Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58992
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Biomedical Engineering, The George Washington University

Summary

Her introduserer vi en metode for å bruke en intra-ventrikkel optisk kateter i perfusert hjerter til å utføre absorbansen spektroskopi over hjertet veggen. Dataene innhentet gir robust informasjon om vev oksygen spenning samt substrat utnyttelse og membran potensial samtidig med CARDIAC ytelse tiltak i denne allestedsnærværende forberedelse.

Abstract

Absorbansen spektroskopi av hjertemuskelen gir ikke-destruktiv vurdering av cytosolic og mitokondrie oksygenering via myoglobin og cytokrom absorbansen hhv. I tillegg kan mange aspekter av mitokondrie metabolske status som membran potensial og substrat oppføring også anslås. For å utføre CARDIAC veggen overføring optiske spektroskopi, en kommersielt tilgjengelig side-avfyring optisk fiber kateter plasseres i venstre ventrikkel av isolerte perfusert hjerte som lyskilde. Lys passerer gjennom hjertet veggen er samlet med en ekstern optisk fiber for å utføre optiske spektroskopi av hjertet i nær sanntid. Overføringen tilnærmingen unngår mange overflate spredning forstyrrelser forekommer i mye brukt refleksjon tilnærminger. Endringer i transmuralt absorbansen Spectra ble deconvolved ved hjelp av et bibliotek med kromoforen referanse Spectra, gi kvantitative tiltak av alle kjente CARDIAC chromophores samtidig. Denne Spectral deconvolution-tilnærmingen eliminert iboende feil som kan oppstå som følge av at vanlige metoder for dobbel bølgelengde brukes på overlappende absorbansen Spectra, i tillegg til en kvantitativ evaluering av den gode tilpasningen. Et egendefinert program ble utviklet for datainnsamling og analyse, som tillot etterforsker å overvåke metabolsk tilstand av preparatet under eksperimentet. Disse relativt enkle tilskuddene til standard hjerte-system gir et unikt innblikk i metabolsk tilstand av hjerte veggen i tillegg til konvensjonelle tiltak av sammentrekning, og substrat/oksygen utvinning.

Introduction

Optisk absorbansen spektroskopi for overvåking intakt organ biokjemi er en mye brukt tilnærming på grunn av sin egen verdi, ikke-destruktive natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbansen gir et mål på gjennomsnittlig cytosolic oksygen spenning10,11,12. Mitokondrie cytokromer gi informasjon om substrat oppføring på nivå med flavins, membran potensial fra cytokrom bL: bH13, og oksygen levering til mitokondrier i cellen fra cytokrom oksidase (Cox ) Redox stat14. Glancy et al. demonstrert at aktivitetene til hver komplekser kan bestemmes ved å måle mitokondrie membran potensialet og metabolske rate15. Derfor, ved hjelp av optiske spektroskopi, kan et vell av informasjon fås uten behov for eksogene sonder eller store modifikasjoner av dagens studie systemer. Målet med denne utredningen er å presentere en robust metode for å samle overføring optiske Spectra i konvensjonelle perfusert hjerte preparater med den eneste store endringen som utfører studier i et mørkt miljø.

Refleksjon absorpsjon spektroskopi har blitt brukt til å utføre optiske spektroskopi av perfusert hjerte3,6,16,17,18,19 i tillegg som hjertet i vivo1. Refleksjon spektroskopi består av impinging lys på hjerte overflaten og samler lyset spredt gjennom hjertet, så vel som diffus og speilende utheving reflektert lys. Dermed er den innsamlede lys i denne tilnærmingen en sammensatt av flere spredning mekanismer samt vev kromoforen absorbances av interesse. På grunn av bevegelse og komplekse overflaten av hjertet, lys refleksjon av overflaten av hjertet er spesielt problematisk, endre dybden av penetrasjon og mengde rent reflektert lys.

