Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

Målet med denne protokollen er å isolere nonhuman primas CD34+ celler fra primet benmargen, gen-endre disse cellene med lentiviral vektorer, og å forberede et produkt infusjon i autologous verten. Totalt er ca 48 timer.

Abstract

Blodkreft stilk og stamfar (HSPC)-cellen transplantasjon har vært en hjørnestein terapi for leukemi og andre kreftformer for nesten et halvt århundre, ligger under den eneste kjente kuren av humant immunsviktvirus (HIV-1), og viser enorme løftet i behandling av genetiske sykdommer som beta talassemi. Vår gruppe har utviklet en protokoll til modell HSPC genterapi i nonhuman primater (NHPs), slik at forskere til å optimalisere mange av de samme reagenser og teknikker som brukes i klinikken. Her beskriver vi metoder for rensing av CD34+ HSPCs og langsiktig vedvarende blodkreft stem cell (HSC) delsett fra primet benmargen (BM). Identiske teknikker kan anvendes for rensing av andre HSPC kilder (f.eks mobilisert perifert blod stamceller [PBSCs]). Beskrevet er en 2 dagers protokoll der celler er renset, kultivert, modifisert med lentivirus (LV) og forberedt for infusjon tilbake til autologous verten. Nøkkel readouts suksess inkluderer renheten av CD34+ HSPC befolkning, renset HSPCs evnen til å danne morphologically forskjellige koloniene i semisolid medier, og, viktigst, genet modifikasjon effektivitet. Den viktigste fordelen til HSPC genterapi er muligheten til å gi en kilde til langvarige celler som gir opphav til alle blodkreft celletyper. Som sådan, har disse metodene blitt brukt til modell behandling for kreft, genetiske sykdommer og infeksjonssykdommer. I hvert tilfelle, er terapeutiske effekten etablert av forbedrer funksjonen av forskjellige HSPC avkom, inkludert røde blodlegemer, T-celler, B celler eller myelogen delsett. Metodene for å isolere, endre og forberede HSPC produkter er direkte relevant og oversettbare til flere sykdommer i menneskelige pasienter.

Introduction

Stilk cellen genterapi er en kraftig måte å løse et bredt spekter av menneskelig patologi. HSPC gene terapi er en spesielt attraktivt tilnærming, på grunn av i) det er relative enkelt å samle disse cellene fra pasienter, ii) vell av kunnskap som er tilgjengelig om cellen overflaten fenotyper og ex vivo kultur parametere, og feltet utvides, fordi iii) det presenterer forskere med en stadig økende verktøykasse genet modifikasjon strategier tilpasset ulike sykdommer av interesse. Vi undersøker aktivt HSPC gene terapi tilnærminger fra flere vinkler, inkludert grunnleggende vitenskapen om HSPC biologi, engraftment av genet endret HSPCs i preklinisk i vivo modeller og programmet relevante pasientgrupper. Vi og andre har preget cellen overflaten fenotypen funksjonelt forskjellige HSPC delsett1,2,3, mobilisering og condition regimer som maksimerer HSPC avkastning og engraftment samtidig toksisitet4,5og genet modifikasjon og gen-redigering strategier som har blitt skreddersydd til en rekke ondartet, genetisk og infeksjonssykdommer6,7,8, 9,10. Funksjonen og engraftment av genet endret HSPCs kan evalueres på en rekke små og store-dyr modeller, inkludert mus, hunder og NHPs. NHP modeller er spesielt fordelaktig fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer spesifikke for HSPC celle overflaten proteiner som CD34 og CD90, kan brukes om hverandre i menneskelige og NHP celler. Videre, i motsetning til mus, store dyr som NHPs gir en nærmere tilnærming av omfanget av genet modifikasjon nødvendig for klinisk effekt. Endelig NHPs er gullstandarden for modellering av menneskelige sykdommer som HIV-1 smitte11 og er en voksende modellsystem for kandidaten anticancer og anti-HIV immunotherapies12,13.

Formålet med denne protokollen er å skissere metoder for rensing, genetisk modifisere og forberede NHP HSPC infusjon produktene. Selv utenfor rammen av denne protokollen, har vi tidligere vist at disse produktene engraft i autologous NHP verter, gi opphav til alle blodkreft linjene og gir terapeutisk effekt i et bredt spekter av sykdom modeller1. Vi har også preget av clonality av engrafting HSPCs og bygget en plattform for å spore kinetikk, smugling og fenotypen av personlige HSPCs og deres avkom, følgende autolog transplantasjon1,14. Metodene presenteres her er utviklet med følgende mål: i) for å isolere svært ren HSPCs og langsiktig engrafting HSC delsett, ii) å opprettholde primitive HSCs under ex vivo kultur og iii) å effektivt gen-endre enten bulk HSPCs eller lang sikt engrafting HSC delsett. Vi bruker magnetisk-assistert celle-sortering (Mac), samt fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), å isolere svært/funksjonelt forskjellige HSPC befolkninger, samsvar med metoder for mange grupper2,15, 16. Vedlikehold av primitive HSCs i kultur (dvs. minimere differensiering av disse cellene i forpliktet progenitors som gir opphav til fullt differensiert lymfoide og myeloide delsett) er en viktig fasett av protokollen beskrevet her. Selv om vi har tidligere preget tilnærminger for å utvide HSPCs samtidig beholde en primitiv fenotypen17,18, her beskriver vi en protokoll som fokuserer på å opprettholde HSCs via en minimal (48 h) og definert ex vivo kultur.

