Summary
En enkel ATP-måling analysen og live/døde flekker metoden ble brukt for å kvantifisere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse etter behandling med ceftriaxone. Denne protokollen kan utvides for å undersøke de antimikrobielle effektene av noen antibiotika, og kan brukes til å definere den minimale inhibitoriske konsentrasjonen av antibiotika i bakteriell biofilm.
Abstract
Fremveksten av antibiotika resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er en verdensomspennende helserisiko og understreker behovet for å identifisere personer som ikke behandling. Denne Gram-negative bakterie forårsaker gonoré utelukkende hos mennesker. Under infeksjon er det kjøpedyktig skjemaet aggregater og/eller biofilm. Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testen brukes for å bestemme mottakelighet for antibiotika og definere riktig behandling. Men mekanismen for utryddelsen i vivo og dens forhold til laboratorium resultatene er ikke kjent. En metode som undersøker hvordan GC aggregering påvirker antibiotika mottakelighet og viser forholdet mellom samlede størrelsen og antibiotika mottakelighet ble utviklet. Når GC samlet, de er mer motstandsdyktig mot antibiotika drapet, gjenlevende med bakterier i midten ceftriaxone behandling bedre enn i periferien. Dataene viser at N. gonorrhoeae aggregering kan redusere sin mottakelighet for ceftriaxone, noe som ikke gjenspeiles bruke standard agar plate-baserte MIC metoder. Metoden som brukes i denne studien vil tillate forskere å teste bakteriell mottakelighet under klinisk relevante forhold.
Introduction
Gonoré er en felles seksuelt overførbare infeksjoner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den utløsende agenten for denne sykdommen. Symptomer på genital infeksjon kan føre smerte under vannlating, generalisert genital smerte og urethral utslipp. Infeksjonen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette gir utvidet kolonisering. Disse ubehandlet infeksjoner er en stor helse bekymring, som de har potensial til å lette overføringen av organismen, og dette kan føre til komplikasjoner som bekken inflammatorisk sykdom (PID) og spres gonococcal infeksjon (DGI)6. Antibiotika-resistente gonoré er en stor offentlig helse-krise og en økende sosioøkonomiske byrden7. Mindre mottakelighet for cefalosporiner har ført til behandling diett endring fra en enkelt antibiotika til dobbel terapi, som kombinerer azithromycin eller doxycycline med ceftriaxone8. Økt svikt av ceftriaxone og azithromycin9,10, i kombinasjon med asymptomatisk infeksjoner, fremhever behovet for å forstå gonoré behandling feil.
Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) test, herunder agar fortynning og platen diffusjon tester, har vært brukt som standard medisinsk testen for å identifisere motstand mot et antibiotikum. Likevel er det uklart om MIC testen gjenspeiler bakteriell antibiotikaresistens i vivo. Dannelsen av bakteriell biofilm bidrar til overlevelse av bakterier i nærvær av bakteriedrepende konsentrasjoner av antibiotika: MIC testing er finner denne effekten11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhinnene overflater12, vi hypothesize at antibiotika mottakelighet innen aggregater ville være forskjellig fra det sett i enkelte GC. I tillegg har studier vist at trefase variabel overflaten molekyler, Pili, tetthet-assosiert protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), som regulerer mellom bakterie interaksjoner, føre til ulike størrelser aggregater13, 14 , 15. bidrag av disse komponentene til antibiotikaresistens har ikke blitt undersøkt skyldes mangel på skikkelig metoder.
For tiden finnes det flere metoder å måle biofilm utrydding. Den mest brukte kvantitative metoden er ved å måle endringer i biomasse bruker crystal violet flekker16. Metoden krever imidlertid betydelig eksperimentelle manipulasjon, som kan potensielt generere feil i forsøket gjentas17. Live/døde flekker metoden brukt her lar visualisering av levende og døde bakterier og distribusjonen innen biofilm. Biofilm strukturen kan imidlertid utgjøre en fysisk barriere som reduserer fargestoff penetrasjon. Derfor for å kvantifisere live/døde bakterier i en gruppe, er den flekker begrenset til små biofilm eller forløper-microcolonies eller samlinger. Andre metoder, inkludert agar fortynning og platen diffusjon testene, kan ikke måle effekten av aggregering. Undersøke GC mottakelighet i aggregering etter antibiotika eksponering, en ideell metode ville nød for å ha begge en kvantitativ analyse som kan måle bor bakterier og visualisere distribusjonen.