Begrensningene for refleksjon absorpsjon spektroskopi presentert ovenfor ble løst ved å innføre en optisk kateter inn i venstre ventrikkel hulrom, tillater innsamling av overført lys over venstre ventrikkel gratis vegg20. Fordelene ved overføring spektroskopi for denne type studier ble verdsatt i tidlig invasiv studier av Tamura et al.9 den nåværende gjennomføringen gir en svært robust overføring absorpsjon spektroskopi analyse av intakt hjertet med hensyn til cytosolic oksygenering og mitokondrier Redox tilstand under en rekke forhold21. Disse innledende studiene brukt et spesielt fabrikkert kateter med en drevet LED på spissen orientert for å generere en side-avfyring mønster av hvitt lys gjennom myokard. Imidlertid er det relativt store LED tippet kateter bare hensiktsmessig for bruk på middels store hjerter (kanin, marsvin, etc.) og nødvendig tilpasset fabrikasjon. Inne det aktuelle studere, en metoden av benytter en kommersielt anvendelig 200-mikron kjernen side-skyting optisk fiber som lyset guide er forevist. I stedet for en kablet LED på tuppen, omdirigerer kateteret med 500-mikro-spissen lys fra en ekstern kilde som øker allsidigheten til systemet. Denne tilnærmingen tillater bruk av en rekke eksterne lyskilder inkludert lasere for applikasjoner som Raman spredning spektroskopi. Å kvantifisere disse dataene, en online full multikomponent Spectral analyse bruker kjent referanse Spectra å forbedre nøyaktigheten av spektroskopiske bestemmelse av CARDIAC chromophores presenteres som tidligere beskrevet20,22. Kildekoden for denne analysen vil bli gitt av forfatterne på forespørsel. Ved hjelp av denne tilnærmingen, informasjon om CARDIAC biokjemi og mitokondrie funksjon kan fås samtidig med de konvensjonelle CARDIAC funksjonelle parametre med liten eller ingen innvirkning på hjertet forberedelse. Ettersom hjertet er kritisk avhengig av mitokondrie funksjon og oksygen levering, denne tekniske tillegg til den klassiske perfusert hjerte systemet vil i stor grad forbedre tolkningen og nytten av denne viktige modellen av CARDIAC ytelse.

Protocol

Alle dyre protokoller ble godkjent av National Heart, Lung, og Blood Institute Animal Care og use Committee og utført i samsvar med retningslinjene beskrevet i Animal Care and Welfare Act (7 USC 2142 § 13).

1. isolert Perfusert hjerte system og Perfusate

Merk: denne forberedelsen er svært lik tidligere publikasjoner23.

  1. Lag 4 liter modifisert Krebs-Henseleit perfusate sammensatt av (i mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 GLUKOSE, 1,0 melkesyre, og 10,0 HEPES.
  2. pH perfusate til 7,4 ved 37 ° c med NaOH og HCl.
  3. Filtrer perfusate gjennom en pore-membran på 1 μm.
  4. Skyll alle rørene og kamrene i det perfusert hjerte systemet ved å løpe og tømme renset vann gjennom systemet.
  5. Overfør perfusate inn i tanken og oxygenate med 100% O2 med bubbler og samtidig opprettholde temperaturen ved 37 ° c ved hjelp av et oppvarmet sirkulasjons vannbad.
  6. Tilsett 2 av 12 μm-membran med pore og fyll opp systemet med perfusate mens du resirkulering i Langendorff-modus.
  7. Fest en slange klemme på røret rett over aorta kanyle og justere skruen slik at aorta strømmen synker til ca 10 mL/min.

2. kanin hjertet forbruker-og

  1. Hjerte forbruker
    1. Bedøve mannlige New Zealand hvite kaniner (ca 3 kg) via en 1,5 mL intramuskulær injeksjon av ketamin/acepromazine blanding (10:1).
    2. Ca 10-15 minutter senere, administrere 3% isoflurane via inhalasjon for en komplett bedøvelse effekt.
    3. Bekreft riktig dybde av anestesi ved tå knipe og deretter plassere en linje i marginale øret vene for administrasjon av påfølgende legemidler.
    4. Injiser 1 500 enheter (eller 1,5 mL av 1 000 enheter/mL) heparin og la sirkulere i 3 minutter.
    5. Dobbeltsjekk riktig dybde av anestesi og deretter euthanize med 6 mEq (eller 3 mL 2 mEq/mL) av KCl.
    6. Raskt åpne brystet, finne hjertet er Apex og aorta. Fjern hjertet ved å kutte aorta så langt fra hjertet som mulig og kutte lunge årer så nær lungene som mulig.
      Merk: fjerning av lungene på dette tidlige stadiet er forskjellig fra forrige utgivelse23 , men har ikke innvirkning på forberedelser.
    7. Plasser hjertet i et lite beger med perfusate (samme perfusate som i trinn 1,3) som sitter i en bøtte med is for transport fra operasjon til.
  2. Hjerte kanyleringen
    1. Kannelerer og knytte aorta sikkert, og pass på å ikke inkludere noen bobler i aorta linjen.
    2. Initiere flyt ved 70 mmHg trykk ved å fjerne slangen klemmen på aorta linjen og opprettholde dette trykket i resten av kirurgi og fartøy kanyleringen.
    3. Skill lungearterien fra aorta og andre fartøy og ombinde vena cavae og lunge årer. Fjern fett og bindevev fortsatt til stede.
    4. Kannelerer lungearterien for å gi et mål på koronar sinus strømningshastighet og oksygen spenninger.
    5. Kast første flyt ut av hjertet (i ca 10 minutter) under utarbeidelse for å eliminere blod og kirurgisk rusk. Etter denne perioden, recirculate perfusate.

3. side-avfyring fiberoptisk plassering

  1. Koble fiberoptisk kateter til en høyeffekts fiber-kombinert LED hvit lyskilde for å hjelpe visualisering, samt gi lys for spektroskopi gang i hjertet.
  2. Skjær en liten vedheng av venstre Atrium, sett kateteret inn i venstre ventrikkel via mitral ventilen, og roter den for å oppnå en opplyst venstre ventrikkel fri vegg.
  3. Plasser pickup fiberoptisk direkte motsatt området av maksimal belysning av venstre ventrikkel på ca 1 cm fra hjertet.
  4. Koble den andre enden av pickup fiber til en rask skanning spektrometer.

4. optiske spektroskopi

  1. Slå av lysene i det eksperimentelle området for å få fullstendig mørke.
  2. Start det egendefinerte programmet, som omfatter spektrometer drivere for å utføre datainnsamling og sanntids analyse av det overførte lyset.
    Merk: en kjørbar versjon av den konsoliderte versjonen av Spectral oppkjøp og analyse program leveres som en supplerende kodings fil. Kildekoden er tilgjengelig på forespørsel til forfatterne.
  3. Naviger gjennom alle spørsmål, velge alternativer for perfusert hjerte spektroskopi oppkjøpet modus. På neste side angir du om det forekommer datainnsamling. Til slutt skriver du inn anskaffelses parametere, inkludert plassering av både chromophores referanse Spectra og data som skal lagres.
  4. Angi en båndbredde på 490 – 630 NM.
  5. Angi en samplingsfrekvens på 2 Hz (dvs. 2 prøver/sek).
  6. Samle en mørk strøm, eller null lys, spektrum for å korrigere for bakgrunns signal nivåer ved å slå av lyskilden.
  7. Klikk for å velge de kromoforen referansene som ønskes brukt i tilpasnings rutinen.
  8. I hente data siden, justere plasseringen av både kateteret og pickup fiber for å maksimere overført lys vises på programvaren med spesiell oppmerksomhet til signal amplitude i 500 NM regionen, hvor oksygen myoglobin absorbances bør overholdes.
  9. Pass på at det overførte lyset ikke mette detektoren i 600 NM-regionen.
  10. Sørg for at ingen eksterne lyskilder bidrar til det innsamlede spekteret ved å slå av kateter belysningen og bekrefte at det ikke er oppdaget noe lys nå.
  11. Start datainnsamlingen ved å klikke på Lagre Spectra -knappen.
  12. Falle i staver opp på sette idet administrere å utsikt forskjellen absorbansen gjenferd fra fremtid Spectra å det aktuelle "administrere" gjenferd.
  13. Utfør fysiologiske forstyrrelsene etter ønske.
    1. Protokoll 1: effekt av cyanid på CARDIAC Performance og Kromoforen absorpsjon
      1. Stopp resirkulering væske fra hjertet.
      2. Ved hjelp av en sprøyte pumpe, injisere cyanid (2,5 til 75 mM ved pH 7) på ulike priser i perfusate like før aorta kanyle for å oppnå ønsket konsentrasjoner av cyanid (0,025 til 1 mM, beregnet fra aorta flow rate) i rennende perfusate inn i hjertet mens overvåke hjertefunksjon og optiske egenskaper.
      3. Stopp cyanid sprøyten pumpen når effekten på koronar flyt og hjertefrekvens sammen med den optiske overføringen gjennom hjertet veggen er i steady state.
    2. Protokoll 2: iskemi/hypoksi
      1. Stopp cyanid infusjon.
      2. Etter 5 minutter slå boblende gass fra 100% oksygen til 100% nitrogen å fjerne oksygen fra systemet.
      3. Etter ca 10 minutter, stoppe flyten for å simulere en total iskemiske/hypoxic tilstand.

5. Spectral dataanalyse

  1. Kjør programmet i perfusert hjerte analyse modus.
  2. Velg passende spektrometer.
  3. Skriv inndatafilen banen og referanse Spectra fil og velg kateter lyskilde, som laster pre-lagret spektrum av kateteret lyskilde.
  4. Velg Read bin data.
  5. Velg Angi min. og Maks bølgelengde.
  6. Angi båndbredden for dataanalysen som 490 – 630 NM.
  7. Velg gå tilbake til hovedmenyen.
  8. Velg Les referanser.
  9. Bekreft referansen Spectra å bruke i analysen.
  10. Velg gå tilbake til hovedmenyen.
  11. Velg tids punkt i hovedmenyen.
  12. Velg et T0 tids punkt som kontroll, og sett området til 100 poeng.
  13. Velg et T1-tidspunkt som den eksperimentelle perioden på en rekke 100 poeng.
  14. Observer den rå forskjellen spektrum i gjennomsnitt ABS. Spectrum kategorien.
  15. Velg Beregn Fit koeffisienter , og klikk deretter på Fit koeffisienter TAB for å observere tiden løpet av referansen Spectra Fit.
  16. Gå tilbake til hovedmenyen og velg Beregn differanse ABS.
  17. Velg T0 og ΔT1 på alle posisjoner. Observer det monterte spekteret i vinduet for forskjellen spektrum og tilpasnings elementer i vinduet Referanse vekt .
  18. Gjenta denne fremgangsmåten for å sammenligne andre tids punkter i eksperimentet.
  19. Gå tilbake til hovedmenyen.
  20. Lagre data og analyser i en regneark rapport ved å skrive inn et ønsket navn og velge lagre data for ytterligere analyse med andre programmer.
    Merk: Hvis du ikke skriver inn noe navn, lagres rapporten med samme navn som inndatafilen. Rapporten lagres i en mappe som heter Excel analyse filer, som ligger i samme mappe som den opprinnelige inndatafilen.

Representative Results

Systemet som brukes er en av sokkelen lite dyr, uten hjerte system, men ble sterkt modifisert for bruk med en kanin hjerte. Endringene var først og fremst å øke bore størrelsen på alle slangen for å sikre tilstrekkelig flyt levering til kanin hjertet. Det ble gjort stor forsiktighet for å sikre at strømningshastigheten til det innfødte systemet oversteg flyten med hjertet festet med minst 5-fold ved bruk av et trykk. 2-12 μm pore membran filtre ble plassert parallelt mellom væsken pumpen og aorta forhåndsinnlasting boble felle kammer for å fjerne eventuelle rusk fra hjertet.

Overført lys fra Rabbit Heart
Figur 1 presenterer spekteret av kateteret (figur 1A) og den rå spekteret av overført lys fra kanin hjertet fri vegg (figur 1B). Disse dataene avslører en meget stor demping av lys i den blå regionen i spekteret, men båndene av absorbansen fra myoglobin og mitokondrie cytokromer kan direkte observert mellom 490 og 580 NM i innsatsen. Det er viktig i disse studiene for å sikre nok overført lys oppdages i regionen fra 490 til 630 NM for å få informasjon om metabolically responsive CARDIAC chromophores. Plasseringen av eksterne og interne fibre er justert før lagring av data for å maksimere lys intensitet, men ikke mette detektoren i 625 NM regionen.

Referanse redusert minus oksidert Spectra referanse Chromophores i hjertet.
Figur 2 presenterer referansen Spectra brukes til å passe forskjellen Spectra samlet i disse studiene. Disse referansene inkluderer myoglobin, cytokrom AA3 (alternativt cytokrom en605 og cytokrom en607, avhengig av hvilken type forstyrrelsene22), cytokrom en580, cytokrom bL, cytokrom bH , cytokrom c, cytokrom c1, Fad, an absorbansen representasjon av hendelsen lys (betegnet jeg0, som brukes til å gjøre rede for soldet lys, det vil si fotoner som gikk gjennom vevet uten å bli absorbert), og en linje (med varierende helling og skjæringspunkt for å gjøre rede for spredning, ikke vist i figur 2). Noen Spectra er bråkete, som konsentrasjonen av ren referansematerialet var svært lav22.

Tid løpet av referanse Spectra passer under totalt eksperiment
Figur 3 representerer tidsforløpet for et vanlig eksperiment beregnet i trinn 5,15 i protokollen. Dette består av en kontroll fase, etterfulgt av en cyanid injeksjon fase, etterfulgt av en cyanid bleke, etterfulgt av en deoxygenation fase, og til slutt iskemi. Endringene i den enkelte chromophores (myoglobin, cytokrom AA3og cytokrom c) over tid er plottet over tid sammen med koronar strømningshastighet. Den optiske tettheten endring av hver kromoforen er anslått ved å multiplisere passer koeffisienten innhentet fra den lineære minst kvadrater rutine og den representative toppen av kromoforen (eller maksimal absorbansen av sa kromoforen). For eksempel, for myoglobin, blir tilpasnings koeffisienten til den myoglobin referansen multiplisert med verdien av myoglobin referanse spektrum ved 580 NM. Legg merke til den raske oksygenering av myoglobin til tillegg av cyanid er matchet av økningen i flyten, men er før betydelig reduksjon av cytokromer. Denne effekten er delvis utvinnes med det bleke av cyanid. Til slutt, full reduksjon av cytokromer og deoxygenation av myoglobin oppnås med iskemi. Disse dataene viser at dynamiske data om metabolsk status av hjertet kan lett fås med denne metodikken. Plasseringen av Spectra brukes for forskjellen Spectra er merket på denne tiden kurset som: C Baseline, CN cyanid injeksjon, CNW cyanid bleke, H N2 hypoksi (nitrogen blir boblet i perfusate i stedet for oksygen), og Hi no flow ischemia (ingen perfusate strømmer gjennom hjertet).

Differansen gjenferd av cyanid handling mot administrere og anfall av cyanid differansen gjenferd fra kanin hjertet.
For å få en forskjell spektrum, to absolutte Spectra trekkes. Hver absolutte spekteret oppnås ved å ta et gjennomsnitt av mange (vanligvis 100) Spectra å optimalisere signal til støyforhold. Figur 4 A representerer forskjellen spekteret av kontroll (C) og CYANID (CN) behandlet hjerte. Ved hjelp av referansen Spectra skissert i figur 2, er passe spektrum beregnet. Det gjenværende spekteret er subtraksjon av tilpasningen fra rådata. Den samme ordningen brukes for alle påfølgende Spectral presentasjoner. Figur 4 B presenterer Spectra amplituder av referansen Spectra (vist i figur 2) brukes til å passe Figur 4A. Sterk økning i absorbansen av de fleste av cytokromer er observert som flyten av elektroner ned cytokrom kjeden ble blokkert av cyanid i steady state. I tillegg absorbansen av oksygenert myoglobin økt som forbruket av oksygen ble eliminert av cyanid. Figur 4 C presenterer forskjellen Spectra og tilpasning av forskjellen SPEKTERET fra CNW og cn, avslører delvis reversering av cyanid effekt. Dette ble oppnådd ved å velge tids punkt i protokollen trinn 5,18, flytte T0 til CNW og T1 til CN regionen av tiden kurset. Figur 4 D presenterer forskjellen SPEKTERET av hi og C, som representerer fullt deoxygenated og redusert tilstand av stoffer og mitokondrier versus kontroll tilstand. Igjen, dette ble utført på protokollen trinn 5,18, flytte T0 til C og T1 til HI.

Første gang løpet av cyanid effekter på koronar flyt og chromophores
Figur 5 A viser et eksempel på initiering av cyanid effekt på vevet. Den passer for myoglobin, cytokrom en605 og cytokrom c sammen med koronar flyt er presentert for ett enkelt hjerte. Disse tids kursene ble opprettet i protokoll trinn 5,15 for cyanid eksperimentet. Den individuelle forskjellen kontra den opprinnelige planen (posisjon 1) vises i figur 5B. Den Spectra ble generert fra tilsvarende posisjon nummer (1-4) på den tiden kurset. Dette ble oppnådd ved protokollen trinn 5,18, der T0 var alltid i posisjon 1, og deretter forskjellige Spectra (2 – 4) ble opprettet ved å flytte T1 til posisjon 2, 3 og 4 hhv. Noe overraskende var observasjonen som flyt og myoglobin oksygenering økt før betydelige endringer i cytokrom Redox tilstand. Initiering av endringer i flyt og kromoforen absorbansen ble anslått av lineær ekstrapolering av den opprinnelige endringen i Baseline. Ved hjelp av denne tilnærmingen, og innstillingen endringen i koronar flyt som tid null, økningen i myoglobin oksygenering initiert 1,71 min ± 0,39 min etter endringen i flyt, mens cytokrom A605 og cytokrom c absorbansen var nesten identiske, men mye tregere på 4,24 min ± 0,76 min og 4,34 min ± 0,77 min, henholdsvis (n = 8). Disse dataene tyder på at cyanid slapper vaskulær tone24 før en stor endring i CARDIAC muskel metabolske tilstand oppstår. Denne effekten er sannsynligvis forårsaket av cyanid møte vaskulære glatt muskel før nå effektiv dose rundt CARDIAC myocytter.

Estimater av Myoglobin oksygenering i kontroll hjerter
Ved hjelp av cyanid data som et estimat av total myoglobin oksygenering og iskemi data for fullt deoxygenated myoglobin, anslår vi at under kontroll forhold myoglobin var bare 88,2% ± 1,0% (n = 10) oksygenrikt, i samsvar med tidligere studier20 , 21 priser og , 25på.

Figure 1
Figur 1 : Spectra av side-avfyring optisk kateter. (A) dette er et spektrum av utsendt lys fra den eksterne lyskilde gjennom kateteret oppdaget med pickup fiber på ca 1 cm fra kateteret. I denne geometrien, er hjertet fraværende og intensiteten av lyskilden er innstilt slik at detektoren ikke mette. (B) side skyte kateteret settes inn i venstre ventrikkel, og det overførte lyset fra hjertet samles og vises. Innsatsen viser 400 til 580 NM regionen utvidet, avslører den komplekse overføring av lys fra denne regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Referanse Spectra av CARDIAC chromophores brukes for Spectral montering. Spectra ble samlet inn via en rekke metoder22 og er av redusert-oksidert (for cytokromer) og deoxygenated-oksygenrikt (for myoglobin). For jeg0, er spekteret i figur 1A bare konverteres til et absorbansen begrep for å gjøre referansen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Flow og optiske endringer over tid. Det optisk tettheten endre (ΔOD) av hver kromoforen er bare det montert individ kromoforen ' gjenferd for dens maksimum absorbansen. Den maksimale absorbansen frekvensene var som tidligere beskrevet20,26. Den presenterte tiden kurset er for ett eksperiment, viser en Baseline, etterfulgt av cyanid injeksjon (0,10 mM ved maksimal perfusate flow), cyanid bleke, nitrogen hypoksi utført ved å erstatte oksygen med nitrogen, og deretter fullføre iskemi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Montert forskjell Spectra av ulike forhold. (A) spekteret av cyanid injeksjon minus Baseline. Den passer spekteret innhentet fra minst firkantet rutine er også plottet. Den gjenværende spekteret er forskjellen mellom den rå og passer Spectra. (B) referansen Spectra brukes til å lage passformen presentert i Figur 4A. Programmet skalerer referansene i figur 2 til deres relative bidrag i den aktuelle forskjellen spekteret. (C) samme som i A, men viser forskjellen spekteret av bleke versus cyanid injeksjon. (D) samme som i A, men viser forskjellen spekteret av iskemi versus Baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Høy Temporal oppløsning av cyanid infusjon effekt på utvalgte cytokromer, myoglobin og CARDIAC Flow. (A) tid løpet av CARDIAC Flow, deoxymyoglobin, redusert cytokrom en605, og redusert cytokrom c. tall refererer til plasseringen av Spectra tatt i forhold til Baseline i figur 5B. (B) differansen Spectra for de 4 posisjonene merket i figur 5A kontra kontroll (posisjon 1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den isolerte retrograd eller arbeider perfusert hjerte forberedelse er en bærebjelke i studiet av hjerte fysiologi samt prekliniske gransking av teknikker og rusmidler på hjertet. Nøkkelen til bruken har vært enkel forberedelse, robuste funksjonelle egenskaper og kontroll av eksperimentelle parametre samt evne til å måle mange funksjonelle parametre av bankende hjerte. Optisk absorbansen spektroskopi gir innsikt i vev oksygenering samt mitokondrier metabolske aktiviteter. Optisk spektroskopi har hovedsakelig gjennomført i den isolerte perfusert hjerte studier i refleksjon modus som det er vanskelig å tolke på grunn av bevegelse og lysspredning komplikasjoner.

Vi har innført ventrikkel veggen overføring optiske spektroskopi (VWTOS) for å gi en robust metode for overvåking CARDIAC vev metabolske chromophores. I en tidligere publikasjon, viste vi at en LED fastkoblet til spissen av koaksialkabel20 gjør en unik intrakardielle side-avfyring lyskilde som kan brukes til VWTOS perfusert hjerter. Side-avfyring refererer til projeksjon av lys vinkelrett på den lange aksen av kateteret, ideelt for å belyse ventrikkel fri vegg. LED-kateteret var lite nok til å ikke påvirke hjertefunksjon, men krevde spesialisert fabrikasjon i laboratoriet. Den nåværende studien presenterer bruken av en 500 mikron kommersielle side-avfyring kateter som kan kobles til en lyskilde kompatibel med fiberoptikk. Disse side-avfyring optiske katetre ble kommersielt utviklet for laser ablasjon vinkelrett på den lange aksen av fiber. Naturligvis bruker vi lys kraft mye lavere enn det som er nødvendig for photoablation. Mindre fibre er tilgjengelig for bruk på mindre preparater som perfusert mus hjerte27. Dette fiberoptisk system gitt tilstrekkelig belysning gjennom hjertet veggen i bølgelengdeområdet der CARDIAC chromophores absorbere (450-630 NM). Ved hjelp av en pickup fiberoptisk på utsiden av hjertet, kan absorbansen av myoglobin og mitokondrier cytokromer overvåkes med utmerket Temporal og Spectral oppløsning (se figur 5). Den side-avfyring fiberoptisk tilnærming har flere fordeler fremfor LED-kateter for VWTOS, inkludert en mye mindre tverrsnitt profil av kateteret som minimerer virkningen av kateteret på hjertet, mer fleksibel redusere innvirkning på hjerte-ventil og ventrikkel ytelse, ingen elektriske tilkoblinger som kan korte ut i saltvann perfusate, og til slutt et kateter som bruker en ekstern lyskilde som øker fleksibiliteten til lys kildevalg for VWTOS.

På grunn av den sterke absorbansen av hjertet under 490 NM, er det vanskelig å generere mye informasjon om Soret-båndet i cytokromer i regionen 410 – 445 NM eller NADH ved 340 NM. Dermed er den brede absorbansen av FAD på 450 nm den laveste frekvensen absorbansen som er observert, selv om hele absorpsjon toppen av denne chromophores ikke er samplet. Bruke VWTOS signalet til støyforhold er svært høy som hele veggen er samplet i motsetning til overflaten refleksjon spektroskopi, vanligvis brukt20, som bare prøver overflaten av hjertet med mange spredning problemer. VWTOS prøvetaking hele hjerte veggen er mer analog til Nuclear magnetisk resonans spektroskopi (NMRS) tiltak av mange CARDIAC metabolitter som 31P oppdaget adenosin trifosfat og kreatin fosfat28, 13C oppdaget merket metabolitter29,30 inkludert hyperpolarized etiketter31,32og 1H oppdaget metabolitter33. Som VWTOS kan gjennomføres ved hjelp av ikke-magnetiske enheter, er det helt gjennomførbart at NMR og VWTOS kunne gjennomføres samtidig. VWTOS er ikke begrenset til endogene chromophores og kunne brukes til å overvåke absorpsjon fra optiske sonder for pH, ca2 +, og plasma membran potensial.

Vi bruker 2 Hz (dvs. 2 prøver/sek) som gir utmerket enkelt spektrum signal til støy. Selv om høyere samplingsfrekvenser kan oppnås som tillater CARDIAC syklus analyse, tidligere studier har vist at det er ingen beat å slå variasjon i kromoforen absorbansen, så ingen innsats for å selektivt samle lys som en funksjon av CARDIAC syklus var laget34. På grunn av VWTOS geometri er påvisning av lys mindre avhengig av vev bevegelse enn refleksjon metoder, siden de komplekse overflate spredning hendelser er eliminert. Vi finner at alvorlig bevegelse kan forstyrre disse tiltakene, men sanntid Spectral analyse raskt avslører Spectral overganger uforenlig med vev kromoforen overganger. Igjen, dette bare oppstår når hjertet beveger seg grovt bort fra innsamling fiber dramatisk redusere mengden av innsamlet overført lys.

VWTOS data analyseres ved hjelp av full Spectral tilpasning rutine basert på et referanse bibliotek med Spectra CARDIAC chromophores og spekteret av lyskilden som tidligere beskrevet20,22,27, 35 med en enkel lineær minst kvadrater tilnærming. Denne Spectral montering prosedyre kompensert for overlappende absorbansen spektrum og ikke stole på "isobestic" bølgelengder. Denne hele spekteret analysen eliminerer gjenstander forbundet med felles dual Beam (dvs. to bølgelengde) analyse1,3,6 som har vist å være problematisk20. Den ekstra fordelen med full Spectral analyse er generering av en godhet passe fra rester, ikke tilgjengelig i dual Beam protokoller.

I denne studien, fokuserte vi på effekten av cyanid på de optiske egenskapene til hjertet. Som cyanid blokker cytokrom oksidase, hemmer det oksygenforbruk og i hovedsak resulterer i en netto reduksjon av alle cytokromer som elektroner tilbake opp i cytokrom kjeden. Imidlertid er membranen potensialet tilsynelatende høy, som Redox endringer i bL og bH er svært små i forhold til cytokrom c13. Med opphør av oksygenforbruk, oksygen spenninger i vevet bør nærme seg perfusate og vi noterte en tidlig økning i oksygen myoglobin med cyanid i samsvar med forestillingen om at saltvann perfusert hjerte, selv i retrograd moduser, er ikke fullt oksygennivået myoglobin i stoffer19,20,21,36. Sammenligning av maksimal effekt av cyanid på oksygenrikt myoglobin med fullt deoxygenated spektrum innhentet med iskemi avslører en myoglobin oksygenering av bare ca 88%, i samsvar med tidligere studier.

Det er viktig å merke seg i denne studien at cyanid effekter på myoglobin oksygenering og cytokrom reduksjon ble midlertidig løst. Det er overraskende at virkningene av cyanid først ble observert på koronar strømning og myoglobin før store forandringer i hjertets cytokromer Redox tilstand ble observert. Tidlig markert økning i Flow tyder på at en effekt på arteriell glatt muskel24,37 kan oppstå før brutto metabolske virkninger i hjerte cellene er observert. Økningen i flyt, potensielt med en beskjeden cyanid indusert reduksjon i respirasjon, sannsynlige resultater i umiddelbar økning i oksygenert myoglobin forårsaket av økningen i oksygen levering. Med spredningen av cyanid hemming til myocytter, en ytterligere økning i koronar flyt er observert (se regionen merket 3 i figur 5a), sannsynligvis drevet av mange metabolske faktorer38. Den store tidlige virkningen av cyanid på flyt tyder på at metabolismen av vaskulære glatt muskel kan være mer potent i å endre vaskulær tone enn metabolismen av myocytter. Disse dataene støtter den veletablerte forestillingen om at myoglobin har en mye lavere affinitet for oksygen enn COX, selv i intakt hjerte, som myoglobin oksygenering skjedde godt før endringer i mitokondrier Redox tilstand (figur 5). Dette høye nivået av deoxygenated myoglobin under kontroll forhold er i overensstemmelse med tidligere studier som tyder på at det isolerte saltvanns perfusert hjerte kan være delvis hypoxic selv under kontroll forhold9,19, 20,21,27,36, understreker viktigheten av å overvåke CARDIAC vev oksygenering når du bruker denne viktige modellen i hjerte fysiologi.

Vi presenterer her de eksperimentelle detaljene for å gjennomføre overføring absorpsjon spektroskopi på isolerte perfusert hjertet. Vi har med hell tilpasset denne teknikken for bruk på hjertene fra kaninen til musa ved hjelp av en tynn side-avfyring intrakardielle optisk fiber. Utnytte State of the art full Spectral montering rutiner, kan den komplekse optiske samspillet av CARDIAC chromophores enkelt trekkes ut gir, en nær sanntids mål på kritiske elementer av hjerteinfarkt metabolisme samtidig med konvensjonelle funksjonelle tiltak.

Disclosures

Ingen konflikter av interesse erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble fullstendig støttet av NHLBI intramural program (Project # ZIA HL00460131).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BIOPAC data acquisition system BIOPAC MP150 Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers BIOPAC DA100C Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier BIOPAC SKT100B temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers Mightex SLC-MA02-U External light source power supply
Disposable pressure sensors BIOPAC RX104A Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump KdScientific KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP drug injection
Flow-through probes Transonic 4PXN perusate flow monitoring
Glass Syringe FORTUNA Optima 30 CC Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source Mightex Type-A FCS-0000 External light source
Perfused heart system Radnoti 120101BEZ This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter Ocean Optics NeoFox-GT oxygen concentration
Pickup fiber optic Thor labs BF20HSMA01 Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit AD Instruments PowerLab 8/35 Analog to digitial conversion
Pressure transducers BIOPAC TSD104A pressure monitoring
Programming environment LABViEW N/A Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer Ocean Optics QE65PRO Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 JTFLH200230500/1.5M  side firing fiber optic 200 microns core 
Sodium cyanide Sigma-Aldrich 380970 Metabolic inhibitor
Temperature probe BIOPAC TSD102A temperature monitoring
Tubing flow modules Transonic TS410 perusate flow monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 2 Pt 2 683-697 (1999).
  2. Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
  3. Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
  4. Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
  5. Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 6 Pt 2 2561-2568 (1995).
  6. Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
  7. Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
  8. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  9. Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
  10. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, Pt 14 2180-2189 (2015).
  11. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
  12. Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
  13. Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
  14. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
  15. Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
  16. Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
  17. Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
  18. Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
  19. Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
  20. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  21. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  22. Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
  23. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  24. Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
  25. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  26. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  27. Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).
  28. Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
  29. Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 1 Pt 2 160-168 (1995).
  30. Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
  31. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
  32. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  33. Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
  34. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  35. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  36. Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
  37. Paul, R. J. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. , American Physiological Society. 201-252 (1980).
  38. Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).

Tags

Bioteknologi hjertefunksjon hjerte metabolisme mitokondrier myoglobin cytokrom oksidase cytokrom c cytokrom b FAD mitokondrier membran potensial vev oksygenering optisk spektroskopi Spectral montering
Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Femnou, A. N., Giles, A., Balaban,… More

Femnou, A. N., Giles, A., Balaban, R. S. Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts. J. Vis. Exp. (147), e58992, doi:10.3791/58992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter