Summary
Простой АТФ измерительные пробирного и/мертвые окрашивания метода были использованы для количественной оценки и визуализировать Neisseria gonorrhoeae выживание после лечения с Цефтриаксон. Этот протокол может быть расширен для изучения антимикробного воздействия любой антибиотик и может использоваться для определения минимальной ингибирующее концентрацию антибиотиков в бактериальные биопленки.
Abstract
Появление устойчивых к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae (GC) представляет собой угрозу для здоровья во всем мире и подчеркивается необходимость выявления лиц, которые не лечение. Это грамотрицательные бактерии вызывает гонорею исключительно в организме человека. Во время инфекции она способна формы агрегатов и/или биопленки. Минимальная концентрация тормозной (MIC) тест используется для определения чувствительности к антибиотикам и определить соответствующее лечение. Однако механизм ликвидации в естественных условиях и его связь с лабораторных результатов не известны. Был разработан метод, который проверяет как GC агрегации влияет на чувствительности к антибиотикам и показывает связь между совокупный размер и чувствительности к антибиотикам. Когда GC агрегат, они более устойчивы к антибиотикам убийства, с бактериями в центре выжившие Цефтриаксон лечения лучше, чем те, на периферии. Эти данные указывают, что N. gonorrhoeae агрегирование может уменьшить свою подверженность цефтриаксон, который не отражается Стандартный агар пластины-методов на основе MIC. Метод, используемый в данном исследовании позволит исследователям для тестирования бактериальных Восприимчивость клинически соответствующих условиях.
Introduction
Гонорея является общим половым путем инфекции (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), грамотрицательные бактерии diplococcal, является возбудителем этого заболевания. Симптомы инфекции половых органов может привести к боли во время мочеиспускания, обобщенные половых боль и мочеиспускательного канала разряда. Инфекция часто бессимптомной2,3,,45, и это позволяет для расширенной колонизации. Эти необработанные инфекций являются основных проблем системы здравоохранения, поскольку они имеют потенциал для облегчения передачи организма, и это может привести к осложнениям, например, воспалительные заболевания тазовых органов (PID) и распространены гонококковая инфекция (DGI)6. Устойчивых к антибиотикам гонорея — кризис общественного здравоохранения и растущее социально-экономическое бремя7. Уменьшенной восприимчивости к цефалоспорины привело к изменению режима лечения от одного антибиотика для двойной терапии, которая сочетает в себе доксициклина или азитромицина с Цефтриаксон8. Увеличение неудача Цефтриаксон и азитромицин9,10, в сочетании с бессимптомной инфекции, подчеркивает необходимость понимания неудач лечения гонореи.
Минимальная концентрация тормозной (MIC) теста, включая агар разрежения и диск диффузии испытаний, был использован как стандартный медицинский тест для определения устойчивости к антибиотикам. Тем не менее неясно, если тест MIC отражает бактерий к антибиотикам в естественных условиях. Формирование бактериальные биопленки способствует выживания бактерий в присутствии бактерицидные концентрации антибиотика: MIC тестирования не удается обнаружить этот эффект11. Потому что GC может формировать биоплёнки слизистой поверхности12, мы предполагаем, что антибиотика чувствительности в пределах агрегатов будет отличаться от что видел в отдельных GC. Кроме того исследования показали, что трехфазные переменной поверхности молекул, пили, непрозрачность связанные белком (Opa), и lipooligosaccharides (Лос), которые регулируют взаимодействие между бактерия, привести к различным размером агрегатов13, 14 , 15. вклад этих компонентов к антибиотикам не были рассмотрены из-за отсутствия надлежащих методов.
В настоящее время существует несколько методов для измерения искоренение биопленки. Наиболее широко используемый количественных методом является измерение изменений в биомассе, используя фиолетовый кристалл, окрашивание16. Однако этот метод требует значительных экспериментальных манипуляций, который потенциально может генерировать ошибки в эксперимент повторяется17. Метод окрашивания жить/мертвые, используемый здесь позволяет визуализации живых и мертвых бактерий и их распределения в рамках биопленки. Однако структура биопленки может представлять как физический барьер, который уменьшает проникновение красителя. Таким образом для количественной оценки жить/Мертвые бактерии внутри группы, окрашивание ограничивается малых биоплёнки или его предшественником microcolonies или агрегатов. Другие методы, включая тесты диффузии агар разрежения и диск, не способны измерить воздействие агрегации. Для изучения GC восприимчивость внутри агрегата после антибиотикотерапии экспозиции, идеальный метод будет необходимо иметь оба количественных assay который может измерить живут бактерии и визуализировать их распределения.
Процедуру, описанную здесь сочетает АТФ использование измерения и жить/мертвые пятнать количественно assay для и визуально изучить вызовы GC восприимчивость в агрегаты присутствии антибиотики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общее обслуживание штаммов GC
- Полоска штаммы N. gonorrhoeae GCK агар с 1% Келлогг дополняет18 (Таблица 1, таблица 2) из морозильника запасов и инкубировать 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч. Использование MS11 выражая фаза переменная опа (MS11Opa +), без опа (MS11ΔOpa), или усеченных Лос (MS11ΔLgtE).
- Тщательно выберите пили отрицательные (колонии без темный край) или положительным (колонии с темный край) колонии от каждого штамма, основанные на колонии морфология19 с использованием рассечения световой микроскоп и полоска на новую пластину ГЦК.
- Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч перед использованием.
2. жизнеспособность количественная оценка GC агрегатов
- Собирайте с помощью стерильных аппликатор GC. Тампоном GC от плиты и вновь приостановить GC в подогретым отваром (GCP, Таблица 3) дополнены с 4,2% NaHCO3 и 1% Келлогг решения18. Используйте Спектрофотометрия на длине волны 650 Нм (ОД650 1 = ~ 1 x 109 кое/мл) для определения концентрации взвешенных бактерий.
- Регулировка концентрации GC ~ 1 x 108 кое/мл.
- Мкл 99 скорректированных GC подвески в скважины 96-луночных плиты.
- Инкубировать пластину для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2 позволяет бактерии для статистической обработки.
- 1 мкл серийный разреженных Цефтриаксон (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 мкг/мл) в каждой скважине. Оставьте некоторых скважин, лечить в качестве элементов управления.
- Инкубируйте пластину для 24 ч при 37 ° C с 5% CO2.
- Sonicate подвеска 3 раза в каждую лунку для 5 s на 144 Вт и 20 кГц.
- Добавить 100 мкл Реагента свечение использование коммерчески доступных АТФ в каждой скважине, Пипетка вверх-вниз на 3 раза и инкубировать в течение 15 минут при 37 ° C с 5% CO2.
- Тщательно передача 150 мкл смеси от каждой скважины в новый колодец в черный 96-луночных микропланшетов и избежать пузырей.
- Измерение оптической плотности каждой скважины на 560 Нм, используя читателя пластины.
- Рассчитайте выживаемость, соотношение чтения, полученные после лечения серийный Цефтриаксон к чтению из необработанной скважин.
3. флуоресценции микроскопический анализ Live/мертвые GC агрегатов
- Собирайте с помощью стерильных аппликатор GC. Тампоном GC от плиты и вновь приостановить GC в подогретым GCP медиа плюс 1% Келлогг добавки.
- Определить количество бактерий методом спектрофотометрии на длине волны 650 нм и регулировка концентрации GC ~ 1 x 107 кое/мл.
- Мкл 198 GC подвески в в 8-Ну coverslip нижней палаты.
- Инкубируйте камеры для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2 разрешить агрегации формирования.
- 2 мкл Цефтриаксон (100 мкг/мл или различных разведениях), в каждой скважине в пределах каждого состояния агрегации. Инкубируйте на требуемое время при 37 ° C с 5% CO2.
- 0,6 мкл жить/мертвые окрашивание раствора смеси в каждой скважине и проинкубируйте втечение 20 мин при 37 ° C с 5% CO2.
- Приобрести Z-серии изображений с помощью конфокального микроскопа (эквивалент микроскоп может использоваться).
- Анализ изображения с помощью ImageJ программное обеспечение для измерения размера GC агрегатов и коэффициент интенсивности флуоресценции (РПИ) жить к мертвый пятнать в каждой совокупности.
4. анализ
- Оценка размера бактериальных агрегатов.
- Откройте ImageJ и откройте изображение, перетащив файл raw изображений в строке меню ImageJ.
- Нажмите в строке меню ImageJ Произвольные линии и обведите область каждого агрегата в изображении.
- Нажмите кнопку анализ | Мера в строке меню ImageJ.
- Получите номер в новом окне в столбце область .
- Количественная оценка коэффициента жить к мертвый агрегатов
- Откройте ImageJ и откройте изображение, перетащив файл raw изображений в строке меню ImageJ.
- Нажмите кнопку анализ | Набор измерений в строке меню ImageJ.
- Проверьте комплексной плотность во всплывающем окне и нажмите кнопку ОК.
- Нажмите на изображение, | Цвет | Каналы инструмент в строке меню и выберите Цвет.
- Проверьте канал 1 как флуоресценции для живых бактерий пятнать.
- Нажмите в строке меню ImageJ Произвольные линии и обведите область каждого агрегата.
- Нажмите кнопку анализ | Мера в строке меню ImageJ.
- Получение числа в столбце IntDen .
- Проверьте 2 канала как флуоресценции для окрашивания мертвых бактерий. Повторите шаги 4.2.6-4.2.8.
- Получите коэффициент жить к мертвый путем деления числа из шага 4.2.8 из шага 4.2.9.
- Статистический анализ
- Открыть GraphPad Призма и введите цифры, полученные из ImageJ в нужный столбец.
- Нажмите кнопку анализировать и выберите t тесты под столбцов анализа.
- Установите требуемый столбец для сравнения и нажмите OK.
- Получите значение P под окно анализа .
- Выберите Линейной регрессии по XY анализы из шага 4.3.3
- Получите на R-квадрат и P-значение под окном анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использовались два метода: assay использования СПС и жить/мертвые окрашивание assay. Результаты можно либо объединить, или индивидуально используется для изучения бактериальных выживания в рамках агрегатов после лечения антибиотиками. Было показано, что СПС использования пробирного измерить точно жизнеспособные бактерии в S. aureus биоплёнки20,21. Здесь MS11Opa + Pil + штамм был использован для изучения роли GC агрегации в чувствительности к антибиотикам. Non агрегированные MS11Opa + Pil +, агрегированных MS11Opa + Pil +, или агрегированных и затем нарушена sonication MS11Opa + Pil + лечили серийных разведений Цефтриаксон и измеряется уровень АТФ (рис. 1А). Сравнивая процент выживания с и без лечения антибиотиками, предварительно агрегированные GC был значительно выше, выживание, чем не агрегированной или нарушена агрегации GC с равной или выше 0,015 мкг/мл Цефтриаксон (MIC от агар разрежения тест ( Таблица 4)). MS11Opa + пиль-, MS11ΔOpa или MS11ΔLgtE, которые же разбавления агар MIC (Таблица 4), но меньше агрегатов формы, был рассмотрен и по сравнению с MS11Opa + Pil + (рис. 1Б). MS11Opa + Pil +, образуя более крупные агрегаты, имели более высокий уровень АТФ с Цефтриаксон лечение чем мутантных штаммов.
Пятнать жить/мертвых был использован в нескольких связанных с биопленки/агрегации исследования22,23. Чтобы определить эффект комплексирования, предварительно агрегированные MS11Opa + Pil + был относиться с или без Цефтриаксон и образы. Это позволяет визуализации (которые могут быть количественно) и распределения живых и мертвых GC после лечения антибиотиками (рис. 2A- оставил две панели). Мертвые бактерии (красный) основном находились на внешние слои, тогда как живой GC (зеленый) были расположены в основном в ядре Цефтриаксон лечение агрегатов. Эта процедура была выполнена с MS11Opa + пиль-, MS11ΔOpa или MS11ΔLgtE, для изучения агрегации размер и выживание ставки (рисA). MS11Opa + Pil + было показано, форме, величине и MS11Opa + пиль-маленький агрегатов (рис. 2A, B). MS11Opa + Pil + агрегаты были все еще живы в основной слой в то время как GC в небольшие свободные агрегаты MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + пиль-, и MS11ΔLgtEPil + были мертвы (рис. 2A, C). На основе размера и выживания, граф корреляции могут быть отображены для изучения взаимосвязи размер агрегации и антибиотик выживания (Рисунок 2D).
Таблица 1: Рецепт для 1 Л GCK агар пластины.
Таблица 2: Рецепт для 1 Л 100 x Kellogg дополнения.
Таблица 3: Рецепт для 1 Л GCP бактериальных питательных сред.
Таблица 4: минимальный тормозной концентрации GC штаммов относились с Цефтриаксон. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE и MS11Opa + пиль - были выросли и приостановлено в GCP. Агар разрежения был затем испытание с последовательным концентрации цефтриаксона от 0,0016 - 0,25 мкг/мл.
Рисунок 1 : Репрезентативных данных выживаемости агрегированных GC под Цефтриаксон лечение АТФ использования пробирного. (A) выживания оценить сравнение MS11Opa + Pil + подвеска без предварительно агрегирования, предварительно агрегирования для 6 h или нарушения после того, как предварительно агрегирования для сравнения показатель выживания 6 ч. (B) 6 ч агрегированных MS11Opa + Pil + с MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Пиль- или MS11ΔLgtEPil +. Показаны средние значения (болезни) получаются из трех независимых экспериментов. p < 0,001; p < 0.01; p < 0,05. Эта цифра была ранее опубликованные 24 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Репрезентативных данных жить/Мертвые бактерии распределения в рамках агрегатов при лечении Цефтриаксон. (A) предварительно агрегированные MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + пиль-, или MS11ΔLgtEPil + был либо инкубировали в присутствии или отсутствии 1 мкг/мл Цефтриаксон 2 h. агрегаты были затем витражи для визуализации жизнеспособным (зеленый) и мертвых (красный) GC и визуализированы с Конфокальный флуоресцентным микроскопом. Линейки: 50 µm. изображения затем были проанализированы для размера агрегации (B) и (C) соотношение жить к мертвый GC и (D) корреляции граф был создан. Показаны средние значения (SD) получаются из изображений > 40 трех независимых экспериментов. p < 0,001; p < 0.01; p < 0,05. Эта цифра была ранее опубликованные 24и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактерии могут образовывать биоплёнки во время инфекции человеческого тела. Традиционные MIC тестирования может не отражать концентрации, необходимые для искоренения бактерий в биопленки. Чтобы проверить влияние антибиотиков на биопленки, методы, основанные на биопленки биомассы, а также покрытие CFUs может быть ошибочным воздействием биопленки структуры. Например метод покрытия работает только если биопленки может быть нарушена. Следовательно полученные CFU может быть ниже, чем фактическое количество жизнеспособных бактерий. Визуализации мертвых и живых бактерий в биопленки были созданы для измерения выживания бактерий в биопленки, однако, в зависимости от структуры и плотность биопленки, окрашивание может не проникают в биопленки и привести к неточные и недооценивать выживаемости.
Метод здесь использует как количественные, так и пробирного визуализации для измерения бактериальных выживание после лечения агрегатов. Преимуществом этого метода является, что он измеряет бактериальных выживания в окружающей среде, которая ближе к то, что видел в реальной инфекции. Выживание ставки различия между неагрегированные и агрегированных бактерий позволит нам определить, если в пробирке MIC коррелирует с микрофоном в естественных условиях.
Assay использования СПС, который измеряет производства АТФ, можно количественно измерить выживания агрегатов. Является более чувствительным и может продифференцировать выживание между небольшие различия в концентрации антибиотиков, по сравнению с другими аналогичными анализов. Однако из-за высокой чувствительности этот assay, обеспечение лизиса бактериальных клеток является критическим. Таким образом sonication шаг был использован. Кроме того этот метод не может использоваться для измерения бактериальных выживания в естественных условиях из-за большого количества АТФ, что хост клетки производят, что может маскировать бактериальный уровень АТФ. Кроме того взаимодействие клеток хозяина бактерии могут повлиять на бактериального производства АТФ. Используя этот assay на бактерии с пигментами может ограничить как пигменты может помешать с чтением.
Живой/мертвые пятна широко используется в исследованиях биопленки. Однако проникновение краски для окрашивания могут испачкать только внешнего бактерий, в то время как ядро не могут быть окрашены. Таким образом он может использоваться только для визуализации, но не количественной оценки, из-за неравномерного распределения краски. Мы использовали малые агрегаты для этого окрашивания и продемонстрировали, что этот assay может использоваться для количественного определения общей бактериальной выживания в агрегатах. Кроме того негативные и позитивные элементы необходимы для корректировки концентрации красителя для различных бактерий.
В сочетании с протоколом MIC СПС использования пробирного и жить/мертвые пятна может служить эффективным методом количественно и визуально анализировать N.gonorrhoeae , а также других бактериальная агрегаты25,26. Применение комбинированных протокола может предоставить более глубокого понимания болезней формирования вместе с ее универсальным использования наркотиков скрининг на основе биопленки бактерий. Этот метод может более точно отражать в vivo MIC антибиотика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грант от национального института здравоохранения д.х.н. и в.с. AI123340. Л-К.В, J.W., переменного тока, и е.н. были поддержаны в части/участие в программе «Первый год инноваций и исследований опыт», финансируемого университета штата Мэриленд. Спонсоры имел никакой роли в исследования дизайн, сбор данных и анализ, решение публиковать, или подготовка рукописи. Мы признаем UMD CBMG изображений ядра для всех экспериментов микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
