Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Abstract

Hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) transplantasyonu lösemi için bir temel taşı tedavisi ve diğer kanserler için neredeyse yarım asır oldu, insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) enfeksiyon tek bilinen tedavisi altında yatan ve büyük söz gösterir beta talasemi gibi genetik hastalıkların tedavisinde. Bizim Grup modeli HSPC gen terapisi insan dışı primatlar (NHPs), bir iletişim kuralına bilim adamları birçok aynı reaktifler ve klinikte uygulanan teknikleri optimize etmek izin geliştirmiştir. Burada, CD34 arıtma yöntemleri tarif+ HSPCs ve uzun vadeli kalıcı hematopoetik kök hücre (HSC) alt kümeleri astarlanmalıdır kemik iliği (BM) üzerinden. Aynı teknikleri diğer HSPC kaynakları (örneğin, seferber periferik kan kök hücreleri [PBSCs]) arıtma için istihdam edilebilir. Özetlenen hangi hücrelerin saf, kültürlü, lentivirus (LV) ile modifiye ve otolog ana geri içine infüzyon için hazırlanan bir 2 gün iletişim kuralıdır. Başarının anahtar veriler dahil CD34 saflığı+ HSPC nüfus, saf HSPCs morfolojik farklı koloniler halinde semisolid medya ve en önemlisi, gen değişiklik verimliliği formu yeteneği. Anahtar HSPC gen tedavisi için tüm hematopoietik hücre tipleri için ortaya çıkmasına uzun ömürlü hücre bir kaynak sağlama yeteneği avantajdır. Bu nedenle, bu yöntemler modeli tedavilere kanser, genetik hastalıklar ve bulaşıcı hastalıklar için kullanılmıştır. Her durumda, kırmızı kan hücreleri, T hücreleri, B hücreleri ve/veya miyeloid alt kümeleri dahil olmak üzere farklı HSPC Döl fonksiyonu güçlendirerek terapötik etkinlik kurulur. İzole etmek için yöntemleri değiştirmek ve HSPC hazırlamak ürünleri doğrudan uygulanabilir ve çevrilebilir insan hasta birden çok hastalık.

Introduction

Kök hücre gen terapisi insan patolojiler geniş bir yelpazede çözmek için güçlü bir araçtır. HSPC gen tedavisi hastaların, bu hücreler toplama i) göreli kolaylığı II) ile ilgili hücre yüzey fenotipleri ve ex vivo kültür parametreler kullanılabilir ve alan olarak genişleten bilgi zenginliği nedeniyle özellikle çekici bir yaklaşımdır, Çünkü III) gen değişikliği stratejilerinin ilgi çeşitli hastalıklar için özel olarak tasarlanmış bir artan toolbox ile bilim adamları sunar. Aktif HSPC gen terapisi yaklaşımlardan temel bilim HSPC biyoloji, gen-modified HSPCs preklinik içinde vivo modellerinde engraftment ve ilgili hasta nüfus uygulamaya dahil olmak üzere çoklu açıları araştırıyoruz. Biz ve diğer hücre yüzey fenotip işlevsel olarak farklı HSPC alt kümeleri1,2,3, seferberlik ve HSPC verim ve en aza indirirken engraftment en üst düzeye çıkarmak Klima rejimleri nitelendirmiştir toksisite4,5ve Gen değiştirme ve bir geniş yelpazede malign, genetik ve bulaşıcı hastalıklar6,7,8, özel gen düzenleme stratejileri 9,10. İşlev ve engraftment HSPCs gen-modified, küçük ve büyük-hayvan - modelleri, fareler, köpekler ve NHPs de dahil olmak üzere bir dizi olarak değerlendirilebilir. Özellikle, çünkü birçok reaktifler, örneğin, antikorlar HSPC hücre yüzey proteinleri CD34 ve CD90, gibi belirli insan ve NHP hücreler birbirinin yerine kullanılabilir NHP modelleri avantajlı. Ayrıca, fare aksine, NHPs gibi büyük hayvanlar gen değişikliği ölçeğini daha yakın bir yaklaşım klinik etkinlik için gerekli izin. Son olarak, NHPs HIV-1 enfeksiyonu11 gibi insan patolojiler modellenmesi için altın standart ve aday antikanser ve anti-HIV immunotherapies12,13için gelişmekte olan bir modeli sistemi vardır.

Bu iletişim kuralı için arındırıcı, genetik değiştirerek ve NHP HSPC infüzyon ürünleri hazırlama yöntemleri anahat amacıdır. Bu iletişim kuralının kapsamı dışında biz daha önce bu ürünler otolog NHP konaklarda engraft göstermiştir rağmen tüm hematopoetik soy ortaya çıkmasına ve hastalık modelleri1geniş bir terapötik etkinlik sağlar. Ayrıca engrafting HSPCs clonality ile karakterize ve kinetik, ticareti ve bireysel HSPCs ve onların Döl, aşağıdaki otolog transplantasyon1,14fenotip izlemek için bir platform inşa. Burada sunulan yöntemleri aşağıdaki hedefleri ile geliştirilmiştir: i) son derece saf HSPCs ve uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri, II) sırasında ilkel HSCs ex vivo kültürü korumak için ve verimli bir şekilde her iki toplu HSPCs gen değiştirmek III) için izole etmek için ya da uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri. Biz yanı sıra floresans aktif hücre (phenotypically/işlevsel ayrı HSPC nüfus, birçok gruplar2,15, yöntemleri ile tutarlı yalıtmak için FACS), sıralama manyetik destekli cep-sıralama (Mac), istihdam 16. İlkel HSCs kültür bakımından (yani, bu hücreler farklılaşma içine tam olarak çıkmasına taahhüt ataları minimize lenfoid ve myeloid alt kümeleri ayırt) burada açıklanan protokol önemli bir yönüdür. Daha önce HSPCs bir ilkel fenotip17,18, burada, koruyarak genişletmek için yaklaşımlar nitelendirmiştir rağmen bir çok az (48 h) HSCs korumak üzerinde odaklanır ve ex vivo kültür tanımlanan protokol açıklar.

HSPCs ve HSC verimli değişiklik alt kümeleri bu iletişim merkezi bir hedeftir. Biz bildirdin çeşitli yaklaşımlar arasında iki farkla en içinde incelenen klinik denemeler vardır: LV-aracılı gen değişikliği ve nükleaz aracılı gen1,6,19düzenleme. Gen-düzenleme stratejileri bir nükleaz platformlar bir dizi özellikle ilgi hedeflenen bir gen değiştirmek için kullanın, örneğin, C-C kemokin reseptör tip 5 (CCR5) HIV enfeksiyonu7,19 veya Bcl11A tedavisi için tedavi için Hemoglobinopati6/. Burada, hangi transgenik yükleri entegre semirandomly genom1,8,20LV-aracılı gen değişikliği ele. LV yaklaşımları önemli bir avantajı yeteneği (en fazla 8-9 kilobases) genetik malzeme büyük miktarlarda sunmak için var. Gen-düzenleme stratejileri yalnızca belirtilen bir odağı entegre ilgi bir transgene hedeflemek için donör Homolog rekombinasyon (HDR) tarafından geliştirilmekte olan rağmen bu yöntemler geliştirme tüp bebek ve küçük hayvan modellerinde daha fazla gerektirir. Buna ek olarak, LV vektörel çizimler NHPs ve hastaların21,22yaygın olarak kullanılmıştır. Önemlisi, hangi kullanır BM başlangıç HSPC kaynağı olarak kullanıma hazır, burada açıklanan protokol kolayca ve geniş, örneğin, PBSCs yalıtmak için adapte edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi her iki tür için tabidir reaktifler kullanmak için NHPs ve insan arasındaki genetik benzerlik yüksek derecede avantajlarından yararlanın. Son olarak, bu yaklaşım hematopoetik diğer alt kümeleri, yani T hücreleri12,23,24değiştirmek için adapte; etkili T hücreli immünoterapi yaklaşımlar gelişiyle ağır bu protokol için kullanılan aynı LV platformda güvendi. Bu yöntemlerin herhangi bir araştırmacı HSPC biyoloji veya LV-aracılı gen değişikliği ilgilenen uygundur. Örneğin, burada sunulan HSPC arıtma Protokolü HSC zenginleştirilmiş roman alt kümeleri tanımlamak için kullanılan1,15,25daha önce açıklandığı gibi. Aynı şekilde, burada sunulan yöntemleri benzer şekilde olabilir LV iletim uygulanan ve daha çok sayıda diğer hücre tipleri ve deneysel soruları, tüp bebek ve içinde vivo modellerinde her ikisi tarafından geliştirilmiştir.

Özetle, biz yöntemleri yalıtmak ve genetik olarak NHP HSPCs değiştirmek için mevcut. Bu yöntemler diğer türler ve HSPCs ile ilgili diğer kaynakları için kolayca adapte edilebilir. İyice incelenmesi bu iletişim kuralı çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedaviler modellenmesi büyük söz gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Priming otolog NHP nakli, (hareketlilik), hücre ve Gen değiştirme koleksiyonu ile daha önce yayımlanmış protokolleri26tutarlı yapılmaktadır. Tüm deneysel yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi ve Washington Üniversitesi tarafından onaylanmış (#3235 - 01) Protokol. Tüm çalışmalar Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ("The Guide"); sıkı doğrultusunda yapılmaktadır hayvanlar için çalışmalar rastgele.

1. zenginleştirme CD34+ HSPCs ve gecede Kültür (gün -1)

  1. BM hasat ve bu durum.
    1. NHPs granülosit koloni uyarıcı faktör (GCSF) ile 426daha önce açıklandığı gibi gün için seferber.
    2. 100 mg/kg ketamin bas ve 0,03 mL/kg dexmedetomidine (0,5 mg/mL stok) hayvanlarla sakinleştir. Analjezikler (örneğin, buprenorfin SR) çizmek anda yönetmek.
    3. Makası kullanarak, humerus proksimal sonundan hayvanın saç tıraş ve/veya uyluk kemiği bone(s) ve iyot tabanlı fırçalayın ya da benzer bir antiseptik çözüm, alkol ile alternatif ile cildinizi fırçalayın ve 3 x tekrar. Ek bir anestezik kapaklarini bupivacaine (site, 5 mg/mL hisse senedi başına 2 mg) ile süzülür.
    4. Kemik iliği aspirasyon iğne (16 G) periosteal giriş sitesi (medüller kavite) üzerinden getirin ve dönen bir hareket kullanarak medüller kavite derinlemesine cilt, pierce. Aspirasyon iğne stylet kaldırmak ve daha fazla kullanım için steril bir alanda saklıdır.
      Not: Medüller boşluğuna periosteal giriş yeri olarak kaslar tarafından değil kaplıdır ve ya nerede şekli/yatay kemik kemik bir alanda tercih ediyor görünür veya (genellikle distal veya proksimal sonuna doğru kemik) deri yoluyla kolaylıkla hissedilebilir.
    5. Antikoagülan sitrat dekstroz çözüm karışımı içeren doldurulmuş bir şırınga BM iğneye takın (ACD-A) ve heparin (20 USP/mL, 1 mL başına tahsil edilecek iliği 9 mL).
    6. Pistonu hafifçe ampütasyonu sallanan ve mix aspiratı ve antikoagülan şırınga kışkırtmak için döndürme sırasında geri çek. İğne döndürün ve aspirasyon ve para çekme iliği alanı içindeki hücreleri daha büyük bir yüzdesini erişmek için yeniden konumlandırmak.
    7. Bir zamanlar örnek alındığını, iğneyi çıkarın ve baskıyı aspirasyon siteye kadar kanama durur.
      Not: Gerekli birim bağlı olarak kemik iliği bir ila dört bacaklarda (iki humeri, iki uyluk) sırasında tek bir koleksiyon çizilmiş. En fazla 20 mL her ekstremite toplanmalıdır ve toplanan toplam hacim en fazla %10-in hayvanın ağırlık (10 mL/kg) teşkil.
    8. Boğulmadan birden çok bacaklarda alma varsa birleştirmek ve ses kaydedebilirsiniz.
    9. NHP yeniden elde etmek postanesthesia izin ver.
      1. Dexmedetomidine 0,03 mL/kg atipamezole (5 mg/mL stok) ile etkileri işlemden sonra ters. Analjezikler (örneğin, buprenorfin SR) olarak klinik veteriner takdirine en az 48 saat sonra yordam veya uzun için klinik veteriner personel tarafından reçete üzerinde klinik belirtiler dayalı sağlar.
      2. Hayvan ev onun kafes işlemden sonra dönün ve hayvan kendi doğrul yapabiliyor kadar her 15-20 dk izlemek. Monitör hayvan her gün aspirasyon site veya siteleri iyileşene veteriner kadrosu bu kadar tarafından belirlenir. Buna ek olarak, iltihap, enfeksiyon ya da ağrı belirtileri için izleyin.
    10. Hücre işleme paralel olarak aynı NHP myeloablative tüm vücuda radyasyon vermeliyiz (TBY) ile durum: 1.020 cGy fraksiyonlara dozlarda hücre infüzyon önce 2 gün içinde 7 cGy/dak Yönet ışınlama bir hızda.
  2. BM hemolyze.
    1. 50 mL konik tüpler (10-12 mL tüp başına) BM bölün ve hemolitik arabellek 50 mL (Tablo 1) birim getirmek ekleyin. Onlar lysed ama daha uzun 7 dakika santrifüj vasıl 800 x g 5 dakika süreyle ve süpernatant birim/tüp 2-5 mL bırakarak pellet(s) dan Aspire kadar hücreleri (RT) Oda sıcaklığında kuluçkaya. Pelet kalan hacmindeki resuspend.
      Not: Başarılı bir şekilde lysed örnekleri renk, koyu kırmızı şeffaf bir ışık kırmızıya değiştirmek.
    2. 10-15 mL hemolitik arabellek/Pelet ekleyin. Herhangi bir kan pıhtısı 70 µm hücre Süzgeçler kullanarak kaldırın. Hemolitik eklemek ilâ 50 mL tampon, RT, 5 min için kuluçkaya ve spin 800 x g 5 min için de.
    3. Süpernatant Aspire edin ve MAC'ler arabellek (Tablo 1) 10 mL hücrelerde resuspend. Tekrar 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tüp ve 40 mL Mac'ler ile ilâ 50 mL arabellek filtre durulayın.
  3. CD34 zenginleştirmek+ hemolyzed beyaz kan standart protokolleri kullanarak hücrelerden (WBCs) hücreleri.
    1. Hücreleri vasıl 800 x g 15 dk. onay için hiçbir hücre swirls üst/ortada belirgin olduğundan emin olmak için tüpler spin. Pelet hücreler varsa, daha yüksek hızda (en çok 1000 x g maksimum) ve 10 dakikaya kadar için spin.
    2. Süpernatant Aspire edin ve 10 mL resuspend veya tam birim belirterek MAC'ler tamponunun daha az. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak bir 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme, hücreleri saymak.
      Not: Ön zenginleştirme sayısı toplam bu WBC sayısıdır.
    3. 1 x 108 hücre/ml hücre toplama getirmek için MACS arabellek ekleyin. Gerekirse, ilk adımları 1.3.1 - 1.3.2 (örneğin, düşük bir ön zenginleştirme sayısı) nedeniyle yineleyin. 5 x 106 hücre MAC'ler arabelleği HSC alt (Ön zenginleştirme örnek) boyama için saklıdır.
    4. Çekimsiz anti-CD34 antikoru (klon 12,8, Malzemeler tablo)27 40 µg/mL (1 x 108 hücre/mL) son bir konsantrasyon kalan ön zenginleştirme hücrelere ekleyin. Hücre süspansiyon bir tüp rotator üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya ( Tablo reçetesigörmek) 25-30 dk için.
    5. Birim 50 mL getirmek ve hücreleri vasıl 800 x g 5 dakika süreyle spin kullanım MAC'ler tampon süpernatant Aspire edin, MAC'ler tampon ve tekrar 800 x g 5 min için spin 50 mL hücrelerde resuspend.
    6. MAC'ler arabellek hava girişi ile 25-30 dk ya da kullanıma hazır kadar balmumu kağıt sarma iki filtre tüp ile Degas 100 mL.
    7. Manyetik boncuklar gerekli hacmi hesaplamak: boncuk/109 hücre 1 mL. Süpernatant Aspire edin ve boncuk eklendikten sonra 108 hücre/mL, hücrelere resuspend. Örneğin: 3 x 109 hücre + 3 mL boncuk + 27 mL Mac'lerin arabellek toplam hacim için 30 mL.
    8. Hücre süspansiyon üzerinde tüp rotator için 25-30 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
    9. Sırasında mıknatıslar sütunlar için elde etmek; sütun başına 109 hücre x 0.6 kullanmayı planlıyorsanız. Sütunlar üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak için her sütunu aşağıda konumlandırın. Her sütun için elüsyon (adım 15 mL konik tüp ve pistonu hazırlamak
    10. Adım 1.3.8 kuluçka tamamlandığında, MAC'ler arabellek için 50 mL ekleyin ve vasıl 800 x g 5 dk. aspiratı süpernatant spin ve degassed MAC'ler arabellek (sütun başına 2 mL) hücrelerde resuspend. Pipet yavaşça kabarcıklar tanıtımı önlemek için.
    11. Yol sütun izin vermeden, her sütun, hücre süspansiyon tarafından 2 mL takip degassed MAC'ler arabelleği 1 mL ekleyin. Filtre ve özgün tüp degassed MAC'ler arabelleği ile durulayın ve sütun (6 mL/sütun); arasında eşit olarak çözüm bölmek sonra degassed MAC'ler arabellek son yıkama için 7 mL ekleyin.
    12. Yavaşça mıknatıs (itme üst arka) uzak sütun çekin ve son damla akış yoluyla tüpüne toplamak. Her sütun için 5 mL degassed MAC'ler arabellek de ekleyin ve pistonu adım 1.3.9 steril konik tüp içine hücreleri elute uygulayın. Kabarcıklar göründükten sonra herhangi bir sıvı toplamıyoruz.
  4. Zenginleştirilmiş ve akış yoluyla (FT) koleksiyonu tüpler seyreltme oranı 1:10 at hücreleri saymak. Hücreler buz üzerinde tutmak. CD34 zenginleştirilmiş kesir ve 5 x 106 FT fraksiyonları göre Akış Sitometresi Analizi için hücrelerden aliquot 1 x 106 hücre. Kalite kontrol (adım 2) sonucuna kadar FT kesir 4 ° C'de depolayın.
    Not: CD34 sayısı+ NHP başarılı multilineage engraftment HSC zenginleştirilmiş CD34 sıklığına bağlıdır için gereken hücreler+CD90+CD45RA- alt küme küme küme. Bir ortalama sıklığı % 3-%5 ve 122.000 CD34+CD90+CD45RA minimum gereksinimi göre- hücreleri vücudun kilogram başına ağırlık1, toplamda en az 2.5 x 10 ile6 devam için önerilen ve ilâ 10 x 10 6 CD34+ hücreleri vücut ağırlığı kilogram.
  5. MAC'ler Ekle CD34 arabelleğe+ zenginleştirilmiş kesir toplam 50 ml, spin 800 x g 5 min için de, süpernatant Aspire edin ve 106 hücre/mL HSPC medya (Tablo 1) hücrelere resuspend.
    1. Senaryo Özeti 106 hücre/mL Bacalı, doku-Kültür (TC) yoğunluğu plaka-T-75 şişe, şişe, başına 10-20 mL tedavi ve onları gecede bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya. Şişeler boyuna (ayakta değil) bekletin.
      Not: İsterseniz, ek CD34+ hücreleri veya CD34- FT cryopreserved % 90 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) + % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) 5 x 106 hücre/ml 1 x 106 bir konsantrasyon, sonra yavaş-soğutmalı 80 ° C (örneğin, dondurucu kapsayıcılar kullanılarak). Cryopreserved hücrelerin ortalama kurtarma verim CD34 üzerinde bağlıdır+ saflık ve yaygın bir canlılık ile % %80 50 arasında değişmektedir > % 80.

2. kalite kontrol CD34 zenginleştirilmiş hücre (gün -1)

  1. Örnekleri akış sitometresi için hazırlayın.
    1. (Ön zenginleştirme, FT ve CD34 zenginleştirilmiş kesirler) 10 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon, FACS arabellekte belirtilen her yalıtım sahne rezerve örnekleri resuspend ve her hücre süspansiyon (Tablo 1), 100 µL FACS tüp aktarın.
      Not: Kontrol örnekleri günahı her yalıtım sahne (örneğin, 5 x 105 hücreleri) hücrelerden ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) ve autofluorescence her floresans kanaldaki ayarlamasının içermelidir. Buna ek olarak, tek-lekeli tazminat boncuk her fluorochrome Birleşik antikor için bitişik kanal (Tablo 2 ve Tablo 3) arasında tazminat ayarlamak için gereklidir.
    2. Bir test (1 x 106 hücrelere 100 µL) için üreticinin yönergelerine göre istenen antikorlar (örneğin, anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA ve anti-CD90), Ekle (Tablo 3). 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Vasıl 800 x g 5 min için FACS tampon ve spin 3 mL ekleyin, süpernatant Aspire edin, FACS arabellek 100 µL içinde resuspend ve bir uygun akış sitometresi (adım 2.2) analiz.
  2. Akış Sitometresi/hücre sıralayıcısı analiz için hazırlayın.
    Not:     bu hücre adım 2.3 sıralama için kullanılan aynı makinede çözümlemeyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
    1. FSC/SSC, CD45/CD34 ve CD45RA/CD90 (üç akışı araziler) gibi bir iletişim kuralı oluşturun. Bir akış arsa üzerinde sağ tıklayın ve nüfus hiyerarşi düzeni ekleyin.
    2. FSC/SSC arsa üzerinde sol tıklatın, çokgen kapı özelliği seçin ve enkaz ve ölü hücreleri dışlamak için bir kapı çizin. Yeni kapı vurgulayın ve dağılım Inspector penceresinde yeniden adlandırın.
      Not: Bu otomatik olarak P1 adlandırılır.
    3. CD45/CD34 akışı Arsa ortasında sağ tıklatın, Örneğin alınma olasılığını göstermekiçin gidin ve dağılım Arsa kapısı. CD45intCD34 çevresinde bir dikdörtgen kapı+ hücreleri çiz dışlama CD34 olmayan hücreleri ve de artık trombosit ve eritrositler olarak nonhematopoetik hücreleri (CD45-). Kapıya yeniden adlandırmak CD34+.
    4. CD34 CD45RA/CD90 akışı Arsa kapı+ nüfus. Üç bağımsız subgates CD90 etrafında çizmek+CD45RA (HSCs için zenginleştirilmiş)- hücreleri, CD90-CD45RA (multipotent ve erythro myeloid ataları [MPPs/EMP'leri] için zenginleştirilmiş)- hücreleri ve CD90-CD45RA + (lympho-myeloid ataları [LMPs] için zenginleştirilmiş) hücreleri. Kapıları HSC, MPP-EMPve LMP, anılan sıraya göre yeniden adlandırın.
    5. Tamamlandığında, nüfus hiyerarşi altı hiyerarşik olarak düzenlenmiş girdileri aşağıdaki sırayla içerdiğinden emin olun: 1) tüm olayları; 2) dağılım; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Akış araziler ve kapısının şekil Şekil 4' te gösterildiği gibi göründüğünden emin olmak.
    6. Günahı ön zenginleştirme WBCs gerilim FSC, SSC ve tüm floresans kanalları (Tablo 2, örnek 5) için ayarlamak için çalıştırın. Bitişik kanalları (Tablo 2, örnekleri 1-4) arasında tazminat ayarlamak için tek lekeli tazminat boncuk çalıştırın. Koşmak tüm kalan günahı ve örnekleri ile ayarlanan lekeli ve CD34 zenginleştirme verimliliği (Tablo 2, örnekleri 6-9) belgelemek için iletişim kuralı, telafi.
      Not: Son örnek (Tablo 2, örnek 10) eş zamanlı akışı analizi ve hücre 2,4 adımda sıralama için tutun.
  3. Hücre sıralayıcısı koloni oluşturan hücre (CFC) deneyleri CD34 alt kümeleri sıralama arınma için yapılandırın.
    Not:     başka bir makine Analizi (adım 2.2), daha önce açıklanan adımları 2.2.1 - 2.2.5 hücre sıralayıcıda Protokolü ayarlamak için kullanıldı.
    1. Açı/gerilim hücreleri CFC orta içeren 15 mL tüpler içine yatırmak için hücre sıralayıcısı yazılımında sol ve sağ taraftaki akışları için ayarlayın. Hatalı hizalaması engellemek için yan akış açısı yapılandırın. Step-wise, çok az sayıda hücre sıralanır çünkü CFC orta ve tüp tarafı değil sıralanmış hücreleri düğmelerini tıklatana kadar güzel tarafı akış açısı ince ayar yapın.
    2. Tarayıcı, küresel çalışma klasörünü açın ve tarayıcı penceresinin üst menü düğmesini kullanarak yeni bir sıralama düzeni oluşturun. 2 tüplerkoleksiyonu aygıt aþaðý açýlan menüye girişte, 4 yönlü saflık ya da hücre hassas aþaðý açýlan menüye girdisinde değiştirmek ve hedef olaylar 800-1200 hücrelere ayarlayın. Sıralama konumu sahada (sola veya sağa) sol, girdisini ekleyin menüde seçin ve menüden sıralamak için nüfus seçin.
  4. CFC deneyleri için hücreleri sıralamak.
    Not:     CD34 zenginleştirilmiş ürün (Tablo 2, örnek 10) hücrelerle CFC deneyleri sadece gerçekleştirilen için sıralama.
    1. Örnek 10 yükleyin, 2000-3000 olayları kaydetmek ve sinyal gücü ve hedef nüfus sığdırmak için sıralama gates güzel ayarlayın.
    2. Kur tamamlandıktan sonra hücre (Tablo 2, örnek 10) kazanmak. 2.2.3. adımda açıklandığı gibi veri elde etmek, 500-1000 hücre/s için akış hızı ayarlamak ve i) dağılım kapısı, II) CD34 800-1200 hücreleri sıralamak+ kapısı, III) HSC kapısı, IV) MPP-EMP geçit ve v) 3.6 mL CFC içeren ayrı tüpler içine LMP geçidi medya.
      Not: CFC deneyleri için sıralama yalnızca CD34 zenginleştirilmiş ürün (Tablo 3, örnek 10) hücrelerden ile gerçekleştirilir. Dağılım ve CD34 hücrelerden+ gates gerekir sıralanacağı tek tek, oysa HSCs, MPP-EMP'leri ve LMPs aynı anda sağ ve sol Tüp Tutucu pozisyona sıralanabilir.
    3. Girdap ve her 3 x 3, 5 cm steril, nontissue, Petri yemekler kültür tedavi hücre süspansiyon 1 mL dağıtmak. Hücreleri 37 ° C'de 10-14 gün için ikincil bir kap içinde (Örneğin, 15 cm Petri kabına) kuluçkaya.
    4. Gün 10-postplating 11, tüm üç plakaları koloni morfolojisi üzerinde temel koşul, başına gelen bireysel koloniler sayılır.

3. gen modifikasyonu CD34+ HSPCs ve gecede kurtarma (0 gün)

  1. 2,5 mL 1 µg/µL CH-296 çözeltisi 50 µg/ml Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS, bkz: Malzemeler tablo) 50 ml seyreltik.
  2. Şişeler LV iletim için hazırlayın.
    1. Nontissue-Kültür (non-TC) yaklaşık sayısını belirlemek-tedavi şişeler (üzerinden genellikle hücre sayımları 1.4. adımda belirlenen) gerekli. Medya T-75 şişe başına 10 mL 1 x 107 hücrelerde plaka için plan (1 x 108 toplam hücreleri 10 şişe gerektirecektir) ve bir TC tedavi 12-şey plaka (sahte iletim durum) içerir. Steril HBSS ve 50 µg/mL CH-296 stok bir konsantrasyon 2 µg/cm2adımda 3.1 her şişesi/plaka için ekleyin. T-75 şişeler için HBSS 50 µg/mL CH-296 + 7 mL 3 mL kullanın; 12-şey plaka, HBSS, 50 µg/mL CH-296 + 340 µL 160 µL iyi kullanın.
    2. Bulaşıkları RT temiz bir banka veya mahalle 2 h. aspiratı CH-296 için rahatsız edilmeden oturmak ve steril HBSS + % 2 sığır serum albumin (BSA) benzer hacmi ile değiştirmek olanak sağlar. RT 30 min için kuluçkaya, HBSS/BSA Aspire edin ve % 2.5 içeren steril HBSS benzer bir hacmi ile bulaşık 1 M HEPES, pH 7,0. Hemen hücreleri (adım 3.4) kaplama önce Aspire edin.
      Not: Adım 3.2.2, takip plakaları/şişeler kurumasına izin vermez. İçeren steril HBSS + % 2.5 plakaları 1 M HEPES tutulur 4 ° C gece (yani, -1 günde hazırlamak).
  3. Hasat ve CD34 transduce+ hücreleri gün -1.
    1. 10 mL pipet kullanarak, gevşek yapışık hücreleri tekrarlanan, yumuşak, her kültür şişesi ile steril HBSS durulama tarafından durulayın. Tüm hücreleri ayırmak emin olun (gerekirse, dokunun/hücreleri gevşetmek için balonun tokat).
    2. Hücreleri vasıl 800 x g 5 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve iletim medya 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonu hücrelerdeki resuspend. Tüm hücreleri topladıktan sonra bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanan hücre sayısı belirler.
    3. Hücre süspansiyon (1 x 106 hücreleri), 1 mL (için sahte transduced denetimi örneğini) CH-296-kaplı 12-şey plaka bir şey ekleyin. Bölmek hücreleri T-75 şişeler (3.2.2. adım) arasında kalan yaklaşık 10 mL (1 x 107 hücreleri) flask başına ekleme. Bacalı kapaklar ile 37 ° C'de kuluçka, 30 dk, % 5 CO2 tarafından CH-296 kaplama için uygun hücrelere izin.
    4. Virüs şartına medya (VCM, Malzemeler tablo) çözülme ve mililitre (IU/mL)28,29,30,31,32 başına bulaşıcı birimlerindeki titresi belirlemek . VCM uygun hacmi her T-75 şişesi 3.3.3 adımından ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO2hücreleri kuluçkaya.
      Not: Tek bir iletim gerçekleştiren, gecede kuluçkaya; Eğer bir çift iletim gerçekleştiren, bu stepapproximately tekrar 6 - 8 saat sonra yıkama/kurtarma olmadan ilk iletim faz ve, sonra gecede kuluçkaya. Örneğin, bir şişesi için (1 x 107 hücreleri) enfeksiyon (MOI) 10 istenen çeşitliliği ile virüs titered 1 mL 1 x 108 ' de IU/mL ekleyin.

4. hücre hasat ve infüzyon (gün 1) için hazırlık

  1. Hücreleri hasat.
    1. Transduced ve sahte hücreleri adımlarda 3.3.1 - 3.3.2 açıklandığı gibi toplamak. HBSS hücreleri ile konik tüp yıkar aktarılması, 10 mL ile sıralı yıkar gerçekleştirin. Tüm hücreleri dokunarak / şişeler gerekirse tokat şişeler kaldırıldı emin olun.
    2. Hücre süspansiyonlar vasıl 800 x g 5 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve pelet 1 mL HBSS resuspend. Aynı durum hücreleri içeren tüpler birleştirin. Her HBSS 10 mL ile durulayın ve hücre süspansiyon için ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayısı belirler. Toplam hücre hacmi 50 mL HBSS ve 5 min için vasıl 800 x g santrifüj getirmek.
  2. Prostaglandin E2 darbe (PGE2) ve reaktifler infüzyon ürün için hazırlamak.
    1. Süpernatant Aspire edin ve transduced hücreleri (değil alay) 5 x 106/mL sitokinler olmadan HSPC medya için resuspend. 10 son bir konsantrasyon için 10 mM PGE2 eklemek µM. kuluçkaya hücreleri nazikçe onları her 30 dk dönen 2s için buz üzerinde.
    2. 4.2.1. adımı, ısı devre dışı bırakma-otolog serum (Tablo malzemeler), konteyner yağlı kağıda kaydırma ve 30 dk. 56 ° C'de kuluçka hazırlamak onları iyi, HBSS (500 µL serum ısı inaktive + HBSS 24.5 mL), karışımında % 2 otolog serum ve karışımı buz üzerinde kullanmak kadar saklamak. Ayrıca, adım 4.2.1 sırasında yukarı ve aşağı şiddetle hücreleri pipetting tarafından 12-şey plaka sahte transduced hücrelerde hasat. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp eklemek, onları yıkamak 3 x HBSS, 1 mL ile ve aynı 15 mL konik tüp yıkar ekleyin.
    3. Hücreler 2, PGE2 kuluçka 2 saat sonra yıkayın x 800 x g 5 min için de centrifuging ve süpernatant atarak. Sonra ikinci yıkama, HBSS uygun bir hacmi hücrelerde sayım için bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak resuspend.
      Not: Hücreleri sık hangi-ebilmek yapmak için daha az güvenilir hücre sayımları PGE2 nabzı sonra yığın. Eğer öyleyse, bir adım 4.2.3 yerine hücre sayısı adım 4.1.2 kullanın.
  3. Rezerv sahte ve transduced hücreler için infüzyon ürün kalite kontrolü (5. adım): 5 x 105 ' e 1 x 106 6 hücreler sıvı Kültür (adım 5.2) için akış sitometresi/hücre (adım 5.1 ve 5.3) sıralama ve yaklaşık 1 x 10 için hücreleri ve Koloni polimeraz zincir tepkimesi (PCR) (adım 5,4).
  4. İnfüzyon ürün hazırlamak.
    1. Kalanı transduced hücreleri, üçüncü bir yıkama 50 mL HBSS gerçekleştirmek için süpernatant Aspire edin ve 10 mL HBSS + %2 otolog serum (4.2.2 adımda hazırlanan) hücrelerde resuspend. 10 mL solüsyon 16,5 G iğne ile donatılmış bir 20 mL şırınga içine çizin. Tüp 10 mL HBSS + % 2 otomatik serum ile yıkayın ve yıkama toplam hacim için 20 mL getirmek için aynı şırınga içine çizin. Şırınga ile iğne kap kap, şırınga etiket ve buz taşıma/infüzyon için yerleştirin.
    2. Transduced hücre ürün bir akredite hayvan araştırma tesisi içinde üzerinden bir Merkezi venöz kateter33,34bulunan otolog ana bilgisayar içine süzülür. Transplante hayvanlar tam kan hücre sayısı (CBCs) ve kan kimyaları izlemek ve çalışma özel gen-işaretleme deneyleri için proje1,6,19uyarlanmış gerçekleştirin.

5. kalite kontrol

Not: Akış Sitometresi ve hücre sıralama hücreleri hayvanlara 4.4.2 adımda açıklanan takip parçası olarak aşılanmış sonra gerçekleştirilir. Akış sitometrik veri nakli sonra hemen phenotypically tanımlanmış kök ve progenitör hücre alt kümeleri (adım 5.1 ve 5.3) infüzyon ürün kompozisyonu belirlemek için kullanılır, CFC Analizi deneyi ise 12-14 gün gerçekleştirilir gen değişikliği verimliliği koloni PCR (adım 5,4) tarafından belirlemek için postinfusion.

  1. Akış Sitometresi ve CFC infüzyon ürünü sıralama gerçekleştirir.
    1. Hücreleri akış sitometresi tarafından analiz ve 2 bölümünde açıklandığı gibi CD34 alt kümeleri için CFC deneyleri, sıralama arındırmak. Sahte ve transduced CD34 hücreleri (infüzyon ürün PGE2 darbe sonra) tohum CFC deneyleri.
    2. En fazla koşul ve girdap, plaka, kültür başına 800 hücreleri sıralamak ve 2.4 adımda anlatıldığı gibi CFC deneyleri say. Sayım sonra kolonilerin Koloni 5,4 adımda anlatıldığı gibi PCR gerçekleştirmek için CFC deneyleri seç.
  2. Sıvı kültür
    1. Plaka hücreler sıvı kültüründe 1 x 106/mL TC tedavi tabak içinde de HSPC medya için. Gün 2, 5 ve 12 posttransduction, hasat ve akış sitometresi için hücreleri saymak. CFC deneyleri için sıralama hücre gerekli değildir.
    2. 2 ve 5 gün üzerinde 1 x 106/mL de taze HSPC medya hücrelerinin % 33 replate. DNA ekstraksiyon arabellek hücrelerinin % 33 nicel gerçek zamanlı PCR için dondur. Hücrelerin % 33 akış sitometresi için 2,1 ve 2,2 adımlarda açıklandığı gibi kullanın.
    3. Bu veri--dan adım 5.2.2 hematopoetik Döl fenotipik bileşimi çözümlemek için kullanın. Her örnek içinde 2.2.2. adımda açıklandığı gibi CD34 + hücre ve phenotypically tanımlanmış alt kümeleri sıklığını belirler. CD34 kompozisyon karşılaştırın+ hücreleri arasında gen değiştirme etkisini belirlemek için koşulları.
      Not: CD34+ hücreleri onların ifade tüm kültür boyunca korumak ve tüm fenotipik alt kümeleri içerir. CD90 kaybı+CD45RA- hücreleri veya phenotypical alt kümeleri bir overrepresentation gen değişiklik dolaylı ya da doğrudan etkileri gösteriyor.
  3. Akış Sitometresi (isteğe bağlı ve deneysel kurulumuna bağlı olarak) adım 2.2 kuralından adapte tarafından transgene ifade (e.g., yeşil flüoresan protein [GFP]) ölçmek.
    1. SSC/transgene gösterilen üç akışı araziler ekleyin (örneğin, SSC/GFP). İlk arsa HSCs, MPPs EMP'leri ikinci ve üçüncü LMPs. arsa üzerinde her karşı transgene (örneğin, GFP) kapı ve gates HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+ve LMP-GFP+, sırasıyla adlı oluşturun.
    2. Tamamlandığında, nüfus hiyerarşisi aşağıdaki sırada dokuz hiyerarşik olarak düzenlenmiş girişler içermesi gerekir: 1) tüm olayları; 2) dağılım; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Not: Daha sonra sıvı kültüründe herhangi bir transgene ifade (örneğin, 5 ve 12 gün) koloni PCR adım 5.4 tarafından belirlenen gen değişiklik verimliliği daha iyi yansıtır. Önceki zaman puan sıvı kültüründe unintegrated LVs nedeniyle transgene ifade abartma. Benzer şekilde, akışı sıralama GFP+ hücreler CFC deneyleri günde 1 için birçok yanlış pozitif kolonilerde neden olur.
  4. Koloni PCR gerçekleştirin.
    1. 2.4.4 ve 5.1.1 adımlarda sayma sonra tek kolonileri DNA ekstraksiyon arabellek 50 µL almak, 10 µL veya 20 µL kullanarak pipet ve pipet koloniler bir 8-boru PCR bir tüp için yukarı ve aşağı aktarmak için şerit kap. Sahte durum sekiz kolonileri ve 88 kolonileri gelen bir tam 96-şey plaka oluşturmak için transduced koşulu seçin. 50 µL DNA ekstraksiyon arabelleği her şey için ekleyin.
    2. DNA bir thermocycler ve aşağıdaki programı kullanarak kolonileri--dan hulâsa: 65 ° C/20 dk, 99 ° C/10 dk ve 4 ° C tutun. -20 ° C en kısa zamanda en iyi kalite için DNA taşımak planlıyorsanız.
    3. Koloni PCR LV+ koloniler, aktin F/R ve denetim primerler (Tablo reçetesi) kullanılarak toplam sömürgelerine Lenti F/R primerler kullanılarak sayısını karşılaştırarak hücreleri, LV transduced ölçmek için gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokol yalıtmak ve gen NHP CD34 değiştirmek için tasarlanmış+ HSPCs, daha sonra geri otolog ev sahibi (resim 1 ve Şekil 2) infüzyon. Bu protokol sonrası, biz genellikle ilâ 8 x 109 dan helezon makak astarlanmalıdır BM ile toplam WBCs alın ve, bazen, bu tutardan rhesus makak çift. Her iki tür, CD34 sayısı+ biz zenginleştirmek HSPCs toplam WBC sayısı (Şekil 3) giriş için orantılı. Önceki bulgular göstermek toplam CD34+ HSPC ürün doğru uzun vadeli engrafting HSCs. dolayısıyla olmayan hücreler içerir, akış sitometresi-tabanlı teknikleri (Şekil 4) geliştirdik ve CFC deneyleri (rakamlar 5-6) kullanmak uzun süreli HSCs ve kültürlerde kaydedilmiş progenitör alt kümeleri tanımlar. Gerçek HSCs farklı olarak kabul edilen ataları bir nispeten kısa süre içinde vivo temizlenmediği sürece saklanacaktır. Son olarak, LV-aracılı gen değişikliği strateji sonuçları sağlam gen olarak işaretleme kültürlü CD34+ HSPCs. Bu hücreler 2 hafta kültür kısmen GFP nonintegrated LV vektörlerinden hızlı "yanlış pozitif" hücre sayısını azaltmak için üzerinden izlenir. Çünkü bu hücreleri hücresel genom LV vektör stabil entegre bir kopyasını taşır mısın, onlar dışarı 12 günlük sıvı kültür tahlil (Şekil 7) seyreltik.

Figure 1
Resim 1: bir otolog, gen-modified NHP HSPC ürün üretimini. Protokol CD34 izole+ HSPCs (gün -1), gen-Bu hücreler (0 gün) değiştirir ve bir infüzyon ürün (gün 1) 48 h saat boyunca hazırlar. Koloni oluşumu, sıvı kültür ve ex vivo deneyleri devam etmek için ek 2 hafta, bu ürünleri karakterize için ilgili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: olayları kronolojisi. Yaklaşık 2 gün içinde iletişim kuralı, tek tek her adımında gerçekleştirmek için geçen ortalama süre. Tek tek adımları zamanlaması kök hücre kaynağı (adım 1 iletişim kuralı) ve/veya gen değişikliği (adım 3 iletişim kuralı) türünü bağlı olarak değişir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: beyaz kan hücresi ve CD34 verim astarlanmalıdır helezon ve rhesus makak kemik iliği. Zenginleştirilmiş CD34+ HSPC 10 helezon makak (kare) ve altı rhesus makak (üçgen) toplam beyaz kan hücre sayısı (adım 1.3.3 Protokolü) bir fonksiyonu olarak (adım 1.4 Protokolü) sayar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: strateji CD34 zenginleştirilmiş ve geni değiştirilmiş ürünlerin kalite kontrolü için geçişi. Toplam beyaz kan hücreleri ("Ön zenginleştirme") ve daha sonra CD34 zenginleştirilmiş HSPCs antikorlar ile HSC-, MPP-, EMP- ve LMP zenginleştirilmiş CD34 alt kümeleri sayısı ölçmek amacıyla CD34, CD45, CD90 ve CD45RA, belirli lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: CD34 morfolojisi+ hücreleri önce ve sonra gen değişikliği. «Ana sayfa» panelleri: üç temsilcisi aydınlık alan görüntüleri HSPC koloni deneyleri. Alt paneller: Her aydınlık alan görüntüye karşılık gelen GFP floresan. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: hücre (CFC) potansiyelini koloni oluşturan CD34+ hücreleri ve alt kümeleri sıralama arıtılmış. CFC sıralama arıtma takip HSPC alt kümeleri deneyleri gün -1 (Bölüm 1 ve 2 iletişim kuralı) ve 1 (Bölüm 5 iletişim kuralı), tek kolonileri gün attı tabanlı üzerinde morfolojik özellikleri. CFU-MIX miyeloid (beyaz) ve erythroid (kırmızı) hücreleri; = BFU-E = sadece erythroid hücre; CFU-G granülosit; = CFU-GM granülosit ve makrofajlar/monosit; = CFU-M makrofajlar/monosit =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: sıvı kültüründe gen-modified hücrelerden temsilcisi akış sitometrik veri. CD34 yüzdesi iletim GFP ifade LV ile izleyerek HSPCs+ vektör. Hücreler 2 iletim takip haftaya kadar kültürlü. GFP+ olaylar bir düşüş zaman içinde bir sinyal kaybı, GFP nonintegrated LV vektörel çizimler taşıyan hücrelerden yansıtır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adı İçindekiler
Hemolitik arabellek 150 mM amonyum klorür, 12 mM sodyum bikarbonat, 0,1 mM EDTA çift distile su (GKD2O)
Ticari arabellek Fosfat tamponlu tuz (1 X) pH 7.2, % 0.5 BSA, 2 mM EDTA
FACS arabellek Fosfat tamponlu tuz (1 X) pH 7.2, % 2 Fetal sığır Serum
HBSS + %2 BSA Hank'in dengeli tuz solüsyonu, % 2 sığır Serum albümin
HSPC medya StemSpan SFEM II, %1 penisilin/streptomisin, 100 ng/mL her rekombinant insan TPO, SCF, FLT-3
İletim medya StemSpan SFEM II, %1 penisilin/streptomisin, 100 ng/mL her rekombinant insan TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL siklosporin, 4 ug/mL Protamine sülfat

Tablo 1: Tampon ve medya formülasyonları.

KİMLİĞİ PE PECF594 APC-Cy7 V450 Açıklama
1 CD90 Tazminat boncuk
2 CD34 Tazminat boncuk
3 CD45RA Tazminat boncuk
4 CD45 Tazminat boncuk
5 CD34-zenginleştirme önce günahı WBCs
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 CD34-zenginleştirme önce lekeli WBCs
7 Günahı WBCs akışı aracılığıyla (FT)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 Lekeli WBCs akışı aracılığıyla (FT)
9 Günahı CD34 WBCs zenginleştirilmiş ürün
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 Lekeli CD34 WBCs zenginleştirilmiş ürün

Tablo 2: Temsilcisi akışı panel CD34 zenginleştirilmiş ve gen-modified hücre ürünlerin kalite kontrolü için.

Antijen Klon Fluorochrome Lazer Filtre
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 nm
CD90 5.00E + 10 PE 488 nm veya 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 nm veya 532 nm 610/20 nm
CD45RA 5H 9 APC-Cy7 633 nm 780/60 nm
V450: menekşe 450 nm; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: marka adından BIOTIUM; APC: Allophycocyanin-siyanür 7

Tablo 3: Antikor boyama masası akış sitometresi ve hücre sıralama tarafından kalite kontrol için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV vektör Mühendisliği gen-hücre tipleri CD34 gibi değiştirmek için en iyi karakterize yöntemdir+ HSPCs, sonraki nakli içinde vivo için. Burada açıklanan protokol vivo uzun vadeli kalıcı gen-modified HSPCs sayısını en üst düzeye çıkarmak ve klinik faydaları hastalara çeşitli malign, bulaşıcı ve genetik hastalıklar ile sağlamak için tasarlanmıştır. Gen-düzenleme stratejileri son on yılda ortaya çıkmıştır, LV-modified hücreleri en iyi olmakla birlikte, tüp bebek, hayvan modelleri ve hasta1,8,20,21,22okudu.

Bu iletişim kuralı, saf CD34 zenginleştirme ile bizim geniş deneyime dayalı+ HSPCs (yani, > CD34% 80'i+ hücreleri sıralanmış hücre üründe) başarı önemli bir yönüdür. Bu hücrelerin toplam BM WBCs karışık bir popülasyondan türetilmiştir çünkü yüksek saflıkta kültürler uzun vadeli, sırayla otolog ana bilgisayar infüzyon gerçek kök hücre dozunun düşürülmesi engraft değil hücre içerebilir. Ayrıca, yüksek kaliteli LV VCM gen değişikliği en yüksek verimliliği garanti eder.

Adres kusur zenginleştirilmiş CD34 saflık için+ HSPC ürünler, bu kez bu hücreler, yani anti-CD34 antikoru (ki bizim grup içi bir Hibridoma hücre satırından arındırır), ayırmak için kullanılan reaktifler kalitesini doğrulamak yararlı ve antikor etiketli hücreleri bağlamak manyetik boncuklar. 10 bu iletim (MOI 10 x 2) yinelemek için bir seçenek ile bir MOI öneririz. Önemlisi, MOI ampirik olarak, VCM her vektör HT108029gibi standart titering hücre satırdaki titrasyon dahil olmak üzere, bir kalite değerlendirme sonrasında tespit edilmelidir. Önemlisi, farklı laboratuvarlar VCM üreten HOS30, HeLA31ve 293T32titreleri imkanlar arasında karşılaştırmak için yeteneğini sınırlayabilir, dahil olmak üzere farklı titering hücre satırları kullanabilirsiniz. Biz retiter için tahlil ile bir vektör VCM verimli CD34 gen değiştirmek için en doğru miktarını hesaplamak için tercih+ HSPC hedef hücreleri. Bir kez yüksek kaliteli CD34+ HSPCs ve VCM elde, iletim verimliliği ve engraftment daha fazla üç ayrı adımda arttırmak. İlk olarak, siklosporin iletim medya AIDS vektör iletim ve entegrasyon erken adımlarla protamine sülfat itici azalır iken hedef hücreleri35,36, içine eklenmesi arasında lentiviral vektör zorlar parçacıklar ve hücre yüzey33,37. İkinci olarak, rekombinant fibronektin ile plakalar tedavi parçası (örneğin, RetroNectin, CH-296) iletim verimliliği artırır ve ayrıca gen-modified HSPCs 33,38içinde vivo engraftment potansiyelini artırır, 39. Özellikle, önceki çalışmalarda CH-296 sadece sırasında önemli ama değil öncesinde, iletim33,38olduğunu göstermektedir. Son olarak, gen-modified hücre ürünlerin engraftment ve sebat vivo içinde daha önce insan ve insan dışı primat CD34 gösterildiği gibi geliştirmek için PGE2 ile nabız+ HSPC ürünler40,41.

LVs entegre rastgele genom onların selefi gibi gammaretroviral (RVs) vektörler. Daha az klinik deneme veri RVs için LVs için kullanılabilir olsa da, geçerli bulgular LV yaklaşımlar hücre dönüştürmeleri LV'ın insertional mutagenesis nedeniyle önemli ölçüde daha düşük risk taşıdığını öneririz; RV stratejileri nedeniyle bu risk42daha az sıklıkla kullanılır. Bir daha fazla sınırlama gen değişiklik verimliliği % 100'den az ve gen-modified hücrelerin bir kısmı içinde vivo devam edecek değil olmasıdır. Örneğin, bir % 60 gen-modified HSPC ürün % 30 uzun vadeli engrafting, neden olabilir geni değiştirilmiş hücreler. Mümkün olduğunda, burada sunulan gen terapisi stratejiler bile kökenli hematopoetik hücrelerin8,43 azınlıkta ifade terapötik etkinlik sağlamak transgenes tanıtarak bu sınırlamayı aşmak için tasarlanmıştır .

Gelecek HSPC LV-esaslı değişiklik yaklaşımlar için zeki biri. Biz rutin içinde vivo1izleme etkinleştirme "gen-mark" hücrelere bu iletişim kuralını kullanın. Ayrıca LV türevleri aynı hayvan içinde karşılaştırmak için bu strateji adapte olması. "Rekabet" böyle nakli farklı vektörel çizimler karşılaştırılması izin (örneğin, bu daha iyi verimliliği ile tanımlamak için) ve transgenes (örneğin, farklı HSPC alt kümeleri izlemek veya bunları hastalık modelleri karşılaştırmak için). İleride, LV gen terapisi HSPCs gerekli bir araç özellikle nerede büyük genetik yükleri stabil bireyin ömrü boyunca ifade gerekir durumlarda gen düzenleme yaklaşımları yanında kalacaktır inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Helen Crawford bu el yazması, grafik tasarım için Jim Woolace ve Veronica Nelson ve Devikha protokol gelişiminde katıldığınız için Chandrasekaran hazırlamak için teşekkür ederiz. Bu iletişim kuralı gelişimi NIH Ulusal alerji Enstitüsü ve bulaşıcı hastalıklar (R01 AI135953 ve AI138329 H.P.K. için) ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ve U19 gelen hibe tarafından desteklenmiştir HL129902 H.P.K. için), NIH P51 OD010425 yanı sıra ve kısmen NIH/ncı Kanser Merkezi destek hibe P30 CA015704 aracılığıyla. H.P.K. olduğunu Markey moleküler tıp araştırmacı ve alınan destek Jose Carreras/e Donnall Thomas donatılmış sandalye açılış alıcı olarak kanser araştırmaları ve Fred Hutch donatılmış sandalye için hücre ve gen tedavisi için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

Genetik sayı: 144 hematopoetik kök ve progenitör hücre gen tedavisi hematopoiesis insan dışı primat modeli hücre izolasyon lentiviral vektörler
Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter