Summary
该方案的目标是从启动的骨髓中分离出非人类灵长类动物 cd34+细胞, 用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰, 并准备一种产品, 用于注入自体宿主。协议的总长度约为48小时。
Abstract
近半个世纪以来, 造血干细胞和祖细胞移植一直是白血病和其他癌症的基石治疗方法, 是人类免疫缺陷病毒 (hiv-1) 感染的唯一已知治疗方法的基础, 并显示出巨大的希望。遗传性疾病的治疗, 如β地中海贫血。我们的小组已经开发了一个协议, 以模型 hspc 基因治疗的非人类灵长类动物 (nhp), 使科学家优化许多相同的试剂和技术, 应用于临床。在这里, 我们描述了纯化 cd34+ hspc 和长期持续的造血干细胞 (hsc) 亚群的方法从启动骨髓 (bm)。相同的技术可用于纯化其他 hspc 来源 (例如, 动员的外周血干细胞 [pbsc])。概述是一个2天的协议, 其中细胞纯化, 培养, 修改与慢病毒 (lv), 并准备输注回自体宿主。成功的关键读数包括 cd34+ hspc 种群的纯度、纯化后的 hspc 在半固态培养基中形成形态上明显菌落的能力, 以及最重要的基因修饰效率。hspc 基因治疗的主要优势是能够提供长寿命细胞的来源, 从而产生所有造血细胞类型。因此, 这些方法被用来模拟癌症、遗传疾病和传染病的疗法。在每一种情况下, 治疗效果是通过增强不同的 hspc 后代的功能, 包括红细胞, t 细胞, b 细胞, 和/或骨髓亚群。分离、修改和制备 hspc 产品的方法直接适用于人类患者的多种疾病。
Introduction
干细胞基因治疗是解决各种人类疾病的有力手段。hspc 基因治疗是一种特别有吸引力的方法, 因为 (i) 从患者中收集这些细胞相对容易, ii) 关于细胞表面表型和体外培养参数的丰富知识, 并且, 随着该领域的扩展,因为它为科学家们提供了一个不断增长的针对各种感兴趣的疾病的基因修饰策略工具箱。我们正在从多个角度积极研究 hspc 基因治疗方法, 包括 hspc 生物学基础科学、基因修饰 hspc 在临床前活体模型中的植入以及在相关患者群体中的应用。我们和其他人已经描述了功能不同的 hspc 子集 1,2, 3 的细胞表面表型, 动员和调理方案, 最大限度地提高 hspc 产量和植入, 同时尽量减少毒性4,5, 以及基因修饰和基因编辑策略, 已被定制的广泛的恶性, 遗传和传染病 6,7,8, 9,10。基因修饰 hspc 的功能和雕刻可在许多小型和大型动物模型中进行评估, 包括小鼠、狗和 nhp。特别是, nhp 模型是有利的, 因为许多试剂, 例如 hspc 细胞表面蛋白 (如 cd34 和 cd90) 特有的抗体, 可以在人和 nhp 细胞中互换使用。此外, 与小鼠不同的是, nhp 等大型动物可以更接近临床疗效所需的基因修饰规模。最后, nhp 是人类疾病 (如 hiv-1 感染11 ) 建模的黄金标准, 也是候选抗癌和抗艾滋病毒免疫疗法12,13的新兴模型系统。
本协议的目的是概述纯化、基因改造和制备 nhp hspc 输液产品的方法。虽然在本协议的范围之外, 我们已经表明, 这些产品在自体 nhp 主机中移植, 产生所有的造血谱系, 并提供治疗效果, 在广泛的疾病模型1。我们还描述了移植 hspc 的克隆性, 并建立了一个平台, 以跟踪单个 hspc 及其后代的动力学、贩运和表型, 经过自体移植1,14。本文提出的方法有以下目标: (i) 分离高纯度 hspc 和长期移植 hsc 子集, ii) 在体外培养过程中保持原始 hsc; (三) 有效地基因修饰大容量 hspc 或长期基因修饰嫁接 hsc 子集。我们采用磁辅助细胞分选 (macs), 以及荧光活化细胞分选 (facs), 与许多第2、15组的方法一致, 分离出功能不同的 hspc 人群. 16岁维持培养过程中的原始 hsc (即最大限度地减少这些细胞分化为承诺的祖细胞, 从而产生完全分化的淋巴和髓质亚群) 是这里描述的协议的一个重要方面。尽管我们以前已经描述了扩展 hspc 的方法, 同时保留了一个原始的表型17,18, 在这里, 我们描述了一个协议, 重点是通过最小 (48小时) 和定义的体外培养来维护 hsc。
