Summary
Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.
Abstract
L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.
Introduction
La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la transmission de l’organisme et cela peut conduire à des complications telles que la maladie inflammatoire pelvienne (MIP) et diffusé l’infection gonococcique (DGI)6. La gonorrhée résistante aux antibiotiques est une crise de santé publique majeur et une augmentation de fardeau socio-économique7. Traitement régime changement d’un seul antibiotique à la bithérapie, qui combine l’azithromycine ou la doxycycline avec ceftriaxone8a entraîné une sensibilité réduite aux céphalosporines. L’échec accru de ceftriaxone et l’azithromycine9,10, en combinaison avec des infections asymptomatiques, met en évidence la nécessité de comprendre les échecs de traitement de la gonorrhée.
L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI), y compris les tests de diffusion de dilution et disque agar, a été utilisé comme le test médical standard pour l’identification de la résistance à un antibiotique. Néanmoins, il est difficile de savoir si le critère de la MIC exprime l’antibiorésistance bactérienne in vivo. La formation de biofilms bactériens contribue à la survie de bactéries en présence de concentrations bactéricides d’antibiotique : l’essai de MIC est incapable de détecter cet effet11. Parce que le GC peut former des biofilms sur les surfaces muqueuses12, nous émettons l’hypothèse de cet antibiotique susceptibilité au sein des agrégats serait différente de celle observée dans les GC. En outre, des études ont montré que trois phase protéine associée à l’opacité de molécules de surface variable, Pili, (Opa) et lipooligosaccharides (LOS), qui régissent les interactions entre bactérie, conduire à différents agrégats de taille13, 14 , 15. la contribution de ces composants à la résistance aux antibiotique n’a pas été examinée faute de méthodes appropriées.
Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour mesurer l’élimination du biofilm. La méthode quantitative plus largement utilisée est en mesurant les changements dans la biomasse à l’aide de violet de gentiane16de coloration. Toutefois, la méthode requiert la manipulation expérimentale importante, qui peut potentiellement générer des erreurs dans l’expérience répétitions17. La méthode de coloration de vivre/morts utilisée ici permet la visualisation des bactéries vivantes et mortes et leur distribution dans le biofilm. Cependant, la structure des biofilms peut poser comme une barrière physique qui réduit la pénétration de la teinture. Par conséquent, afin de quantifier les bactéries vivent/morts au sein d’un groupe, la coloration est limitée à petits biofilms ou son précurseur-microcolonies ou agrégations. Autres méthodes, y compris les essais de diffusion gélose dilution et disque, ne sont pas en mesure de mesurer les effets d’agrégation. Afin d’examiner la sensibilité GC au sein de l’agrégation après exposition aux antibiotique, une méthode idéale aurait besoin d’avoir les deux un test quantitatif qui permet de mesurer vivent des bactéries et visualiser leur distribution.
La procédure décrite ici combine une mesure de l’utilisation d’ATP et une coloration live/morts de dosage à quantitativement et examiner visuellement la susceptibilité de GC au sein des agrégats en présence d’antibiotiques.
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Protocol
1. entretien général des souches de GC
- Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète18 (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).
- Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonies positives (colonie avec bordure sombre) de chaque souche issu de morphologie de colonie19 en utilisant un microscope à lumière dissection et ensemencer sur une nouvelle plaque GCK.
- Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 16-18 h avant utilisation.
2. dosage viabilité des agrégations de GC
- Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillon GC de la plaque et remettre en suspension les GC dans le bouillon préchauffé (GCP, tableau 3) additionné de 4,2 % NaHCO3 et 1 % Kellogg solutions18. Utiliser la spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm (une OD de650 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) afin de déterminer la concentration de bactéries en suspension.
- Ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 108 UFC/mL.
- Ajouter 99 µL de suspension GC ajustée dans des puits d’une plaque à 96 puits.
- Incuber la plaque pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre les bactéries à s’agréger.
- Ajouter 1 µL de série ceftriaxone dilué (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) dans chaque puits. Laisser certains puits non traités pour servir en tant que contrôles.
- Incuber les plaques pendant 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Laisser agir la suspension 3 fois dans chaque puits de 5 s à 144 W et 20 kHz.
- Ajouter 100 µL de réactif de lueur d’utilisation ATP disponible commercialement dans chaque puits, pipette haut-bas pour 3 fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2pendant 15 minutes.
- Soigneusement transférer 150 µL du mélange de chaque puits dans un nouveau puits dans une microplaque 96 puits noir et éviter d’introduire des bulles.
- Mesurer l’absorbance de chaque puits à 560 nm en utilisant le lecteur de plaque.
- Calculer le taux de survie par le rapport entre la lecture obtenue après traitement série ceftriaxone à la lecture des puits non traitées.
3. analyse microscopique fluorescence du Live/Dead des agrégats de GC
- Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Kellogg suppléments écouvillon GC de la plaque et GC resuspendre dans pré chauffé de GCP media plus de 1 %.
- Déterminer le nombre de bactéries par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm et ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 107 UFC/mL.
- Ajouter 198 µL de suspension de la GC dans des chambres de 8 puits lamelle-bas.
- Incuber la chambre pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre la formation de l’agrégation.
- Ajouter 2 µL de ceftriaxone (100 µg/mL ou diverses dilutions) dans chaque puits au sein de chaque état d’agrégation. Incuber pendant le temps désiré à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Ajouter 0,6 µL du mélange de solution coloration live/morts dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Acquisition d’images de série Z à l’aide d’un microscope confocal (un microscope équivalent peut être utilisé).
- Analyser les images à l’aide de logiciels ImageJ pour la mesure de la taille des agrégats de GC et le ratio d’intensité de fluorescence (FIR) de vivre-à-mort de coloration dans chaque agrégat.
4. analyse de l’image
- Estimation de la taille des agrégats bactériens.
- Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
- Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation dans l’image.
- Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
- Obtenir le nombre dans une nouvelle fenêtre sous la colonne de la zone .
- Quantification du ratio de vivre-à-mort d’agrégations
- Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
- Cliquez analyser | Mesures de la valeur dans la barre de menus de ImageJ.
- Vérifier la densité intégrée dans le menu contextuel, puis cliquez sur OK.
- Cliquez sur l’Image de | Couleur | Outil de canaux dans la barre de menus et sélectionnez couleurs.
- Enregistrer canal 1 comme la fluorescence pour les bactéries vivantes de coloration.
- Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation.
- Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
- Obtenir le numéro de colonne IntDen .
- Contrôle canal 2 comme la fluorescence pour la coloration mort bactérienne. Répétez les étapes 4.2.6-4.2.8.
- Obtenir le rapport de vivre-à-mort en divisant le nombre de l’étape 4.2.8 par nombre de l’étape 4.2.9.
- Analyse statistique
- Ouvrez GraphPad Prism et entrer les chiffres obtenus à partir de ImageJ la colonne souhaitée.
- Cliquez sur analyser , puis sélectionnez tests t sous les analyses de colonne.
- Cochez la colonne souhaitée pour la comparaison et cliquez sur OK.
- Obtenir la P-Value au titre de la fenêtre d’analyse .
- Sélectionnez la Régression linéaire selon analyses XY de l’étape 4.3.3
- Obtenir le R-carré et la P-valeur sous la fenêtre d’analyse.
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Representative Results
Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms20,21. Ici, MS11Opa + Lip + souche a permis d’examiner le rôle d’agrégation de la GC dans la sensibilité aux antibiotique. MS11Opa + Pil agrégées non +, MS11Opa + Pil agrégée +, ou agrégées puis perturbée par sonication MS11Opa + Lip + ont été traités avec des dilutions de la ceftriaxone et l’ATP niveau mesuré (Figure 1A). En comparant le pourcentage de survie avec ou sans antibiothérapie, préalablement agrégée GC avait des taux de survie significativement plus élevée que GC non agrégées ou agrégation-perturbé avec égale à ou supérieure à 0,015 µg/mL de ceftriaxone (MIC du test de dilution d’agar ( Tableau 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa ou MS11ΔLgtE, qui ont la même dilution de gélose MIC (tableau 4), mais forment des agrégats plus petites, a été examiné et comparé à MS11Opa + Lip + (Figure 1B). MS11Opa + Lip +, formant des agrégats plus gros, était le plus élevé niveau d’ATP avec ceftriaxone traitement que les souches mutantes.
Live/dead coloration a été utilisée dans plusieurs études relatives au biofilm/agrégation22,23. Pour déterminer l’effet de l’agrégation, préalablement agrégées MS11Opa + Pil + a été traitée avec ou sans la ceftriaxone et imagé. Cela permet la visualisation (ce qui peut être quantifiée) tant la répartition des GC vivant et morte après un traitement antibiotique (Figure 2A- gauche deux panneaux). Les bactéries mortes (rouge) étaient en grande partie situées dans les couches supérieures, tandis que GC live (vert) étaient situées principalement dans le noyau des agrégats de ceftriaxone traité. Cette intervention a été réalisée avec MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa ou MS11ΔLgtE, d’examiner les taux de taille et de la survie d’agrégation (Figure 2A). MS11Opa + Lip + s’est avéré de la forme la plus grande et MS11Opa + Pil-les plus petits agrégats (Figure 2A, B). MS11Opa + Lip + agrégats vivaient encore dans la couche de base alors que GC dans les petits agrégats lâches du MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, et MS11ΔLgtEPil + étaient morts (Figure 2A, C). Basé sur la taille et de la survie, un graphe de corrélation peut être tracé pour examiner la relation entre taille d’agrégation et de survie aux antibiotiques (Figure 2D).
Tableau 1 : Recette pour 1 litre de GCK gélose.
Tableau 2 : Recette pour 1 L de 100 x supplément Kellogg.
Tableau 3 : Recette pour 1 L de milieux de culture bactérienne de GCP.
Tableau 4 : concentration inhibitrice Minimum des souches GC traités par ceftriaxone. MS11Opa + Lip +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE et MS11Opa + Pil - ont été cultivées et suspendu au GCP. Test de dilution d’agar est ensuite exécutée avec serial concentration de ceftriaxone de 0,0016 - 0,25 µg/mL.
Figure 1 : Données représentatives des taux de survie des GC agrégée sous traitement de ceftriaxone par dosage de l’utilisation d’ATP. (A) survie taux comparaison de MS11Opa + Lip + suspension sans pré agrégation, agrégeant pré pendant 6 h ou l’interruption après l’agrégation pour comparaison de taux de survie de 6 h. (B) de 6 h agrégées MS11Opa + Pil + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + PIL-, ou MS11ΔLgtEPil +. Montré les valeurs moyennes (±et) proviennent de trois expériences indépendantes. p < 0,001 ; p < 0,01 ; p < 0,05. Ce chiffre a été précédemment publié 24 et est utilisé avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les données représentatives de la distribution de bactéries vivent/morts au sein des agrégats sous traitement de ceftriaxone. (A) agrégées pre MS11Opa + Lip +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, ou MS11ΔLgtEPil + était soit incubés en présence ou en absence de 1 µg/mL ceftriaxone pendant 2 h. agrégats étaient puis teint pour visualiser viable (vert) et GC morts (rouge) et visualisés à l’aide microscope confocal fluorescence. Barre d’échelle : 50 µm. les Images ont ensuite été analysées pour la taille de l’agrégation (B) et (C) rapport de vivre-à-mort GC et (D) un graphe de corrélation a été créé. Montré les valeurs moyennes (SD) proviennent de > 40 images de trois expériences indépendantes. p < 0,001 ; p < 0,01 ; p < 0,05. Ce chiffre a été précédemment publié 24et est utilisé avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a obtenu peut être inférieur au nombre réel de bactéries viables. Visualisation de bactéries morts ou vivants dans le biofilm ont été établies pour mesurer la survie des bactéries au sein des biofilm, toutefois, selon la structure et la densité du biofilm, la coloration peut échouer à pénétrer dans le biofilm et entraîner une taux de survie inexactes et sous-estimé.
La méthode ici utilise un quantitatif et un essai de visualisation pour mesurer la survie bactérienne après traitement des granulats. L’avantage de cette méthode est qu’il mesure la survie bactérienne dans un milieu qui est plus proche de ce que l'on voit dans une véritable infection. Les différences de taux de survie entre les bactéries non agrégées et agrégées nous permettra de déterminer si le MIC in vitro est corrélée avec le MIC in vivo.
L’essai d’utilisation de ATP, qui mesure la production d’ATP, permet de mesurer quantitativement la survie des agrégats. Le test est plus sensible et peut faire la différence de survie entre les petites différences de concentration d’antibiotique, par rapport aux autres tests similaires. Toutefois, en raison de la grande sensibilité de ce test, assurance de la lyse de la cellule bactérienne est critique. Par conséquent, une étape de sonication a été utilisée. En outre, cette méthode ne peut pas être utilisée pour mesurer la survie bactérienne in vivo en raison de la grande quantité d’ATP qui produisent des cellules de l’hôte qui peut masquer le niveau d’ATP bactérien. Par ailleurs, l’interaction des cellules hôtes avec bactéries peut-être affecter la production d’ATP bactérienne. À l’aide de ce test sur les bactéries à pigments peut être limitant comme les pigments peuvent gêner la lecture.
La tache de vivre/morts a été employé couramment dans les études de biofilm. Cependant, la pénétration des colorants coloration peut-être tacher seulement les bactéries ultrapériphériques, tandis que le noyau ne peut pas être souillé. Donc, il seulement peut être utilisé pour la visualisation, mais pas de quantification, en raison de la répartition inégale de la teinture. Nous avons utilisé des petits agrégats pour cette coloration et démontré que ce test peut être utilisé pour quantifier la survie globale bactérienne dans les agrégats. En outre, les contrôles positifs et négatifs sont nécessaires pour ajuster la concentration du colorant de différentes bactéries.
En combinaison avec le protocole MIC, la tache de dosage et de vivre/morts d’utilisation ATP peut servir comme une méthode efficace d’analyser quantitativement et visuellement les gonorrhoeae ainsi que d’autres agrégations bactérienne25,26. L’application du protocole combiné pourrait fournir une meilleure compréhension de la formation de la maladie ainsi que ses utilisations polyvalentes dans le dépistage des drogues issu des biofilms bactéries. Cette méthode peut refléter plus exactement l' in vivo MIC d’un antibiotique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Health D.E.C. et W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., et E.N. appuyés en partie/participer au programme « La première année l’Innovation & recherche expérience » financé par l’Université du Maryland. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’étude de conception, collecte de données et l’analyse, de décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous reconnaissons l’UMD CBMG Imaging Core pour toutes les expériences de microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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