Fremgangsmåten som er beskrevet her kombinerer en ATP-utnyttelse måler og en live/døde flekker analysen til kvantitativt og visuelt undersøke GC mottakelighet innen aggregater i nærvær av antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelt vedlikehold av GC stammer
- Strek N. gonorrhoeae stammer GCK Stim: agar med 1% Kellogg kosttilskudd18 (tabell 1, tabell 2) fra fryseren aksjer og ruge 37 ° C med 5% CO2 for 16-18 h. Bruk MS11 uttrykke fase variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en avkortet LOS (MS11ΔLgtE).
- Nøye velge pili negative (kolonien uten mørke kanten) eller positiv (kolonien med mørk kant) koloniene fra hver stamme basert på kolonien morfologi19 bruker dissecting lys mikroskop og strek på en ny GCK Stim: tallerken.
- Ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 16-18 h før bruk.
2. levedyktighet kvantifisering av GC samlinger
- Samle GC bruker en sterile applicator. Vattpinne GC fra platen og å suspendere GC i forvarmes kjøttkraft (GCP, tabell 3) supplert med 4,2% NaHCO3 og 1% Kellogg løsninger18. Bruke spectrophotometry på en bølgelengde på 650 nm (et OD650 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) å bestemme konsentrasjonen av suspendert bakterier.
- Justere konsentrasjonen av GC ~ 1 x 108 CFU/mL.
- Legge til 99 µL av justert GC suspensjon i brønner av en 96-brønns plate.
- Inkuber platen i 6 h 37 ° C med 5% CO2 tillate bakterier å samlet.
- Legge 1 µL av føljetong utvannet ceftriaxone (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) i hver brønn. La noen brønner ubehandlet for å tjene som kontroller.
- Inkuber platen i 24 h på 37 ° C med 5% CO2.
- Sonicate suspensjonen 3 ganger i hver brønn for 5 s på 144 W og 20 kHz.
- Legg 100 µL av kommersielt tilgjengelig ATP utnyttelse glød reagensen i hver brønn, Pipetter opp- og ned for 3 timene, og ruge i 15 min på 37 ° C med 5% CO2.
- Nøye overføre 150 µL av blanding fra hver brønn til en ny brønn i en 96-brønns svarte microplate og unngå å innføre bobler.
- Måle absorbansen av hver brønn på 560 nm likner plate.
- Beregne overlevelse av forholdet mellom lesing innhentet etter føljetong ceftriaxone behandling på leser fra ubehandlet brønner.
3. fluorescens microscopic analyse av Live/Dead av GC aggregater
- Samle GC bruker en sterile applicator. Vattpinne GC fra platen og å suspendere GC i forvarmes GCP media pluss 1% Kellogg kosttilskudd.
- Bestemme antall bakterier av spectrophotometry på en bølgelengde på 650 nm og justere konsentrasjonen av GC ~ 1 x 107 CFU/mL.
- Legge til 198 µL av GC suspensjon inn i 8-vel dekkglassvæske bunn kammer.
- Inkuber kammer for 6 h 37 ° C med 5% CO2 for at aggregering.
- Legge til 2 µL av ceftriaxone (100 µg/mL eller ulike fortynninger) i hver brønn i hver samling tilstand. Inkuber for tiden på 37 ° C med 5% CO2.
- Legg til 0,6 µL av live/døde flekker løsning blandingen i hver brønn og ruge etter 20 min på 37 ° C med 5% CO2.
- Erverve Z-serien bilder ved hjelp av en AC confocal mikroskop (en tilsvarende mikroskop kan brukes).
- Analysere bilder bruker ImageJ programvare for måling av GC aggregater og fluorescens intensitet forholdet (FIR) for live-til-død flekker hver samlet.
4. bildeanalyser
- Estimering av bakteriell aggregat.
- Åpne ImageJ og åpne et bilde ved å dra raw-bildefiler til menylinjen ImageJ.
- Klikk Frihåndslinjer i menylinjen ImageJ sirkel området hver samling i bildet.
- Klikk analysere | Måle i menylinjen ImageJ.
- Få tallet i et nytt vindu i kolonnen området .
- Kvantifisering av live-til-død forholdet mellom samlinger
- Åpne ImageJ og åpne et bilde ved å dra raw-bildefiler til menylinjen ImageJ.
- Klikk analysere | Angi mål i menylinjen ImageJ.
- Kontroller integrert tettheten i popup-vinduet, og klikk OK.
- Klikk bilde | Farge | Kanaler verktøyet i menylinjen og velg farge.
- Sjekk kanal 1 som fluorescens for live bakterier flekker.
- Klikk Frihåndslinjer i menylinjen ImageJ sirkel området hver samling.
- Klikk analysere | Måle i menylinjen ImageJ.
- Få hvor kolonnen IntDen .
- Sjekk kanal 2 som fluorescens for død bakteriell flekker. Gjenta trinn 4.2.6-4.2.8.
- Få live-til-død forholdet av tall fra trinn 4.2.8 av fra trinn 4.2.9.
- Statistisk analyse
- Åpne GraphPad-prisme og angi Hentet fra ImageJ til kolonnen.
- Klikk analyser og velg t tester under kolonnen analyser.
- Når kolonnen for sammenligning, og klikk OK.
- Få den P-verdien under analyse vindu.
- Velg Lineær regresjon under XY analyser fra trinn 4.3.3
- Få R-torget og P-verdien under vinduet analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To metoder var ansatt: en ATP utnyttelse analyse og en live/døde flekker analysen. Resultatet kan enten være kombinert eller individuelt brukes for å undersøke bakteriell overlevelse i aggregat etter antibiotikabehandling. ATP utnyttelse analysen har vist å måle nøyaktig levedyktig bakterier i S. aureus biofilm20,21. Her ble MS11Opa + Pil + belastningen brukt til å undersøke rollen av GC aggregering i antibiotika mottakelighet. Non-samlet MS11Opa + Pil +, aggregert MS11Opa + Pil +, eller samles og deretter forstyrret av sonication MS11Opa + Pil + ble behandlet med føljetong fortynninger av ceftriaxone og ATP nivå målt (figur 1A). Sammenligne prosent overlevelse med og uten antibiotikabehandling, hadde forhåndsakkumulerte GC betydelig høyere overlevelse enn ikke-samlet eller aggregering-forstyrret GC med lik på eller over 0.015 µg/mL av ceftriaxone (mikrofon fra agar fortynning test ( Tabell 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, som har samme agar fortynning MIC (Tabell 4), men skjemaet mindre aggregater, ble undersøkt og sammenlignet MS11Opa + Pil + (figur 1B). MS11Opa + Pil +, danner større aggregat, hadde høyere ATP nivå med ceftriaxone behandling enn de muterte stammene.
Live/døde flekker har blitt brukt i flere biofilm/aggregering-relaterte studier22,23. Å fastslå effekten av aggregering, pre samlet MS11Opa + Pil + ble behandlet med eller uten ceftriaxone og fotografert. Dette gjør at både visualisering (som kan kvantifiseres) og distribusjon av live og dead GC etter antibiotikabehandling (figur 2A- venstre to paneler). Døde bakterier (rød) var hovedsakelig ligger på de ytre lag mens live GC (grønn) lå hovedsakelig i kjernen av ceftriaxone behandlet aggregater. Denne prosedyren ble utført med MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, for å undersøke aggregering størrelse og survival rate (figur 2A). MS11Opa + Pil + ble vist til skjemaet det største og MS11Opa + Pil-de minste aggregatene (figur 2A, B). MS11Opa + Pil + aggregater var fortsatt i live i kjernen laget mens GC, i de lille løs aggregatene av MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, og MS11ΔLgtEPil + var døde (figur 2A, C). Basert på størrelsen og overlevelse, kan en korrelasjon graf tegnes undersøke forholdet mellom aggregering størrelse og antibiotika overlevelse (figur 2D).
Tabell 1: Oppskrift på 1 L GCK Stim: Agar Plate.
Tabell 2: Oppskrift på 1 L 100 x Kellogg's supplement.
Tabell 3: Oppskrift på 1 L GCP bakterievekst Media.
Tabell 4: Minimum inhibitoriske konsentrasjon av GC stammer behandlet med ceftriaxone. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE og MS11Opa + Pil - var vokst og suspendert i GCP. Agar fortynning test ble deretter utført med føljetong konsentrasjon av ceftriaxone fra 0.0016 - 0,25 µg/mL.
Figur 1 : Representant data av overlevelse av aggregert GC under ceftriaxone behandling av ATP-utnyttelse analysen. (A) Survival rate sammenligning av MS11Opa + Pil + suspensjon uten pre aggregering, pre samles for 6 h eller forstyrre etter pre samles for 6 h. (B) overlevelse sammenligning 6 h samlet MS11Opa + Pil + med MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil- eller MS11ΔLgtEPil +. Vist er de gjennomsnittlige verdiene (±SD) Hentet fra tre uavhengige eksperimenter. p < 0,001; p < 0.01; p < 0,05. Dette tallet var tidligere publisert 24 og brukes med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant data av live/døde bakterier distribusjon innen aggregater under ceftriaxone behandling. (A) før samlet MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, eller MS11ΔLgtEPil + var enten ruges i tilstedeværelse eller fravær av 1 µg/mL ceftriaxone for 2 h. aggregater var deretter farget for å visualisere levedyktig (grønn) og døde (rød) GC og visualisert med AC confocal fluorescens mikroskop. Skala bar: 50 µm. bildene ble deretter analysert for (B) aggregering størrelse og (C) forholdet mellom live-til-dead GC og (D) en korrelasjon Graf ble deretter opprettet. Vist er de gjennomsnittlige verdiene (SD) Hentet fra > 40 bilder av tre uavhengige eksperimenter. p < 0,001; p < 0.01; p < 0,05. Dette tallet var tidligere publisert 24og brukes med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterier kan danne biofilm under infeksjon av menneskekroppen. Tradisjonelle mikrofon test gjenspeiler ikke konsentrasjonen trengs å utrydde bakterier i en biofilm. For å teste poesi aksent effekter på en biofilm, kan metoder basert på biofilm biomasse samt plating CFUs være feil på grunn av virkningen av biofilm struktur. For eksempel fungerer metoden plating bare hvis biofilm kan bli avbrutt. Derfor være CFU fått lavere enn det faktiske antallet levedyktig bakterier. Visualisere slaktede og levende bakterier i biofilm er etablert for å måle overlevelse av bakterier i biofilm, men avhengig av strukturen og tetthet av biofilm, den flekker kan unnlate å trenge inn i biofilm og resultere i en unøyaktige og undervurdert overlevelse.
Metoden her bruker både en kvantitativ og en visualisering analysen for å måle bakteriell overlevelse etter behandling av aggregater. Fordelen med denne metoden er at den måler bakteriell overlevelse i et miljø som er nærmere det er sett i en ekte infeksjon. Survival rate forskjellene mellom ikke-samlet og aggregert bakterier vil tillate oss å avgjøre om i vitro MIC korrelerer med i vivo MIC.
ATP utnyttelse analysen, som måler ATP produksjon, kan kvantitativt mål overlevelse av aggregater. Analysen er mer følsom og kan skille overlevelse mellom små forskjeller i antibiotika konsentrasjon, sammenlignet med andre lignende analyser. Men på grunn av høy følsomheten av denne analysen er garanti for bakteriell celle lysis kritiske. Derfor ble litt sonication brukt. I tillegg kan ikke denne metoden brukes til å måle bakteriell overlevelse i vivo på grunn av den store mengden av ATP som vertsceller produserer som kan maskere hvilket bakteriell ATP. Videre kan samspillet av verten cellene med bakterier påvirke bakteriell ATP produksjon. Ved hjelp av denne analysen på bakterier med pigmenter kan begrense som pigmentene kan forstyrre lesingen.
Live/dead flekken har vært mye brukt i biofilm studier. Imidlertid kan utbredelsen av flekker fargestoffer flekker bare ytterste bakterier, mens kjernen ikke kan bli farget. Derfor kan det bare brukes for visualisering men ikke kvantifisering, på grunn av ujevn fordeling av fargestoffet. Vi brukte små mengder til denne farging og vist denne analysen kan brukes å kvantifisere generelt bakterielle overlevelse i aggregatene. Videre er negative og positive kontroller nødvendig for å justere konsentrasjonen av farge for forskjellige bakterier.
I kombinasjon med MIC-protokollen, kan ATP utnyttelse analysen og live/dead flekken tjene som en effektiv metode kvantitativt og visuelt analysere N.gonorrhoeae samt andre bakterielle samlinger25,26. Anvendelsen av kombinerte protokollen kan gi en bedre forståelse av sykdommen formasjon sammen med sin allsidig bruk og i narkotikarelaterte screening basert på bakterier biofilm. Denne metoden kan gjenspeile mer nøyaktig den i vivo MIC av en antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-CW, JW, AC, og E.N. ble støttet i del/delta i "The første års innovasjon & forskning Experience" program finansiert av University of Maryland. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi erkjenner UMD CBMG Imaging kjernen for alle mikroskopi eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
