортизированное saline (1 X) рН 7,2, 2% плода Bovine сыворотки |
| HBSS + 2% BSA | Хэнк сбалансированный раствор соли, 2% альбумина Bovine сыворотки |
| HSPC СМИ | StemSpan SFEM II, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 нг/мл каждый рекомбинантного человеческого ТПО, SCF, Флайт-3 |
| Трансдукция СМИ | StemSpan SFEM II, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 нг/мл каждый рекомбинантного человеческого ТПО, SCF, Флайт-3, 1 мкг/мл циклоспорина, 4 мкг/мл протамина сульфат |
Таблица 1: Буфер и СМИ формулировки.
| ID | PE | PECF594 | БТР Cy7 | V450 | Описание |
| 1 | CD90 | Компенсации бисер | |||
| 2 | CD34 | Компенсации бисер | |||
| 3 | CD45RA | Компенсации бисер | |||
| 4 | CD45 | Компенсации бисер | |||
| 5 | Безупречная лейкоцитов до CD34-обогащение | ||||
| 6 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Окрашенных белых кровяных телец перед CD34-обогащение |
| 7 | Безупречная лейкоцитов потока через (FT) | ||||
| 8 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Окрашенных белых кровяных телец потока через (FT) |
| 9 | Безупречная лейкоцитов CD34-обогащенного продукта | ||||
| 10 | CD90 | CD34 | CD45RA | CD45 | Окрашенных белых кровяных телец CD34-обогащенного продукта |
Таблица 2: Группа представитель потока для контроля качества клеток CD34-обогащенный и генно модифицированных продуктов.
| Антиген | Клон | Флюрохром | Лазер | Фильтр |
| CD45 | D058-1284 | V450 | 395 Нм | 450/40 Нм |
| CD90 | 5.00E + 10 | PE | 488 нм или 532 нм | 585/42 Нм |
| CD34 | 563 | PE-CF594 | 488 нм или 532 нм | 610/20 Нм |
| CD45RA | 5H 9 | БТР Cy7 | 633 нм | 780/60 Нм |
| V450: фиолетовый 450 Нм; PE: Фикоэритрин; PE -CF594: название торговой марки, от Biotium; APC: Аллофикоцианин-7 цианиновые | ||||
Таблица 3: Пятнать антитела Группа контроля качества проточной цитометрии и сортировки клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LV вектор Инжиниринг является метод наиболее характерны для гена изменить типы клеток, таких как CD34+ HSPCs, для последующей трансплантации в естественных условиях. Протокол, описанные здесь призван увеличить количество генно модифицированных HSPCs, которые сохраняются долгосрочные в естественных условиях и обеспечивают клинические преимущества для пациентов с различных злокачественных, инфекционные и генетических заболеваний. Хотя за последнее десятилетие появились ген редактирования стратегии, LV-модифицированные клетки являются лучшими учился в пробирке, в животных моделях и пациентов1,8,20,21,22.
Основываясь на наш обширный опыт работы с настоящим Протоколом, в обогащение чистого CD34+ HSPCs (т.е. > 80% CD34+ клеток в отсортированном ячейки продукта) является важнейшим аспектом успеха. Потому что эти клетки являются производными от смешанного населения всего BM белых кровяных телец, низкой чистоты культур может включать клетки, которые будет не привито долгосрочный, в свою очередь снижение дозы истинной стволовых клеток, которые переплетаются в аутологичной хозяина. Кроме того высокое качество LV VCM обеспечит наивысшую эффективность генной модификации.
Для устранения недостатков в чистоте обогащенного CD34+ HSPC продуктов, часто бывает полезно для проверки качества реагентов, используемых для изоляции этих клеток, а именно антитела анти CD34 (который наша группа очищает дом от линии клетки hybridoma), и магнитные бусы, которые связывают помечены антитела клетки. Мы рекомендуем MOI 10, с возможностью повторить этот трансдукции (МВД 10 x 2). Важно отметить, что МВД должен решаться эмпирически, после оценки качества VCM, включая титрования каждого вектора на линии клеток стандартизированных titering например HT108029. Важно отметить, что различные лаборатории, VCM-производители могут использовать собственный titering клеточных линий, включая HOS30, HeLA31и 293T32, который может ограничить возможность сравнить титры между объектами. Мы предпочитаем retiter вектор с assay, для того чтобы вычислить наиболее точное количество VCM эффективно ген-изменить CD34+ HSPC целевых ячеек. CD34 после высокого качества+ HSPCs и VCM были получены, электромеханической эффективности и приживления дальнейшее развитие в три отдельных этапа. Во-первых Добавление циклоспорина трансдукции носителей СПИДа в первые шаги векторных трансдукция и интеграции в целевой ячейки35,36, в то время как протамина сульфат уменьшает отталкивающим сил между лентивирусные вектор 33,37поверхности частиц и ячейки. Во-вторых лечении пластины с рекомбинантным фибронектин фрагмент (например, RetroNectin, CH-296) увеличивает эффективность трансдукция и также повышает потенциал в естественных условиях приживления генно модифицированных HSPCs 33,38, 39. Примечательно предыдущие исследования показывают, что CH-296 только важно во время, но не до, трансдукция33,38. Наконец, мы пульс продуктов генно модифицированных клеток с PGE2 активизировать приживления и упорство в естественных условиях, как уже было показано ранее для человека и нечеловеческие приматов CD34+ HSPC Продукция40,41.
LVs случайным образом интегрируется в геноме, как их предшественник, gammaretroviral Векторные (РВ). Хотя менее клинических испытаний данных доступен для LVs, чем для внедорожников, текущие результаты показывают, что LV подходы несут значительно ниже риски клеток преобразований благодаря LV инсерционному мутагенезу; Менее часто RV стратегии используются из-за этого риска42. Дальнейшее ограничение заключается в том, что эффективность генной модификации меньше 100%, и доли генно модифицированных клеток не будут сохраняться в естественных условиях. Например, 60% генно модифицированных HSPC продукта может привести к долгосрочным отлаживание 30%, генно модифицированных клеток. Всякий раз, когда это возможно, стратегии терапии гена, представленные здесь предназначены для преодоления этого ограничения путем введения трансгенов, которые обеспечивают терапевтической эффективности, даже когда выражается в меньшинство клеток кроветворных происхождения8,43 .
Будущее будет ярким для LV-основе HSPC изменения подходов. Мы регулярно использовать этот протокол «ген Марк» клетки, включение отслеживания в естественных условиях1. Также мы адаптировали эту стратегию, чтобы сравнить варианты LV в то же самое животное. Такой «конкуренции» пересадки позволяют сравнение различных векторов (например, для выявления лиц с большей эффективности) и трансгенов (например, чтобы отслеживать различные подмножества HSPC или сравнить их в модели заболеванием). Продвигаясь вперед, мы считаем, что LV генной терапии в HSPCs будет оставаться важным инструментом наряду с ген редактирования подходов, особенно в ситуациях, где большие генетические грузов должна быть стабильно выражена для жизни индивидуума.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Хелен Crawford за подготовку этой рукописи, Джим Woolace для графического дизайна и Вероника Нельсон и Devikha Chandrasekaran для участия в разработке протокола. В разработке этого протокола был поддержан грантов из низ национального института аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI135953 и AI138329 к H.P.K.) и Национальный сердца, легких и крови института (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 и U19 HL129902 к H.P.K.), а также NIH P51 OD010425 и частично через низ/NCI онкологический центр, поддержка Грант Р30 CA015704. H.P.K. является Markey молекулярной медицины следователь и получил поддержку как первого получателя Хосе Каррерас/э. Donnall Томас наделила Председателя для исследований рака и Председатель наделен Фред загон для клеток и генной терапии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
References
- Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
- Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
- Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
- Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
- Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
- Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
- Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
- Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
- Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
- Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
- Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
- Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
- Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
- Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
- Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
- Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
- Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
- Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
- Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
- Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
- Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
- Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
- Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
- Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
- Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
- Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
- Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
- Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
- Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).