hspc 和 hsc 子集的有效修改是该协议的中心目标。在我们报告的几种方法中, 有两种是迄今为止临床试验中研究最多的方法: lv 介导的基因修饰和核酸介导的基因编辑1,6,19。基因编辑策略使用多个核酸酶平台中的一个专门修改感兴趣的靶向基因, 例如, c-c 趋化因子受体5型 (ccr5) 用于治疗艾滋病毒感染7、19或 bcl11a血红蛋白病 6。在这里, 我们集中在 lv 介导的基因修饰, 其中转基因货物半整合到基因组1,8,20。lv 方法的一个关键优势是能够提供大量的遗传物质 (高达8或9千比)。虽然基因编辑策略正在制定, 以一个感兴趣的转基因为目标, 只通过同源供体重组 (hdr) 在指定的位点进行整合, 但这些方法需要在体外和小动物模型中进一步发展。相比之下, lv 载体在 nhp 和21、22 患者中得到了广泛的应用。重要的是, 此处描述的协议将引信 bm 用作启动 hspc 源, 可以轻松、广泛地进行调整, 例如, 用于隔离 pbsc。如上所述, 我们利用 nhp 和人类之间高度的遗传相似性, 使用适用于这两个物种的试剂。最后, 该方法已被调整为修改其他造血亚群, 即 t 细胞12,23,24;有效的 t 细胞免疫治疗方法的出现在很大程度上依赖于本协议中使用的相同的 lv 平台。这些方法适用于任何对 hspc 生物学或 lv 介导基因修饰感兴趣的研究人员。例如, 这里介绍的 hspc 纯化协议可用于描述新的 hsc 丰富子集, 如前面所述的1,15,25。同样, 这里介绍的 lv 转导方法也同样可以应用于许多其他细胞类型和实验问题, 包括体外模型和体内模型。
总之, 我们提出了分离和基因改造 nhp hspc 的方法。这些方法可以很容易地适应其他物种和其他来源的 hspc。这个经过彻底审查的协议在对许多人类疾病的有效疗法的建模中显示出很大的希望。
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Protocol
自体 nhp 移植、启动 (动员)、细胞收集和基因修饰都是按照先前公布的协议26进行的。所有实验程序都由弗雷德·哈钦森癌症研究中心和华盛顿大学动物护理和使用机构委员会审查和批准 (议定书 #3235-01年)。所有研究都严格按照《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》 (《指南》) 中的建议进行;动物被随机分配到研究中。
1. 丰富 cd34+ hspc 和夜间文化 (第1天)
- 收获 bm 并对其进行调理。
- 如前面所述, 用粒细胞集落刺激因子 (gcsf) 动员 nhp 4天。
- 用 100 mg kg 的氯胺酮和 0.03 mlkg 的右旋胺 (0.5 mg/ml 库存) 给动物镇静剂。在抽奖时使用镇痛药 (例如, 丁丙诺非 sr)。
- 使用剪子, 将动物的头发从肱骨和股骨骨的近端剃光, 用碘磨砂或类似的防腐剂擦洗皮肤, 与酒精交替使用, 重复3倍。作为一种额外的麻醉剂, 注入骨膜与布比卡因 (2 毫克每个部位, 5 mg/ml 股票)。
- 将骨髓穿刺针 (16 g) 放置在骨膜入处 (髓腔) 上方, 刺穿皮肤, 用旋转运动穿透髓腔。取下抽吸针的花柱, 并将其保存在无菌领域, 以便进一步使用。
请注意:选择骨膜进入部位到不被肌肉覆盖的骨区域的髓腔, 在那里骨骼的形状景观可以是可见的, 或者可以很容易地通过皮肤 (通常是在骨骼的近端或远端)。 - 在 bm 针上, 加入一个预置注射器, 其中含有抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液 (acd-a) 和肝素 (20 usp/ml, 每9毫升骨髓1毫升) 的混合物。
- 在轻轻摇晃肢体并旋转时, 将柱塞拉回来, 搅拌注射器, 将吸气液和抗凝剂混合在一起。旋转针头, 并在整个抽吸和取出过程中重新定位, 以获得骨髓空间内更大比例的细胞。
- 收集样品后, 取出针头, 对抽吸部位施加压力, 直到出血停止。
请注意:根据所需的体积, 在一次采集过程中, 可以提取从一到四肢 (两个腐殖质, 两个股骨) 的骨髓。从每条肢体收集的体积不应超过20毫升, 收集的总体积不应超过动物体重的 10% (10 mlskg)。 - 如果接收到多肢的吸气, 请组合并记录音量。
- 让 nhp 恢复感觉。
- 术后用 0.03 mlkg 阿帕梅唑 (5 mg/ml 库存) 逆转地塞美托米定的影响。根据临床症状, 在手术后至少48小时或更长时间内提供临床兽医规定的镇痛药 (如丁丙诺非 sr)。
- 手术后将动物送回家中笼子, 每15-20分钟监测一次, 直到动物能够自己坐起来。每天用兽医的工作人员对动物进行监测, 直到确定吸气部位愈合。此外, 监测任何炎症、感染或疼痛的迹象。
- 在细胞处理的同时, 用清髓性全身照射 (tbi) 条件相同的 nhp: 1, 020 cgy, 速率为 7 cGy. 在细胞输液前2天以分馏剂量进行放疗。
- 将 bm 溶血。
- 将 bm 分成50毫升锥形管 (每管 10-12 ml), 加入溶血性缓冲液, 使体积达到50毫升 (表 1)。在室温 (rt) 下对细胞进行培养, 直到被裂解, 但时间不超过 7分钟, 以 800 x克的速度离心 5分钟, 并从颗粒中抽吸上清液, 留下2-5 毫升的体积管。将颗粒重新装入剩余体积。
请注意:成功裂解的样品会改变颜色, 从深红色变为透明的浅红色。 - 加入10-15 毫升的溶血性布弗贝雷。使用70μm 细胞过滤器去除任何血块。加入溶血性缓冲液, 最高为50毫升, 在 rt 孵育 5分钟, 在 800 x克旋转5分钟。
- 吸吸上清液, 并在 mL 缓冲液10毫升中重新悬浮细胞 (表 1)。通过70μm 电池过滤器再次过滤。冲洗管, 用40毫升的 acs 缓冲液过滤, 最高可达50毫升。
- 将 bm 分成50毫升锥形管 (每管 10-12 ml), 加入溶血性缓冲液, 使体积达到50毫升 (表 1)。在室温 (rt) 下对细胞进行培养, 直到被裂解, 但时间不超过 7分钟, 以 800 x克的速度离心 5分钟, 并从颗粒中抽吸上清液, 留下2-5 毫升的体积管。将颗粒重新装入剩余体积。
- 使用标准协议从溶血性白细胞 (wbc) 中丰富 cd34+细胞。
- 将细胞旋转到800 x 克 15分钟, 检查管道, 确保在顶部/中间没有明显的细胞漩涡。如果细胞存在于颗粒上方, 则以更高的速度 (最大 1, 000 x克) 再次旋转, 最高可旋转10分钟。
- 吸收上清液并在10毫升或更少的 mL 缓冲液中重新悬浮, 并注意到确切的体积。使用血细胞计或自动细胞计数器对 1: 100 或1:1000 稀释的细胞进行计数。
请注意:此 wbc 计数总数是浓缩前的计数。 - 加入 acs 缓冲液, 使细胞浓度达到 1 x10 8 细胞/毫升。如有必要, 首先重复步骤 1.3.1----1.3.2 (例如, 由于浓缩前的数量较低)。在 acs 缓冲液中保留 5 x10 6 个细胞进行 hsc 子集染色 (浓缩前样品)。
- 在剩余的浓缩前细胞中加入未结合的抗 cd34 抗体 (克隆 12.8,材料表)27 , 最终浓度为 40μg/ml (1 x10 8 cells/mL ml)。在4°c 的管旋转器上将细胞悬浮液 (见材料表) 加氢25-30分钟。
- 使用 mL 缓冲液使体积达到50毫升, 并在 800 x克处旋转细胞 5分钟, 吸收上清液, 将细胞重新悬浮在 mL 缓冲液的50毫升中, 以 800 x 克的速度再旋转 5分钟.
- 用两个过滤管的 mL 缓冲器的 degas 100 毫升, 用蜡纸包裹进气口, 时间为25-30分钟或准备使用。
- 计算必要体积的磁珠: 1 毫升的磁珠/9 个细胞.在加入珠子后, 将上清液吸走, 并将细胞重新悬浮到 108细胞。例如: 3 x10 9细胞 + 3 毫升的珠子 + 27 ml 的 acs 缓冲液到30毫升的总体积。
- 在4°c 时将细胞悬浮液在管式旋转器上培养25-30分钟。
- 在获取磁铁期间为专栏;计划每列使用 0.6 x 109个单元格。将柱放在磁铁上, 并在每列下方放置一个50毫升的锥形管, 以收集流经。为每根柱准备 15 ml 锥形管和柱塞进行洗脱 (步骤)
- 当步进1.3.8 的孵育完成后, 将 mL 缓冲液加入50毫升, 在 800 x克处旋转 5分钟, 吸收上清液, 并在脱气 mL (每列2毫升) 中重新悬浮细胞。轻轻的移液器, 以避免引入气泡。
- 在不允许列运行干燥的情况下, 在每列中添加1毫升的脱气 mL 缓冲区, 然后添加2毫升的细胞悬浮液。用脱气的 macs 缓冲液冲洗过滤器和原管, 并在柱 (6 mll 柱) 之间平均分配溶液;然后, 加入7毫升的脱气 mL 缓冲液进行最后的清洗。
- 轻轻地将柱从磁铁上拉开 (向后推顶部), 并将最后的滴水收集到流动管中。在每根柱上加入5毫升的脱气 mL 缓冲液, 并将柱塞从台阶1.3.9 中取出细胞进入无菌锥形管。气泡出现后, 请勿收集任何液体。
- 以1:10 的稀释率对浓缩管和流经 (ft) 收集管中的细胞进行计数。把细胞放在冰上。alicot 1 x10 6 细胞来自 cd34 富集组分, 5 x 106细胞来自 ft 组分, 流式细胞仪进行分析。将 ft 分数存放在 4°c, 直到质量控制 (步骤 2) 结束。
请注意:nhp 中成功的多系移植所需的 cd34+细胞数量取决于 hsc 富集 cd34 + cd90+cd45ra-子集的频率.根据平均频率为 3%-5%, 最低要求为 122000 cd34+cd90+cd45ra-每公斤体重1的细胞, 建议继续进行总共至少 2.5 x10 6 和10 x 106 cd34 + 细胞每公斤体重 . - 添加 macs缓冲到 cd34+浓缩分数到一个50毫升的总, 旋转在 800 x克5分钟, 吸气上清液, 并重新悬浮细胞到 106 细胞/ml 在 hspc 介质 (表 1).
- 将细胞以 10 6 细胞的密度 (10 6 细胞培养 (tc) 处理的 t-75 瓶, 每瓶10-20 毫升, 并在 37°c 5% co 2 孵化器中孵育过夜.纵向休息烧瓶 (不站起来)。
请注意:如果需要, 可在浓度为 1 x10 至5 x 10 6 cellse/ml 的90% 热灭活胎牛血清 (fbs) + 10% 二甲基磺酰亚硫酸盐 (dmso) 中冷冻保存额外的 cd34 + 细胞或 cd34-ft, 然后在以下时间内缓慢冷却- 80°c (例如, 使用冷冻容器)。冷冻保存细胞的平均回收率取决于 cd34+纯度, 通常在50% 至80% 之间, 其生存能力为 gt;80。
- 将细胞以 10 6 细胞的密度 (10 6 细胞培养 (tc) 处理的 t-75 瓶, 每瓶10-20 毫升, 并在 37°c 5% co 2 孵化器中孵育过夜.纵向休息烧瓶 (不站起来)。
2. cd34 富集细胞的质量控制 (第1天)
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准备流式细胞仪样品。
- 在流式细胞库缓冲液中保留的上述每个分离阶段 (浓缩前、ft 和 cd34 浓缩组分) 中的再悬浮样品浓度为 10x10 6 cells/mL ml, 并将每个细胞悬浮液的 100μl (表 1) 转移到 facs 管中。
请注意:控制样本应包括每个隔离阶段的未染色细胞 (例如, 5 x10 5细胞), 以调整每个荧光通道中的正向散射 (fsc)、侧向散射 (ssc) 和自荧光。此外, 每个荧光色素共轭抗体的单染色补偿珠将需要调整, 以适应相邻通道之间的补偿 (表 2和表 3)。 - 根据制造商的说明, 添加所需抗体 (例如抗 cd45、抗 cd34、抗 cd45ra 和抗 cd90), 用于一次测试 (100μl 中的 1 x10 6 个细胞) (表 3)。在4°c 下孵化20分钟。加入3毫升的流式细胞仪缓冲液, 在 800 x 克处旋转 5分钟, 吸气上清液, 在100μl 的流式细胞仪中重新悬浮, 并分析适当的流式细胞仪 (步骤 2.2)。
- 在流式细胞库缓冲液中保留的上述每个分离阶段 (浓缩前、ft 和 cd34 浓缩组分) 中的再悬浮样品浓度为 10x10 6 cells/mL ml, 并将每个细胞悬浮液的 100μl (表 1) 转移到 facs 管中。
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准备流式细胞仪分选器进行分析。
注:建议在步骤2.3 中用于单元排序的同一台计算机上执行分析。- 生成包括 fsc/ssc、cd45/cd34 和 cd45ra/cd90 (三个流图) 在内的协议。右键单击流图并添加"人口" 层次结构布局。
- 左键单击 fsc/ssc 图, 选择多边形门要素, 并绘制一个门以排除碎片和死细胞。突出显示新门, 并将其重命名为 "检查器" 窗口中的 "散点" 。
请注意:这被自动称为 p1。 - 右键单击 cd45/cd34 流图的中心, 导航到显示人口, 并以散点点的形式打开绘图。在 cd45 int cd34+细胞周围绘制一个矩形门, 以排除非 cd34 细胞和非造血细胞, 以及残余血小板和红细胞 (cd45-)。将大门重命名为cd34+。
- 在 cd34 + 人口上进入 cd45ra\ cd90流图。围绕 cd90+cd45ra 绘制三个独立的子网格-- --细胞 (为hsc 浓缩)、cd90-cd45ra细胞(为多能和红细胞祖细胞 (mppsse) 和 cd90-cd45ra ) 和 cd90-cd45ra+细胞 (丰富的淋巴髓质祖细胞 [lmp])。将闸门分别重命名为hsc、 mpp-emp和lmp。
- 完成后, 确保"人口" 层次结构包含六个按以下顺序组织的层次结构项: 1) 所有事件;2) 散射;3) cd34+;4) hsc;5) mpp-emp;6) lmp。确保流图和闸门的形状如图 4所示。
- 运行未染色的浓缩前 wbc, 以调整 fsc、ssc 和所有荧光通道的电压 (表 2, 样本 5)。运行单染色补偿珠, 调整相邻通道之间的补偿 (表 2, 样本 1-4)。使用调整和补偿的协议运行所有剩余的未染色和染色样品, 以记录 cd34 浓缩效率 (表 2, 样品 6-9)。
请注意:将最终样品 (表 2, 示例 10) 保留在步骤2.4 中, 用于同时进行流分析和单元排序。
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将细胞分选器配置为 cd34 子集的分选纯化, 用于成菌落细胞 (cfc) 检测。
注:如果使用了不同的计算机进行分析 (步骤 2.2), 请按照前面步骤 2.2.1-2.2.5 中所述, 在单元分选器上设置协议。- 调整电池分拣软件中左右流的角度电压, 将电池沉积到含有氟氯化碳介质的15毫升管中。配置侧流的角度, 以防止不对中。从一步的角度来看, 微调偏转侧流的角度, 直到被分类的细胞击中氟氯化碳介质, 而不是管道的一侧, 因为很少有细胞被排序。
- 在 "浏览器" 中, 打开 "全局工作表" 文件夹, 并使用 "浏览器" 窗口顶部菜单中的按钮创建新的排序布局。将 "收集设备" 下拉菜单中的条目更改为2 管, 将 "精度" 下拉菜单中的条目更改为4 路纯度或"单细胞", 并将 "目标事件" 设置为 800-1, 200 单元格。左键单击排序位置字段 (左或右), 选择菜单中的"输入添加", 然后从菜单中选择要排序的填充。
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对细胞进行氟氯化碳检测。
注:氟氯化碳检测的排序仅对 cd34 浓缩产品中的电池进行 (表 2, 样本 10)。- 加载样本 10, 记录 2, 000-3, 000个事件, 并微调排序门, 以适应信号强度和目标人群。
- 安装完成后, 获取单元格 (表 2, 样本 10)。获取步骤2.2.3 中所述的数据, 将流量调整为 500-1, 000 细胞, 并从 i) 散射门、(ii) cd34+门、(iii) hsc 门、iv) mpp-emp 门和 v) lmp 门分成含有3.6 毫升氟氯化碳的单独管 媒体。
请注意:氟氯化碳检测的排序仅对 cd34 浓缩产品中的细胞进行 (表 3, 样本 10)。散点和 cd34+ 门的单元必须单独排序, 而 hsc、mpp-emp 和 lmp 可以同时排序到左右管支架位置。 - 涡旋和分配1毫升细胞悬浮液的 3 x 3.5 厘米无菌, 非组织, 培养治疗 petri 培养皿。在37°c 的温度下, 将细胞在二级容器 (例如15 厘米的培养皿) 中培养10-14天。
- 在10-11 后, 根据菌落形态, 根据菌落形态, 根据每个条件计算所有三个板块的单个菌落。
3. cd34+ hspc 的基因修饰与隔夜恢复 (第0天)
- 在 hank 平衡盐溶液的50毫升中, 将 1μμμl ch-296 溶液稀释2.5 毫升至 50μgl (hbss, 见材料表)。
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准备 lv 转导的烧瓶。
- 确定所需非组织培养 (非 tc) 处理烧瓶的大致数量 (通常从步骤1.4 中确定的细胞计数)。计划在每个 t-75 烧瓶的10毫升介质中的 1 x 10 7 个单元板 (1 x10 8个总单元需要10个烧瓶), 并包括一个未经 tc 处理的12井板 (模拟转导条件).从步骤3.1 到每个片板, 加入无菌 hbss 和 50μgl ch-296 库存, 浓度为 2μgcm 2.对于 t-75 瓶, 使用 hbss 的3毫升, 每瓶 50μgl ch-296 + 7 毫升;对于12孔板, 每口井使用 160μml ch-296 + 340μl hbss。
- 允许盘子在干净的长凳上或引擎盖里不受干扰地坐在干净的长凳上或引擎盖里 2小时. 吸收 ch-296, 并将其替换为类似体积的无菌 hhss + 2% 的牛血清白蛋白 (bsa)。在 rt 中培养 30分钟, 吸入 hbssw bsa, 并用含有 2.5% 1 m hepes 的类似无菌 hbss 清洗洗碗, ph 7.0。在电镀细胞之前立即吸气 (步骤 3.4)。
请注意:按照步骤 3.2.2, 不要让盘子/烧瓶干涸。含有无菌 hbss + 2.5% 1 m hepes 的板材在4°c 隔夜保持 (即, 在一天 -1 准备)。
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从第1天开始采集和传递 cd34+细胞。
- 使用10毫升移液器, 用无菌 hbss 反复温和地冲洗每个培养瓶, 冲洗松散粘附的细胞。确保所有细胞都能分离 (如有必要, 将烧瓶拍打以松开细胞)。
- 以 800 x克离心细胞 5分钟, 吸吸上清液, 并将细胞在转导介质中重新悬浮到 1 x10 6 细胞的浓度。一旦收集了所有的细胞, 使用血细胞仪或自动细胞计数器确定细胞数量。
- 在 ch-296 涂层12井板的一井 (用于模拟转染的对照样品) 中加入1毫升的细胞悬浮液 (1 x 10 6 细胞)。将其余细胞分成 t-75 烧瓶 (步骤 3.2.2), 每个烧瓶增加约10毫升 (1 x 107个单元格)。允许细胞在37°c 孵育, 5% co2孵育 30分钟, 并将瓶盖通风, 从而粘附在 ch-296 涂层上。
- 解冻病毒调节介质 (vcm,材料表), 并以每毫升感染单位 (iu/ml)28、29、30、31、32 确定滴度.从步骤3.3.3 将适当体积的 vcm 添加到每个 t-75 烧瓶中, 并在37°c、5% co2 的温度下孵育细胞。
请注意:如果进行一次转导, 隔夜孵育;如果执行双重转导, 在没有洗液恢复阶段的第一次转导后大约6-8小时重复这一步骤, 然后孵育一夜。例如, 对于一个烧瓶 (1 x10 7个细胞), 其所需的感染多样性 (moi) 为 10, 添加1毫升的病毒, 在 1 x 10 8/ml处计量。
4. 细胞收获和输液准备 (第一天)
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收获细胞。
- 收集被转移的细胞和模拟细胞, 如步骤 3.3.1-3.3.2 中所述。用 hbss 的10毫升进行连续清洗, 将清洗转移到与细胞的锥形管。确保所有单元格都已从烧瓶中取出, 必要时将烧片拍打。
- 以 800 x 克离心细胞悬浮液 5分钟, 吸入上清液, 并在 hbss 的1毫升中重新悬浮颗粒。将含有相同条件的细胞的管子结合起来。用10毫升的 hbss 冲洗每个, 并在细胞悬浮液中添加。使用血细胞仪确定细胞计数。使 hbss 中的细胞总体积达到50毫升, 离心机在 800 x克处达到5分钟。
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脉冲前列腺素 e2 (pge2), 并为输液产品制备试剂。
- 在 hspc 介质中吸收上清液并将被转移的细胞 (不模拟) 重新悬浮到 5 x 10 6/ml,而不存在细胞因子。加入 10mm pge2, 最终浓度为 10μm, 将细胞在冰上培养 2小时, 每30分钟轻轻旋转一次。
- 在步骤4.2.1 中, 热失活自体血清 (材料表), 用蜡纸包裹容器, 在56°c 孵育 30分钟, 在 hbss 中制备2% 的自体血清 (hbss 中的500μl 热灭活血清 + 24.5 毫升), 将其混合良好, 以及将混合物存放在冰上, 直至使用。此外, 在步骤 4.2.1, 收获模拟转染细胞在一个12孔板通过移液细胞大力向上和向下。将细胞悬浮液加入15毫升锥形管, 用 hbss 1 毫升清洗 3x, 并将清洗加入相同的 15 ml 锥形管。
- pge2 孵育2小时后, 将细胞以 800 x 克离心 5分钟, 丢弃上清液, 清洗2倍细胞。第二次清洗后, 使用血细胞仪或自动细胞计数器, 以适当的 hbss 体积重新悬浮细胞进行计数。
请注意:细胞经常在 pge2 脉冲后聚集, 这可能会导致细胞计数不太可靠。如果是这样, 请使用步骤4.1.2 的单元格计数, 而不是步骤4.2.3 中的单元计数。
- 用于输液产品质量控制的模拟和转染细胞 (步骤 5): 用于流式细胞分裂细胞分选的 5 x 10 5 至 1 x10 6个细胞 (步骤5.1 和 5.3) 和用于液体培养的大约 1 x10 6个细胞(步骤 5.2) 和菌落聚合酶链反应 (pcr) (步骤 5.4)。
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准备输液产品。
- 与其余的被转导细胞一起, 在 hbss 50 毫升的情况下进行第三次清洗, 吸入上清液, 并在 hbss 10 毫升 + 2% 的自体血清中重新悬浮细胞 (步骤4.2.2 准备)。将 10 ml 溶液放入装有 16.5 g 针的20毫升注射器中。用10毫升的 hbss + 2% 的自动血清清洗管, 并将清洗液放入同一注射器中, 使总体积达到20毫升。用针头帽封住注射器, 给注射器贴上标签, 放在冰上进行输液。
- 通过中心静脉导管 33, 34, 将被转染的细胞产物注入位于经认可的动物研究设施内的自体宿主中。监测移植动物的完整血细胞计数 (cbc) 和血液化学, 并根据项目1、6、19进行特定研究的基因标记检测。
5. 质量控制
请注意:流式细胞术和细胞分选后, 细胞被注入动物, 作为步骤4.4.2 中描述的后续行动的一部分。在移植后立即使用流动细胞学数据来确定输液产品中表型定义的干细胞和祖细胞亚群的组成 (步骤5.1 和 5.3), 而氟氯化碳检测的分析则进行12-14天通过菌落 pcr (步骤 5.4) 测定基因修饰效率。
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对输液产品进行流式细胞仪和氟氯化碳分选。
- 如第2部分所述, 通过流式细胞仪和氟氯化碳检测 cd34 子集进行分选纯化。从模拟和转染 cd34 细胞 (pge2 脉冲后的输液产物) 中提取的种子氟氯化碳检测。
- 如步骤2.4 中所述, 对每个条件和涡流、平板、培养和计数氟氯化碳检测最多可分类800个细胞。计数后, 从氟氯化碳检测中选择菌落, 以执行步骤5.4 中所述的菌落 pcr。
-
液体培养
- 用于在非 tc 处理的板的 hspc 介质中进行液体培养的板细胞, 在 1 x 10 6/ml。在第2天、第5天和第12天的转导、收获和计数细胞进行流式细胞术。不需要对氟氯化碳检测进行细胞分类。
- 在第2天和第5天, 在新的 hspc 介质中以 1 x 10 6/ml 复制33% 的细胞.冻结 dna 提取缓冲液中33% 的细胞进行定量实时 pcr 处理。如步骤2.1 和2.2 中所述, 使用33% 的细胞进行流式细胞术。
- 利用步骤5.2.2 的这些数据分析造血后代的表型组成。确定 cd34 + 细胞和表型定义子集的频率, 如每个样本中的步骤2.2.2 中所述。比较不同条件下 cd34+细胞的组成, 以确定基因修饰的效果。
请注意:cd34+细胞应在整个培养过程中保持其表达, 并包含所有表型子集。cd90+cd45ra的丢失-细胞或表型亚群的过度表示可能表明基因修饰的间接或直接影响。
-
通过流式细胞术 (可选, 取决于实验设置) 量化跨基因表达 (如绿色荧光蛋白 [gfp]), 并根据实验设置调整步骤2.2 的协议。
- 添加三个显示 sc/转基因的流动图 (例如, sc gfp)。将第一个图在 hsc 上打开, 在 MPPs-EMPs 上打开第二个情节, 在 lmp 上打开第二个情节. 每个图与转基因 (例如, gfp) 的绘制, 并分别创建名为 hsc-gfp+、mpp-emp+和 lmp-gfp+的门。
- 完成后, "人口" 层次结构必须按以下顺序包含九个层次结构组织的条目: 1) 所有事件;2) 散射;3) cd34+;4) hsc;5) hsc-gfp+;6) mpp-emp;7) mpp-emp-gfp+;8) lmp;9) lmp-gfp+。
请注意:在液体培养的后期 (例如第5天和第12天) 中的任何转基因表达都能更好地反映步骤5.4 中菌落 pcr 确定的基因修饰效率。由于 lv 不整合, 液体培养中的早期时间点可能高估了转基因表达。同样, 第1天用于氟氯化碳检测的流分选 gfp+细胞将导致许多假阳性菌落。
-
执行菌落 pcr。
- 在2.4.4 和5.1.1 的步骤中计数后, 将单个菌落放入50μl 的 dna 提取缓冲液中, 使用10μl 或20μl 移液器, 上下移液器将菌落转移到8管 pcr 带帽的一个管中。从模拟条件中选取8个菌落, 从转换条件中选取88个菌落, 生成一个完整的96孔板。在每口井中加入50μl 的 dna 提取缓冲液。
- 从菌落中提取 dna, 使用热环器和以下程序: 65°cq20 分钟, 99°c 10分钟, 和4°c 保持。计划尽快将 dna 移动到-20°c, 以获得最佳质量。
- 使用 lenti fper 引物, 使用 actin f/r 和对照引物 (材料表), 对 lv + 菌落的数量进行定量, 并对其进行菌落 pcr定量。
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Representative Results
上述协议旨在分离和基因修饰 nhp cd34 + hspc,这些方法随后可以重新注入自体主机 (图 1和图 2)。当遵循这一协议时, 我们通常从猪尾猕猴的底漆 bm 中获得高达 8 x 10 9 的 wbc, 有时, 从恒河猴那里获得两倍的金额.在这两个物种中, 我们丰富的 cd34+ hspc 的数量与 wbc 总数的输入成正比 (图 3)。先前的研究结果显示, cd34+ hspc 产品的总数包括不真实的长期移植 hsc 的细胞. 因此, 我们开发了基于流式细胞仪的技术 (图 4), 并使用氟氯化碳检测 (图 5-6)识别培养中的长期 hsc 和承诺的祖细胞子集。与真正的 hsc 不同, 承诺的祖细胞在体内会持续一段相对较短的时间。最后, lv 介导的基因修饰策略在培养的 cd34 + hspc中产生了强大的基因标记。这些细胞在培养时间长达 2周, 部分原因是为了减少从非集成 lv 载体表达 gfp 的 "假阳性" 细胞的数量。由于这些细胞在细胞基因组中没有稳定地携带 lv 载体的整合副本, 它们将在12天的液体培养试验中稀释 (图 7)。
图 1: 自体、基因修饰的 nhp hspc 产品的生产.该协议分离 cd34+ hspc (第1天), 基因修饰这些细胞 (第0天), 并在48小时的时间内准备输液产品 (第1天)。菌落形成、液体培养和相关的体内检测将再持续 2周, 以确定这些产品的特征。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 事件的时间线.在大约2天内执行协议的每个步骤的平均时间。各个步骤的时间取决于干细胞源 (协议的步骤 1) 和/或基因修饰的类型 (协议的步骤 3)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 猪尾和恒河猴骨髓的白细胞和 cd34 产量.浓缩 cd34+ hspc 计数 (协议的步骤 1.4) 作为10个猪尾猕猴 (正方形) 和6个恒河猴 (三角形) 的总白细胞计数 (协议1.3.3 步骤) 的函数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: cd34 富型和基因改性产品质量控制的 go枢纽策略.总白细胞 ("浓缩前") 和随后富含 cd34 的 hspc 被染色含有 cd34、cd45、cd90 和 cd45ra 特有的抗体, 以便量化 hscc、mpp-、empp--和 lmp 富集 cd34 亚群的数量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 基因修饰前后 cd34+细胞的形态.顶部面板: 三个具有代表性的明亮场图像从 hspc 殖民地检测。底部面板: gfp 荧光对应于上面的每个明亮场图像。刻度栏 = 1 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: cd34+细胞和分选纯化子集的成菌体 (cfc) 潜能.在第一天 (协议第1节和第2节) 和第1天 (协议第5节) 对 hspc 子集的氟氯化碳检测进行排序纯化后, 根据形态特征对单个菌落进行评分。cfu-mix = 混合髓质 (白色) 和红血球 (红色) 细胞;bfu-e = 仅红细胞;cfu-g = 粒细胞;cau-gm = 粒细胞和巨噬细胞;cau-m = 巨噬细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 液体培养中基因修饰细胞的代表性流式细胞仪数据.gd34 + hspc 在与 gfp 表达 lv 载体传导后的百分比。转导后, 细胞被培养2周。随着时间的推移, gfp+事件的减少反映了携带非集成 lv 载体的细胞的 gfp 信号丢失。请点击这里查看此图的较大版本.
| 名字 | 内容 |
| 溶血性缓冲器 | 150 mm 氯化铵, 12 m 碳酸氢钠, 0.1 mm edta 双蒸水 (ddh2o) |
| 商用缓冲器 | 磷酸盐缓冲盐水 (1x) ph 值 7.2, 0.5% bsa, 2 mm edta |
| 流式细胞仪缓冲 | 磷化盐水 (1x) ph 值 7.2, 2% 胎儿牛血清 |
| hbss + 2% bsa | 汉克平衡盐溶液, 2% 牛血清白蛋白 |
| hspc 媒体 | stemspan sfem ii, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ngml 每个重组人 tpo、scf、flt-3 |
| 传导介质 | 干细胞 sfem ii, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ngml 每个重组人 tpo, scf, flt-3, 1μgml 环孢菌素, 4 ugml 硫酸钴胺 |
表 1: 缓冲器和介质配方。
| Id | 体育 | pecf594 | apc-cy7 | v450 | 描述 |
| 1 | cd90 | 补偿珠 | |||
| 2 | cd34 | 补偿珠 | |||
| 3个 | cd45ra | 补偿珠 | |||
| 4个 | cd45 | 补偿珠 | |||
| 5 | cd34 浓缩前未染色的 wbc | ||||
| 6 | cd90 | cd34 | cd45ra | cd45 | cd34 浓缩前的染色 wbc |
| 7。 | 未染色的流动 wbc (ft) | ||||
| 8 | cd90 | cd34 | cd45ra | cd45 | 染色的流动 wbc (ft) |
| 9 | cd34 富型产品的未染色 wbc | ||||
| 10 | cd90 | cd34 | cd45ra | cd45 | cd34 富集产品的染色 wbc |
表 2: 用于 cd34 浓缩和基因改性电池产品质量控制的代表性流面板。
| 抗原 | 克隆 | 氟铬 | 激光 | 滤波器 |
| cd45 | d058-1284 | v450 | 395海里 | 450/40 纳米 |
| cd90 | 5.00E+10 | 体育 | 488纳米或532纳米 | 585/42 海里 |
| cd34 | 563 | pe-cf594 | 488纳米或532纳米 | 610/20 纳米 |
| cd45ra | 5h9 | apc-cy7 | 633海里 | 77/60 纳米 |
| v450:50 纳米紫罗兰色;pe: 苯甲菊酯;pe-cf 594: 来自 biotium 的商标名称;apc: 叶绿素7 | ||||
表 3: 用流式细胞仪和细胞分选进行质量控制的抗体染色面板。
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Discussion
lv 载体工程是最有特征的基因修饰细胞类型的方法, 如 cd34 + hspc,用于随后的体内移植。这里描述的协议旨在最大限度地增加长期在体内持续存在的基因修饰 hspc 的数量, 并为各种恶性、传染性和遗传疾病患者提供临床好处。尽管在过去十年中出现了基因编辑策略, 但 lv 修饰细胞是在体外、动物模型和 1、8、20、21、22患者中研究得最好的细胞。
根据我们在该协议方面的丰富经验, 浓缩纯 cd34+ hspc (即 gt;80 占分类细胞产品中 cd34+细胞的百分比) 是成功的一个关键方面。由于这些细胞来自整个 bm wbc 的混合种群, 低纯度培养物可能包括不会长期移植的细胞, 进而降低注入自体宿主的真正干细胞的剂量。此外, 高质量的 lv vcm 将确保基因修饰的最高效率。
为了解决浓缩 cd34+ hspc 产品纯度方面的缺陷, 通常有用的是验证用于分离这些细胞的试剂的质量, 即抗 cd34 抗体 (我们的小组从杂交瘤细胞系内部纯化), 以及结合抗体标记细胞的磁珠。我们建议使用10的 moi, 并可选择重复此传导 (moi 10 x 2)。重要的是, 应在对 vcm 进行质量评估后, 根据经验确定 moi, 包括在 ht108029 等标准化滴定细胞系上对每个矢量进行滴定。重要的是, 不同的 vcm 生产实验室可能使用不同的滴定细胞系, 包括 hos30、hla31 和293t32, 这可能会限制比较设施之间的滴定度的能力.我们更喜欢使用该检测方法对载体进行重新采样, 以计算出最精确的 vcm 量, 从而有效地对 cd34 + hspc靶细胞进行基因修饰。一旦获得高质量的 cd34+ hspc 和 vcm, 转染效率和雕刻在三个不同的步骤进一步提高。首先, 在转导介质中添加环孢菌素有助于载体转导的早期步骤, 并将其整合到目标细胞35,36, 而硫酸丙胺减少慢病毒载体之间的排斥力粒子和细胞表面33,37。其次, 用重组纤维连接蛋白片段 (如 retronectin, ch-296) 治疗板提高转导效率, 并提高基因修饰 hspc 33, 38 的体内植入物电位, 39岁值得注意的是, 以前的研究表明, ch-296 只是在 33,38转导过程中很重要, 但在之前并不重要。最后, 我们脉冲基因修饰细胞产品与 pge2, 以提高雕刻和在体内的持久性, 如先前已显示的人类和非人类灵长类动物 cd34+ hspc 产品40,41。
lv 与它们的前身的巨逆转录病毒载体 (rv) 一样, 随机整合到基因组中。虽然与房车相比, lv 的临床试验数据较少, 但目前的研究结果表明, 由于 lv 的插入突变, lv 方法具有更低的细胞转化风险;由于这种风险 42, rv 策略的使用频率较低。另一个局限性是基因修饰效率低于 100%, 一定比例的基因修饰细胞不会在体内持续存在。例如, 60% 的基因修饰 hspc 产品可能会导致30% 的长期移植, 基因修饰细胞。只要有可能, 这里介绍的基因治疗策略都是通过引入提供治疗效果的转基因来克服这一限制的, 即使在少数造血源细胞8,43 中表达.
基于 lv 的 hspc 修改方法的前景广阔。我们通常使用这个协议来 "基因标记" 细胞, 从而能够在体内进行跟踪1。我们还调整了这一策略, 以比较同一动物体内的 lv 变种。这种 "竞争性" 移植可以比较不同的载体 (例如, 确定效率较高的载体) 和转基因 (例如, 跟踪不同的 hspc 子集或在疾病模型中进行比较)。展望未来, 我们相信 hspc 中的 lv 基因治疗与基因编辑方法一起仍将是一个重要的工具, 特别是在必须在个人一生中稳定地表达大型基因货物的情况下。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢海伦·克劳福德为编写这份手稿, 吉姆·伍拉斯为平面设计, 以及维罗妮卡·纳尔逊和德维卡·钱德拉塞卡兰参与了协议的制定。该议定书的制定得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所 (r01 ai135953 和 AI135953 向香港) 和国家心脏、肺和血液研究所 (r01 hl136135、hl1116、p01 hl121773 和 u19) 的资助。hl129902 至 h. p. k., 以及 nih p51 od010425, 部分通过 nihxnci 癌症中心, 支持 grant p30 ca015704。h. p. k. 是马基分子医学研究员, 作为 josécarrasse. donnall thomas 为癌症研究主席和弗雷德·哈奇担任细胞和基因治疗主席的首次接受者, 得到了支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
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