Effektiv endring av HSPCs og HSC delsett er et sentralt mål i denne protokollen. Blant flere tilnærminger vi har rapportert, to er langt den mest undersøkte i kliniske forsøk: LV-mediert genet modifikasjon og nuclease-mediert genet redigering1,6,19. Gene-redigering strategier bruker en av en rekke nuclease plattformer spesielt endre en målrettet genet av interesse, for eksempel C-C chemokine reseptor inn 5 (CCR5) for behandling av HIV infeksjon7,19 eller Bcl11A for behandling hemoglobinopathies6. Her fokusere vi på LV-mediert genet modifikasjon, der transgene Last integrere semirandomly i genomet1,8,20. En viktig fordel med LV tilnærminger er muligheten til å levere store mengder av genetisk materiale (opp til 8 eller 9 kilobases). Selv om gen-redigering strategier utvikles for å målrette en transgene rundt å integrere bare på et bestemt locus av homologe donor rekombinasjon (HDR), krever disse metodene ytterligere utvikling in vitro og små dyr modeller. I kontrast, har LV vektorer blitt brukt mye i NHPs og pasienter21,22. Viktigere, kan protokollen beskrevet her, som bruker primet BM som starter HSPC kilde, enkelt og bredt tilpasses, for eksempel for å isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, tar vi nytte av høye grad av genetisk likhet mellom NHPs og mennesker bruke reagensene som gjelder for begge arter. Til slutt har denne tilnærmingen blitt tilpasset for å endre andre blodkreft undergrupper, nemlig T celler12,23,24; ankomsten av effektiv T-celle immunterapi tilnærminger har støttet seg tungt på LV plattformen benyttet i denne protokollen. Disse metodene er passende for noen forsker interesse HSPC biologi eller LV-mediert genet modifikasjon. For eksempel HSPC rensing protokollen presenteres her kan brukes til å karakterisere romanen HSC-beriket undergrupper, som beskrevet tidligere1,15,25. Likeledes, LV signaltransduksjon metoder presenteres her kunne likeledes anvendt og videreutviklet for mange andre celletyper og eksperimentelle spørsmål, både i vitro og in vivo modeller.

I sammendraget presenterer vi metoder for å isolere og genetisk endre NHP HSPCs. Disse metodene kan lett tilpasses for andre arter og andre HSPCs. Denne nøye utvalgte protokollen viser store løftet i modellering av effektiv terapi for mange menneskelige sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Autologous NHP transplantasjon, grunning (mobilisering), innsamling av celler og genet modifikasjon gjennomføres konsekvent med publisert tidligere protokoller26. Alle eksperimentelle prosedyrer er vurdert og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité bestående av Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Washington (protokoll #3235 - 01). Alle studier er utført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health ("The Guide"); dyrene ble randomisert til studier.

1. anriking av CD34+ HSPCs og overnatting kultur (dag -1)

  1. Høste BM og tilstanden den.
    1. Mobilisere NHPs med granulocytt koloni-stimulerende faktor (GCSF) i 4 dager som beskrevet tidligere26.
    2. Sedate dyrene med 100 mg/kg av ketamin og 0,03 mL/kg av dexmedetomidine (0,5 mg/mL stock). Administrere analgetika (f.eks. buprenorfin SR) på tiden av trekningen.
    3. Benytter avklipt, barbere dyrets hår fra den proksimale enden av humerus og/eller femur bone(s) og skrubbe huden med jod-baserte skrubb eller en lignende antiseptisk løsning, alternativ med alkohol, og gjenta 3 x. Som en ekstra bedøvende, tilfører periosteum med bupivacaine (2 mg per område, 5 mg/mL lager).
    4. Plasser benmarg aspirasjon nålen (16 G) over webområdet periostal oppføring (medullær orale) og pierce huden, trenge medullær hulrom bruker en roterende bevegelse. Fjern stylet aspirasjon nålen og reservere plassen i et sterilt for videre bruk.
      Merk: Velg periostal oppføring medullær hulrommet i et område av benet som ikke dekkes av muskler og hvor figuren/landskapet av benet er enten synlig eller lett kan merkes gjennom huden (vanligvis mot proksimale eller distale slutten av benet).
    5. BM nålen, knytte en sprøytens som inneholder en blanding av antikoagulerende citrate druesukker løsning (ACD-A) og heparin (20 USP/mL, 1 mL per 9 mL margtransplantasjon inn).
    6. Trekke stempelet tilbake mens forsiktig rocking lem og rotere det, røre sprøyten å blande leveringstanken og antikoagulerende. Rotere nålen og flytte det hele aspirasjon og uttak til en større prosentandel av celler innen benmarg.
    7. Når prøven er samlet, Fjern nålen og legge press på aspirasjon området til blødning stopper.
      Merk: Avhengig behov, kan benmarg fra en til fire lemmer (to humeri, to femurs) bli trukket under én samling. Mer enn 20 mL skal samles fra hvert lem, og det totale volumet samlet bør være mer enn 10% av dyrets vekt (10 mL/kg).
    8. Hvis mottar aspirates fra flere lemmer, kombinere og registrere volumet.
    9. La NHP komme seg postanesthesia.
      1. Reversere effektene av dexmedetomidine med 0,03 mL/kg atipamezole (5 mg/mL stock) etter inngrepet. Gi analgetika (f.eks. buprenorfin SR) som foreskrevet av klinisk veterinary stab for minst 48 timer etter prosedyren eller lenger, på skjønn det kliniske veterinarian, basert på klinisk underskriver.
      2. Returnere dyret til buret sitt hjem etter inngrepet, og overvåke den hver 15-20 min, til dyret er i stand til å sitte sin egen. Overvåke dyret daglig av veterinæren personalet til det fastslås at stedet/stedene som aspirasjon er helbredet. I tillegg dataskjerm for tegn på betennelse, infeksjon eller smerte.
    10. Parallelt med cellen behandling, tilstand den samme NHP med myeloablative hele kroppen bestråling (TBI): 1,020 cGy frekvensen av 7 cGy/min. administrere bestråling i fraksjonert doser over 2 dager før cellen infusjon.
  2. Hemolyze BM.
    1. Dele BM i 50 mL konisk rør (10-12 mL per tube) og legge Hemolytisk buffer for å bringe volumet til 50 mL (tabell 1). Inkuber cellene ved romtemperatur (RT) før de er lysed men ikke lenger enn for 7 min. sentrifuge 800 x g i 5 min og Sug opp nedbryting fra pellet(s), forlater 2-5 mL av volum/rør. Resuspend pellet i residualvolum.
      Merk: Vellykket lysed prøver endre farge, fra en mørk rød til en gjennomsiktig lys rød.
    2. Legge til 10-15 mL Hemolytisk buffer/pellets. Fjern alle blodpropp bruker 70 µm celle siler. Legge til Hemolytisk buffer opptil 50 mL ruge i 5 min på RT og spinne på 800 x g i 5 min.
    3. Sug opp nedbryting og resuspend cellene i 10 mL av Mac buffer (tabell 1). Filtrere igjen gjennom en 70 µm celle sil. Skyll i rør og filteret med 40 mL Mac buffer opptil 50 mL.
  3. Berike CD34+ celler fra de hemolyzed hvit blod cellene (WBCs) ved hjelp av standardprotokoller.
    1. Spinne cellene på 800 x g for 15 min. Sjekk rør for å sørge for at ingen celle swirls er tydelig i top/midten. Hvis celler finnes over pellet, spinn igjen på en høyere hastighet (opptil 1000 x g maksimal) og opptil 10 min.
    2. Sug opp nedbryting og resuspend det i 10 mL eller mindre Mac buffer, bemerker nøyaktig volumet. Tell cellene på en 1: 100 eller 1:1,000 fortynning bruker en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
      Merk: Dette totalt antall angis før berikelse.
    3. Legge til Mac buffer for å bringe til celle konsentrasjonen til 1 x 108 celler/mL. Om nødvendig først Gjenta 1.3.1 - 1.3.2 (f.eks på grunn av en lav pre berikelse teller). Reservere 5 x 106 celler i Mac buffer for HSC delsett flekker (pre berikelse utvalget).
    4. Legge til unconjugated anti-CD34 antistoff (klone 12,8, Tabell for materiale)27 gjenværende pre berikelse cellene til en siste konsentrasjon av 40 µg/mL (1 x 108 celler/mL). Inkuber celle suspensjon på 4 ° C på et rør rotator (se Tabell for materiale) i 25-30 min.
    5. Bruk Mac buffer å bringe volumet til 50 mL og spinne cellene på 800 x g for 5 min. Sug opp nedbryting, resuspend cellene i 50 mL av Mac buffer og spinn igjen på 800 x g i 5 min.
    6. Degas 100 mL Mac buffer med to filter rør, innpakning luftinntak med voks papir, for 25-30 min eller til klar til bruk.
    7. Beregne nødvendig volumet av magnetiske perler: 1 mL av perler/109 celler. Sug opp nedbryting og resuspend cellene til 108 celler/mL, når perlene er lagt til. For eksempel: 3 x 109 celler + 3 mL av perler + 27 mL Mac buffer til 30 mL av totalt volum.
    8. Inkuber celle suspensjon på 4 ° C på et rør rotator i 25-30 min.
    9. Erverve magneter for kolonnene; tenkt å bruke 0,6 x 109 celler per kolonne. Plasserer kolonnene på magneten og Plasser en 50 mL konisk rør under hver kolonne samle flyten gjennom. Forberede en 15 mL konisk tube og stempelet for hver kolonne for elueringsrør (trinn
    10. Når inkubering i trinn 1.3.8 er fullført, legger Mac bufferen til 50 mL og spinne på 800 x g for 5 min. leveringstanken nedbryting og resuspend cellene i degassed Mac buffer (2 mL per kolonne). Pipetter forsiktig for å unngå å innføre bobler.
    11. Uten at kolonnen å gå tørr, legge 1 mL av degassed Mac buffer til hver kolonne, etterfulgt av 2 mL celle suspensjon. Skyll filteret og opprinnelige tube med degassed Mac buffer og dele løsningen likt mellom kolonner (6 mL/kolonne); Legg deretter til 7 mL av degassed Mac bufferen for siste vask.
    12. Forsiktig dra kolonnen fra magneten (trykk topp baksiden) og samle siste dryppe i gjennomflytsenhet røret. Legge til 5 mL degassed Mac bufferen til hver kolonne og bruk av stempelet for å elute cellene i sterilt konisk røret fra trinn 1.3.9. Samle ikke væske når boblene vises.
  4. Tell cellene i både den beriket og gjennomflytsenhet (FT) samling rør i fortynning forholdet 1:10. Holde cellene på is. Aliquot 1 x 106 celler fra CD34-beriket brøk og 5 x 106 celler fra FT fraksjoner for analyse av flowcytometri. Lagre FT brøken på 4 ° C til kvalitetskontroll (trinn 2) er avsluttet.
    Merk: Antall CD34+ celler kreves for vellykket multilineage engraftment i NHP er avhengig av hyppigheten av HSC-beriket CD34+CD90+CD45RA- delsett. Basert på en gjennomsnittlig frekvens på 3% - 5% og minimumskravet til 122 000 CD34+CD90+CD45RA- celler per kilo vekt1, er det anbefalt å fortsette med minst 2,5 x 10 totalt6 og opp til 10 x 10 6 CD34+ celler per kilo kroppsvekt.
  5. Legge til Mac. buffer i CD34+ beriket brøk til en 50 mL totalt, spinne på 800 x g i 5 min, Sug opp nedbryting og resuspend cellene til 106 celler/mL i HSPC medier (tabell 1).
    1. Plate cellene på en tetthet av 106 celler/mL i ventilerte, vev-kultur (TC)-behandlet T-75 flasker, 10-20 mL per kolbe, og ruge dem over natten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Hold flasker på langs (ikke stående).
      Merk: Eventuelt ekstra CD34+ celler eller CD34- FT kan være cryopreserved i 90% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) i en konsentrasjon av 1 x 106 5 x 106 celler/mL, så sakte-avkjølt- 80 ° C (f.eks bruker frysing beholdere). Gjennomsnittlig utvinning avkastningen av cryopreserved celler er avhengig av CD34+ renhet og ofte varierer fra 50% til 80% med en levedyktigheten til > 80%.

2. kvalitetskontroll av CD34-beriket celler (dag -1)

  1. Forberede prøver flowcytometri.
    1. Resuspend prøver reserveres fra hver isolasjon scenen nevnt ovenfor (pre berikelse, FT og CD34-beriket brøker) i FACS buffer ved en konsentrasjon av 10 x 106 celler/mL og overføre 100 µL av hver celle suspensjon (tabell 1) slik FACS.
      Merk: Kontroll prøver bør inkludere unstained kvinne celler fra hver isolasjon scene (f.eks 5 x 105 celler) for å videresende xy (FSC), siden xy (SSC) og autofluorescence i hver fluorescens kanal. Dessuten, må single-farget kompensasjon perler for hver fluorochrome-konjugerte antistoffer justere for kompensasjon mellom nærliggende kanaler (tabell 2 og tabell 3).
    2. Legg til ønskede antistoffer (f.eks anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA og anti-CD90), i henhold til produsentens instruksjoner, for en test (1 x 106 celler i 100 µL) (tabell 3). Inkuber etter 20 min på 4 ° C. Legge 3 mL FACS buffer og spinn på 800 x g i 5 min, Sug opp nedbryting, resuspend i 100 µL FACS bufferen og analysere på en passende flyt cytometer (trinn 2.2).
  2. Klargjøre flyt cytometer/cellen sorter for analyse.
    Merk:     er det anbefalt å utføre analysen på samme maskin som skal brukes for celle sortering i trinn 2.3.
    1. Generere en protokoll som FSC/SSC, CD45/CD34 og CD45RA/CD90 (tre flyt tomter). Høyreklikk på flyt tomten og legge til befolkningen hierarkioppsett.
    2. Venstreklikk på FSC/SSC tomten, Velg funksjonen polygon gate, og tegn en gate for å utelate rusk og døde celler. Merk den nye porten og endre navnet til punktdiagram i vinduet inspektør.
      Merk: Dette kalles automatisk som P1.
    3. Høyreklikk i midten av CD45/CD34 flyt tomten, navigere å vise bestanderog gate plottet på scatter. Tegne et rektangulært gate rundt CD45intCD34+ celler å ekskludere ikke-CD34 celler og nonhematopoietic celler, som vel som gjenværende blodplater og erytrocytter (CD45-). Endre porten til CD34+.
    4. Gate CD45RA/CD90 flyt plottet på CD34+ befolkningen. Tegne tre uavhengige subgates rundt CD90+CD45RA- celler (beriket for HSCs), CD90-CD45RA- celler (beriket for multipotent og erythro-myelogen progenitors [fremsendingshastighet/Samkjøringsmodellen]) og CD90-CD45RA + celler (beriket for lympho-myelogen progenitors [LMPs]). Endre portene til HSCog MPP-EMP LMP, henholdsvis.
    5. Når fullført, kontrollerer du at befolkningen hierarkiet inneholder seks hierarkisk organisert oppføringer i følgende rekkefølge: 1) alle hendelser; 2) punkt; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Kontroller at flyten tomter og formen på porten ser som vist i Figur 4.
    6. Kjør unstained kvinne før berikelse WBCs for å justere spenningen for FSC, SSC og alle fluorescens kanaler (tabell 2, prøve 5). Kjør single-farget kompensasjon perler for å justere kompensasjon mellom nærliggende kanaler (tabell 2, prøver 1-4). Kjør alle gjenværende unstained kvinne og farget prøver med den justerte og kompensert protokollen, for å dokumentere CD34 berikelse effektivitet (tabell 2, prøver 6-9).
      Merk: Holde siste prøven (tabell 2, prøve 10) for den samtidige flyt analyse og sortering i trinn 2.4.
  3. Konfigurere cellen sorter for Sorter-rensing av CD34 delsett i colony-forming celle (CFC) analyser.
    Merk:     om en annen maskin har blitt brukt for analyse (trinn 2.2), definerer protokollen på cellen sorter som tidligere beskrevet i trinnene 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Justere vinkel/spenning for venstre - og høyre streamer i cellen sorter programvare for å sette inn celler på 15 mL rør som inneholder CFC medium. Konfigurere vinkelen på siden strømmen hindre skjevheter. Trinnvis, finjustere vinkelen på forandret retning siden strømmen til sorterte cellene treffer CFC mediet og ikke på siden av røret fordi svært få celler er sortert.
    2. Åpne mappen Global regneark i leseren, og oppretter en ny form-layout ved hjelp av menyen øverst i nettleservinduet. Endre oppføringen i rullegardinmenyen samlingen enheten til 2 rør, oppføringen i rullegardinmenyen presisjon for 4-veis renhet eller enkelt celle og angi mål hendelsene til 800-1200 celler. Venstre-klikk på feltet form-plassering (venstre eller høyre), Velg den oppføringen legge i menyen og velg befolkningen sortere fra menyen.
  4. Sortere celler for CFC analyser.
    Merk:     sortering for CFC analyser utføres bare med celler fra CD34-beriket produktet (tabell 2, eksempel 10).
    1. Laste eksempel 10 registrere 2,000-3,000 hendelser og fine Juster Sorter portene til signal styrke og målet befolkningen.
    2. Når installasjonen er fullført, erverve celler (tabell 2, eksempel 10). Hente data som beskrevet i trinn 2.2.3 justere infusjonshastigheten 500-1000 celler/s og sortere 800-1200 celler fra i) Scatter porten, ii) på CD34+ gate, iii) HSC porten, iv) MPP-EMP porten og v) LMP porten inn i separate rør som inneholder 3,6 mL av KFK Media.
      Merk: Sortering for CFC analyser utføres bare med celler fra CD34-beriket produktet (tabell 3eksempel 10). Celler fra Scatter og CD34+ portene må sorteres, mens HSCs, MPP-Samkjøringsmodellen og LMPs kan sorteres samtidig i den venstre og høyre holderen posisjonen.
    3. Vortex og 1 mL av cellen suspensjon til hver av de 3 3,5 cm steril, nontissue, kultur-behandlet Petri retter. Inkuber cellene på 37 ° C for 10-14 dager i en sekundær beholder (f.eksen 15 cm Petriskål).
    4. På dager 10-11 postplating, Tell personlige kolonier fra alle tre plater per betingelse, basert på kolonien morfologi.

3. genet modifikasjon av CD34+ HSPCs og overnatting gjenoppretting (dag 0)

  1. Fortynne 2,5 mL 1 µg/µL CH-296 løsning 50 µg/mL i 50 mL av Hanks balansert salt løsning (HBSS, se Tabellen for materiale).
  2. Forberede kolber LV signaltransduksjon.
    1. Angi antall nontissue-kultur (ikke-TC)-behandlet flasker nødvendig (vanligvis fra celletall i trinn 1.4). Planlegger å plate 1 x 107 celler i 10 mL av media per T-75 kolbe (1 x 108 totalt celler krever 10 flasker) og inkluderer en ikke-TC-behandlet 12-vel plate (mock signaltransduksjon tilstand). Legge til sterilt HBSS og 50 µg/mL CH-296 lager fra trinn 3.1 hver kolbe/platen, i en konsentrasjon av 2 µg/cm2. T-75 flasker, bruk 3 mL 50 µg/mL CH-296 + 7 mL av HBSS; 12-vel platen, bruke 160 µL av 50 µg/mL CH-296 + 340 µL av HBSS per brønn.
    2. Tillate retter å sitte uforstyrret ved RT på en ren benk eller i panseret for 2 h. leveringstanken CH-296 og erstatte den med en lignende mengde sterilt HBSS + 2% bovin serum albumin (BSA). Ruge på RT i 30 min Sug opp HBSS/BSA og vaske med en lignende mengde sterilt HBSS med 2,5% 1 M HEPES, pH 7.0. Sug opp umiddelbart før plating cellene (trinn 3.4).
      Merk: Etter trinn 3.2.2, tillater ikke plater/flasker tørke. Plater som inneholder sterilt HBSS + 2,5% 1 M HEPES holdes på 4 ° C over natten (dvs., forberede dagen -1).
  3. Høste og transduce CD34+ celler fra dag -1.
    1. Bruker en 10 mL pipette, skyll løst tilhenger celler av den gjentatte, milde skylling av hver kultur kolbe med sterilt HBSS. Kontroller at alle celler vil løsne (eventuelt trykk/dask flasken for å løsne cellene).
    2. Sentrifuge cellene på 800 x g i 5 min Sug opp nedbryting og resuspend cellene i signaltransduksjon medier til en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL. Når alle celler har blitt samlet, bestemme celletall, bruke en hemocytometer eller automatisert celle teller.
    3. Tilsett 1 mL av cellen suspensjon (1 x 106 celler) en brønn av lm-296-belagt 12-vel plate (for uekte-transduced kontroll prøven). Dele resten av cellene blant T-75 flasker (trinn 3.2.2), legge til ca 10 mL (1 x 107 celler) per kolbe. At cellene å overholde CH-296 belegget av rugende på 37 ° C, 5% CO2 i 30 min, med caps ventilert.
    4. Tine virus-conditioned media (VCM, Tabell for materiale) og bestemme titer i smittsomme enheter per milliliter (IU/mL)28,29,30,31,32 . Legg den aktuelle mengden VCM til hver T-75 kolbe fra trinn 3.3.3 og ruge cellene på 37 ° C, 5% CO2.
      Merk: Hvis utfører en enkelt signaltransduksjon, ruge over natten; Hvis utfører en dobbel signaltransduksjon, gjenta denne stepapproximately 6 - 8 h etter den første signaltransduksjon uten en vask og utvinning fase og deretter ruge over natten. For eksempel for en kolbe (1 x 107 celler) med en ønsket mangfoldighet av infeksjon (MOI) 10, legge 1 mL av viruset titered på 1 x 108 IU/mL.

4. celle Harvest og forberedelser for infusjon (dag 1)

  1. Høste celler.
    1. Samle transduced og narr cellene som beskrevet i trinnene 3.3.1 - 3.3.2. Utføre sekvensiell vasker med 10 mL av HBSS, overfører vasker til konisk røret med celler. Kontroller at alle cellene er fjernet fra kolber, tappe/slapping flasker om nødvendig.
    2. Virvel av cellen suspensjon 800 x g i 5 min Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av HBSS. Kombinere rør som inneholder celler fra samme betingelse. Skyll med 10 mL av HBSS og legge det til celle suspensjon. Bestemme celletall ved hjelp av en hemocytometer. Få total-celle volumet til 50 mL i HBSS og sentrifuge 800 x g for 5 min.
  2. Puls prostaglandin E2 (PGE2) og forberede reagenser infusjon produktet.
    1. Sug opp nedbryting og resuspend de transduced cellene (ikke mock) til 5 x 106/mL i HSPC media uten cytokiner. Legge 10 mM PGE2 til en siste konsentrasjon av 10 µM. ruge cellene på is 2 h, forsiktig virvlende dem enhver 30 min.
    2. Under trinn 4.2.1, varme-Deaktiver autologous serum (Tabell for materiale), innpakning beholderen i voks papir og rugende den på 56 ° C i 30 min. forberede 2% autologous serum i HBSS (500 µL av inaktivert serum + 24,5 mL av HBSS), bland dem godt, og Lagre blandingen på is til bruk. Også under trinn 4.2.1, høste uekte-transduced celler i en 12-vel plate av pipettering cellene opp og ned kraftig. Legge til celle suspensjon slik 15 mL koniske, vaske dem 3 x med 1 mL av HBSS, og Legg til vasker i samme 15 mL konisk rør.
    3. Etter 2 timer med PGE2 inkubering, vaske cellene 2 x sentrifugering dem på 800 x g i 5 min og forkaster nedbryting. Etter andre vask, resuspend cellene i en passende mengde HBSS for opptelling, en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
      Merk: Celler ofte klumpe seg etter en PGE2 puls, noe som kan gi mindre pålitelige celletall. I så fall bruke celletall fra trinn 4.1.2 i stedet for en fra trinn 4.2.3.
  3. Reservere uekte og transduced celler for kvalitetskontroll (trinn 5) av infusjonen produktet: 5 x 105 til 1 x 106 celler flyt cytometri/cell sortering (trinn 5.1 og 5.3) og ca 1 x 106 celler for flytende kultur (trinn 5.2) og koloni polymerasekjedereaksjons (PCR) (trinn 5.4).
  4. Klargjøre infusjon produktet.
    1. Med resten av transduced cellene, utføre en tredje vask i 50 mL av HBSS, Sug opp nedbryting og resuspend cellene i 10 mL av HBSS + 2% autologous serum (forberedt i trinn 4.2.2). Trekke 10 mL løsningen i en 20 mL sprøyte med en 16,5 G nål. Vask røret med 10 mL HBSS + 2% automatisk serum og trekke vask i samme sprøyten å bringe det totale volumet til 20 mL. Cap sprøyten med nål cap, etiketten sprøyten og plassere den på is transport/infusjon.
    2. Tilfører transduced celle produktet inn i autologous vert, ligger et akkreditert Forsøksdyrutvalget anlegg, via en Sentralt venekateter33,34. Overvåke transplantert dyr komplett blodlegemer teller (CBCs) og blod kjemikalier og utføre studie-spesifikke gen-merking analyser skreddersydd til prosjektet1,6,19.

5. kvalitetskontroll

Merk: Flow cytometri og celle sorteringen utføres når cellene er tilført i dyr som en del av oppfølging beskrevet i trinn 4.4.2. Flow cytometric data brukes umiddelbart etter transplantasjon til å bestemme sammensetningen av svært definerte stammen og stamfar celle undergrupper infusjon produktet (trinn 5.1 og 5.3), mens analyse av CFC søk utføres 12-14 dager postinfusion å bestemme genet modifikasjon effektiviteten av kolonien PCR (trinn 5.4).

  1. Utføre flowcytometri og CFC sortering av infusjonen produktet.
    1. Analysere cellene av flowcytometri og Sorter-rense CD34 delsett for CFC analyser, som beskrevet i del 2. Frø CFC søk fra uekte og transduced CD34 celler (infusjon produktet etter byens PGE2).
    2. Sortere maksimalt 800 celler per tilstand og vortex, plate, kultur, og telle CFC analyser som beskrevet i trinn 2.4. Etter å telle, plukke koloniene fra CFC analyser utføre kolonien PCR som beskrevet i trinn 5.4.
  2. Flytende kultur
    1. Plate celler for flytende kultur i HSPC medier på 1 x 106/mL i ikke-TC-behandlet plater. På dager 2, 5 og 12 posttransduction, høste og telle celler for flowcytometri. Cellen sortering for CFC analyser er ikke nødvendig.
    2. Replate 33% av cellene i frisk HSPC media på 1 x 106/mL på dager 2 og 5. Fryse 33% av cellene i DNA utvinning buffer for kvantitative sanntid PCR. Bruk 33% av cellene for flowcytometri som beskrevet i trinnene 2.1 og 2.2.
    3. Bruke disse dataene fra trinn 5.2.2 for å analysere fenotypiske sammensetningen av blodkreft avkom. Bestemme frekvensen av CD34 + celler og svært definerte delsett som beskrevet i trinn 2.2.2 innenfor hvert utvalg. Sammenligne sammensetningen av CD34+ celler mellom betingelser til å bestemme effekten av genet modifikasjon.
      Merk: CD34+ celler skal opprettholde sitt uttrykk gjennom hele kultur og inneholder alle fenotypiske delsett. Tap av CD90+CD45RA- celler eller en overrepresentation av phenotypical delsett kan angi indirekte eller direkte effekter av genet modifikasjon.
  3. Kvantifisere transgene uttrykk (f.eks., grønne fluorescerende protein [GFP]) av flowcytometri (valgfritt og avhengig av eksperimentelle oppsettet), tilpasse protokollen fra trinn 2.2.
    1. Legge til tre flyt tomter viser SSC/transgene (f.eks SSC/GFP). Gate den første tomten på HSCs, andre på fremsendingshastighet-Samkjøringsmodellen og tredje LMPs. Plot hvert mot transgene (f.eks GFP) og opprette gates kalt HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+og LMP-GFP+, henholdsvis.
    2. Når fullført, befolkningen hierarki må inneholde ni hierarkisk organisert oppføringer i følgende rekkefølge: 1) alle hendelser; 2) punkt; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Merk: Et transgene uttrykk senere i flytende kultur (f.eks dager 5 og 12) bedre gjenspeiler genet modifikasjon effektiviteten avhenger av kolonien PCR i trinn 5.4. Tidligere tidspunkt i flytende kultur kan overvurdere transgene uttrykket, på grunn av unintegrated LVs. Tilsvarende fører flyt-sortering GFP+ celler for CFC analyser på dag 1 mange falske positive kolonier.
  4. Utføre kolonien PCR.
    1. Etter telling i trinn 2.4.4 og 5.1.1, plukke enkelt kolonier i 50 µL av DNA utvinning buffer, bruker en 10 µL eller 20 µL Pipetter og Pipetter opp og ned for å overføre koloniene til en tube med en 8-tube PCR stripe cap. Velg åtte kolonier fra narr tilstanden og 88 kolonier fra transduced tilstanden til å generere en full 96-brønns plate. Legge til 50 µL DNA utvinning bufferen i hver brønn.
    2. Ekstra DNA fra koloniene, med en thermocycler og følgende program: 65 ° C/20 min, 99 ° C/10 min og en 4 ° C holder. Planlegg å flytte DNA til 20 ° C så snart som mulig for optimal kvalitet.
    3. Utføre kolonien PCR å kvantifisere LV-transduced celler, sammenligne antall LV+ kolonier, bruker Lenti F/R primere, til totalt kolonier, bruker begrepsordbok F/R og kontroll primere (Tabell for materiale).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor er utformet til å isolere og gen-endre NHP CD34+ HSPCs, som senere skal infunderes inn autologous verten (figur 1 og figur 2). Når du følger denne protokollen, vi få vanligvis opptil 8 x 109 totalt WBCs fra primet BM fra pigtail aper og noen ganger dobbel beløpet fra rhesus aper. I begge arter, antall CD34+ HSPCs som vi berike er proporsjonal med input av det totale antallet (Figur 3). Tidligere funn viser at den totale CD34+ HSPC produktet inkluderer celler som ikke er sanne, langsiktig engrafting HSCs. Derfor, vi har utviklet flyt-cytometri-baserte teknikker (Figur 4) og bruker CFC analyser (tall 5-6) å identifisere langsiktige HSCs og forpliktet stamfar delsett i kulturer. I motsetning til ekte HSCs, vil forpliktet progenitors vedvare en relativt kort tidsperiode i vivo. Til slutt, LV-mediert genet modifikasjon strategi resultatene i robust genet merking i kulturperler CD34+ HSPCs. Disse cellene er overvåket over opptil 2 uker i kultur, delvis for å redusere antall "falsk positiv" celler som uttrykker GFP fra nonintegrated LV vektorer. Fordi disse cellene ikke bære en stabilt integrert kopi av LV vektoren i mobilnettet genomet, vil de fortynne ut over 12-dagers flytende kultur analysen (figur 7).

Figure 1
Figur 1: produksjon av en autologous, gen-endret NHP HSPC produkt. Protokollen isolerer CD34+ HSPCs (dag -1), gen-endrer disse cellene (dag 0), og forbereder en infusjon produkt (dag 1) en 48 h klokkeslett løpet. Kolonien formasjon, flytende kultur, og relaterte ex vivo analyser fortsette i ytterligere 2 uker for å karakterisere disse produktene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: tidslinjen hendelsesforløpet. Gjennomsnittstid for å utføre hvert trinn av protokollen, ca 2 dager. Tidspunktet for individuelle trinnene varierer avhengig av stilk cellen kilden (trinn 1 av protokollen) og/eller av genet modifikasjon (trinn 3 av protokollen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: hvite blodlegemer og CD34 gi fra primet pigtail og rhesus macaque benmarg. Beriket CD34+ HSPC teller (trinn 1.4 av protokollen) som en funksjon av totale hvite blodlegemer teller (trinn 1.3.3 protokollen) fra 10 pigtail aper (ruter) og seks rhesus aper (trekanter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for kvalitetskontroll av CD34-beriket og gene endret. Totalt antall hvite blodlegemer ("pre berikelse") og senere CD34-beriket HSPCs er farget med antistoffer spesifikke for CD34, CD45, CD90 og CD45RA, for å kvantifisere antall HSC, MPP, EMP- og LMP-beriket CD34 delsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: morfologi av CD34+ celler før og etter genet modifikasjon. Topp paneler: tre representant brightfield bilder fra HSPC koloni analyser. Nedre paneler: GFP fluorescens tilsvarer hver brightfield bildet ovenfor. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Colony-forming celle (CFC) potensialet i CD34+ celler og Sorter-renset delsett. Følgende sorter rensing for CFC søk fra HSPC delsett på dag -1 (delene 1 og 2 av protokollen) og dag 1 (del 5 av protokollen), enkelt koloniene er scoret basert på morfologiske egenskaper. CFU-MIX = blanding av myelogen (hvit) og erythroid (rød) celler. BFU-E = bare erythroid celler. CFU-G = granulocytter; CFU-GM = granulocytter og monocytter/makrofager; CFU-M = makrofager/monocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representant flyt cytometric data fra gene endret celler i flytende kultur. Andelen CD34+ HSPCs etter signaltransduksjon med en GFP-uttrykke LV vektor. Celler er kultivert for opptil 2 uker etter signaltransduksjon. En nedgang i GFP+ hendelser over tid gjenspeiler tap av GFP signal fra celler bærer nonintegrated LV vektorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn Innholdet
Hemolytisk Buffer 150 mM salmiakk, 12 mM natriumbikarbonat, 0,1 mM EDTA i dobbel-destillert vann (ddH2O)
Kommersiell Buffer Fosfat-bufret saltvann (1 X) pH 7.2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
FACS buffer Fosfat-bufret saltvann (1 X) pH 7.2, 2% fosterets Bovine Serum
HBSS + 2% BSA Hanks balansert Salt løsning, 2% bovin Serum Albumin
HSPC Media StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL hver rekombinant menneskelige TPO, SCF, FLT-3
Signaltransduksjon Media StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL hver rekombinant menneskelige TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL Ciklosporin, 4 ug/mL Protamine Sulfate

Tabell 1: Buffer og media formuleringer.

ID PE PECF594 APC-Cy7 V450 Beskrivelse
1 CD90 Kompensasjon perler
2 CD34 Kompensasjon perler
3 CD45RA Kompensasjon perler
4 CD45 Kompensasjon perler
5 Unstained kvinne WBCs før CD34-berikelse
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farget WBCs før CD34-berikelse
7 Unstained kvinne WBCs av flyten gjennom (FT)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farget WBCs av flyten gjennom (FT)
9 Unstained kvinne WBCs av CD34-beriket produkt
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farget WBCs av CD34-beriket produkt

Tabell 2: Representant flyt panelet for kvalitetskontroll av CD34-beriket og gen-modified celler.

Antigen Klone Fluorochrome Laser Filter
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 nm
CD90 5.00E + 10 PE 488 nm eller 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 nm eller 532 nm 610/20 nm
CD45RA 5H 9 APC-Cy7 633 nm 780/60 nm
V450: violet 450 nm; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: varemerke navn fra Biotium; APC: Allophycocyanin-cyanine 7

Tabell 3: Antistoff flekker panelet for kvalitetskontroll av flowcytometri og celle sortering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV vektor engineering er best preget metoden gen-endre celletyper som CD34+ HSPCs, for etterfølgende transplantasjon i vivo. Protokollen beskrevet her er utformet for å maksimere antall genet modifisert HSPCs som vedvarer langsiktig i vivo, og gi kliniske fordeler til pasienter med ulike ondartet smittsomme og genetiske sykdommer. Selv om gen-redigering strategier har dukket opp det siste tiåret, LV-endret celler er best studerte i vitro, dyremodeller og pasienter,1,,8,,20,,21,,22.

Basert på vår erfaring med denne protokollen, anriking av ren CD34+ HSPCs (dvs. > 80% av CD34+ celler i sorterte celle produktet) er en viktig del av suksess. Fordi disse cellene er avledet fra en blandet befolkning av totale BM WBCs, inkluderer lav renhetsgrad kulturer celler som ikke vil engraft langsiktig, igjen redusere dosen av ekte stamceller som er tilført i verts-autologous. I tillegg sikrer høykvalitets LV VCM høyeste effektiviteten av genet modifikasjon.

På adressen mangler i renhet beriket CD34+ HSPC produkter, er det ofte nyttig å validere kvaliteten på reagensene brukes til å isolere disse cellene, nemlig anti-CD34 antistoffer (som vår gruppe renser huset fra en hybridoma celle linje), og magnetiske perler som binder antistoff-merket celler. Vi anbefaler en MOI 10, mulighet til å gjenta denne signaltransduksjon (MOI 10 x 2). Viktigere, bør MOI fastsettes empirisk, etter en kvalitetsvurdering av VCM, inkludert Serine hver vektor på en standardisert titering cellen som HT108029. Viktigere, kan ulike VCM-produserende laboratorier bruke forskjellige titering linjer, inkludert HOS30, HeLA31og 293T32, noe som kan begrense evnen til å sammenligne titers mellom fasiliteter. Vi foretrekker å retiter en vektor med analysen, for å beregne nøyaktig mengden VCM effektivt gen-endre CD34+ HSPC målet celler. En gang høy kvalitet CD34+ HSPCs og VCM er anskaffet, signaltransduksjon effektivitet og engraftment blir ytterligere forsterket i tre ulike trinn. Først styrker tillegg av Ciklosporin til signaltransduksjon media hjelpemidler tidlig trinnene av vektor signaltransduksjon og integrering i målet celler35,36, mens protamine sulfate reduserer frastøtende mellom lentiviral vektoren partikler og cellen overflaten33,37. Andre behandler platene med et rekombinant fibronectin fragment (f.eks RetroNectin, CH-296) øker signaltransduksjon effektivitet og forbedrer også i vivo engraftment potensial genet endret HSPCs 33,38, 39. Spesielt, tyder tidligere studier på at lm-296 er bare viktig i, men ikke før, signaltransduksjon33,38. Til slutt, vi puls genet endrede cellen produkter med PGE2 å forbedre engraftment og utholdenhet i vivo, som tidligere har vært vist for menneskelige og nonhuman primas CD34+ HSPC produkter40,41.

LVs integrerer tilfeldig i genomet, som sin forgjenger, gammaretroviral vektorer (RVs). Selv om mindre kliniske studier data er tilgjengelig for LVs enn for RVs, tyder gjeldende funn på at LV tilnærminger bære vesentlig lavere risiko av cellen transformasjoner på grunn av LV insertional mutagenese; RV strategier brukes sjeldnere på grunn av denne risikoen42. En ytterligere begrensning er at effektiviteten av genet modifikasjon er mindre enn 100%, og en andel av genet endret celler beholdes ikke i vivo. For eksempel en 60% genet endret HSPC produktet kan resultere i 30% langsiktige engrafting, gen-endret celler. Mulig gene terapi strategier presenteres her er utformet for å overkomme denne begrensningen ved å innføre effekter av transgener som tilbyr terapeutiske effekten, selv når uttrykt i et mindretall av blodkreft opprinnelse celler8,43 .

Fremtiden er lys for LV-baserte HSPC endring tilnærminger. Vi har rutinemessig Bruk denne protokollen til "gene-merke" celler, aktivere sporing i vivo1. Vi har også tilpasset denne strategien for å sammenligne LV varianter i samme dyret. Slike "konkurransedyktig" transplantasjoner tillater en sammenligning av ulike vektorer (f.eks å identifisere dem med bedre effektivitet) og effekter av transgener (f.eks spore ulike HSPC delsett eller sammenligne dem i sykdom modeller). Fremover, tror vi at LV genterapi i HSPCs vil være et viktig verktøy sammen med gene-redigering tilnærminger, spesielt i situasjoner hvor store genetiske Last må være stabilt uttrykt for levetiden av en person.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Helen Crawford for å forberede dette manuskriptet, Jim Woolace for grafisk design, og Veronica Nelson og Devikha Chandrasekaran for å delta i utviklingen av protokollen. Utviklingen av denne protokollen ble støttet av tilskudd fra NIH National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (R01 AI135953 og AI138329 til H.P.K.) og National hjerte, lunge og blod Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 og U19 HL129902 til H.P.K.), samt NIH P51 OD010425, og delvis gjennom NIH/NCI Cancer Center, støtte Grant P30 CA015704. H.P.K. er en Markey molekylær medisin etterforsker og mottatt støtte som den første mottakeren av José Carreras/E. Donnall Thomas utstyrt stolen for kreftforskning og Fred Hutch utstyrt stolen for celle- og Gene Therapy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

Genetikk problemet 144 blodkreft stilk og stamfar celler gene terapi hematopoiesis nonhuman primas modell cellen aisolering lentiviral vektorer
Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter