Summary
Här introducerar vi en metod för att använda en intraventrikel optisk kateter i parfymera hjärtan för att utföra absorbansspektroskopi över hjärtväggen. De data som erhålls ger robust information om vävnadens syre spänning samt substrat utilization och membranpotential samtidigt med hjärt prestanda åtgärder i denna allestädsliga beredning.
Abstract
Absorbans spektroskopi av hjärtmuskeln ger oförstörande bedömning av cytosoliska och mitokondriell syresättning via myoglobin och cytokrom absorbans respektive. Dessutom kan många aspekter av mitokondriell metabolisk status såsom membran potential och substrat inträde också uppskattas. Att utföra kardiell vägg transmission Optisk spektroskopi, en kommersiellt tillgänglig Side-bränning optisk fiber kateter placeras i den vänstra ventrikeln av isolerade parfymera hjärta som en ljuskälla. Ljus som passerar genom hjärtväggen samlas med en extern optisk fiber för att utföra Optisk spektroskopi av hjärtat i nära realtid. Överföringsmetoden undviker många ytspridnings störningar som förekommer i allmänt använda reflektions metoder. Förändringar i transmural absorbansspektra deconvolved med hjälp av ett bibliotek av kromofor Reference Spectra, som ger kvantitativa mått av alla kända hjärtkromophores samtidigt. Denna spektrala deconvolution metod elimineras inneboende fel som kan resultera från att använda gemensamma dubbla våglängd metoder tillämpas på överlappande absorbans spektra, samt som en kvantitativ utvärdering av godhet av passform. Ett anpassat program utformades för datainsamling och analys, vilket tillät prövaren att övervaka preparatets metaboliska tillstånd under experimentet. Dessa relativt enkla tillägg till standard hjärtat perfusion systemet ger en unik inblick i det metabola tillståndet i hjärtväggen utöver konventionella åtgärder av kontraktion, perfusion, och substrat/syre utvinning.
Introduction
Optisk absorbansspektroskopi för övervakning intakt organ biokemi är en allmänt använd metod på grund av dess inneboende, icke-förstörande natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbans ger ett mått på den genomsnittliga cytosoliska syre spänningen10,11,12. Mitokondriella cytokromer ger information om substrat inträde på nivån av flaviner, membran potential från cytokrom bL: bH13, och syre leverans till mitokondrier i cellen från cytokrom oxidas (Cox ) redox tillstånd14. Glancy et al. visat att verksamheten i varje komplex kan bestämmas genom att mäta mitokondriella membranet potential och ämnesomsättningen15. Därför, med hjälp av optisk spektroskopi, en mängd information kan erhållas utan behov av exogena sonder eller större modifieringar av nuvarande Studiesystem. Målet med denna uppsats är att presentera en robust metod för att samla in optiska spektra av transmission i konventionella parfymerade hjärt preparat med den enda stora modifieringen som utför studier i en mörklagt miljö.
Reflektans absorptionsspektroskopi har använts framgångsrikt för att utföra Optisk spektroskopi av det parfymera hjärtat3,6,16,17,18,19 samt som hjärtat in vivo1. Reflektans-spektroskopi består av att hålla ljuset på hjärtats yta och att samla upp ljuset som sprids genom hjärtat, samt diffust och speglande reflekterat ljus. Sålunda, det insamlade ljuset i detta tillvägagångssätt är en sammansatt av flera spridningsmetoder samt vävnad kromofor absorbanserna av intresse. På grund av den rörelse och komplexa ytan av hjärtat, ljusreflektion från ytan av hjärtat är särskilt problematiskt, ändra djupet av penetration och mängden rent reflekterat ljus.
Begränsningarna av reflektans absorptionsspektroskopi som presenteras ovan löstes genom att införa en optisk kateter i vänster ventrikelhålighet, vilket möjliggör insamling av genomlysnings ljus över vänster kammare fri vägg20. Fördelarna med överföringspektroskopi för denna typ av studie uppskattades i tidiga invasiva studier av Tamura et al.9 den nuvarande implementeringen ger en mycket robust analys av intaktabsorptionsspektroskopi med När det gäller cytosolisk syresättning och mitokona redox tillstånd under en rad olika villkor21. Dessa inledande studier används en speciellt fabricerad kateter med en Powered LED på spetsen orienterade för att generera en Side-bränning mönster av vitt ljus genom hjärtmuskeln. Emellertid, den relativt stora LED tippade katetern är endast lämplig för användning på medelstora hjärtan (kanin, marsvin, etc.) och krävs anpassad tillverkning. I den aktuella studien, en metod för att använda en kommersiellt tillgänglig 200-micron Core Side-bränning optisk fiber som en ljus guide presenteras. Istället för en trådbunden lysdiod vid spetsen omdirigerar katetern med 500-Micro-spetsen ljus från en extern källa som ökar mångsidigheten i systemet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att använda en mängd olika externa ljuskällor, inklusive lasrar för tillämpningar som Raman spridning spektroskopi. För att kvantifiera dessa data presenteras en online-fullständig multikomponentspektralanalys med kända Referensspektra för att förbättra noggrannheten i den spektroskopiska bestämningen av hjärtkromoforer, som tidigare beskrivits20,22. Källkoden för denna analys kommer att tillhandahållas av författarna på begäran. Med hjälp av denna metod, information om hjärtats biokemi och mitokondriell funktion kan erhållas samtidigt med de konventionella hjärt funktionella parametrar med liten eller ingen inverkan på hjärtat preparatet. Eftersom hjärtat är kritiskt beroende av mitokondriell funktion och syre leverans, detta tekniska tillägg till det klassiska parfymera hjärt systemet kommer att avsevärt förbättra tolkningen och nyttan av denna viktiga modell av hjärt prestanda.
Protocol
Alla djur protokoll godkändes av National Heart, lung, och blod Institutet djuromsorg och användning kommittén och utförs i enlighet med de riktlinjer som beskrivs i djuromsorg och välfärd lagen (7 USC 2142 § 13).
1. isolerat parfymera hjärt system och Perfusate
Anmärkning: denna beredning är mycket lik tidigare publikationer23.
- Gör 4 liter modifierad Krebs-henseleit vätska sammansatt av (i mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCL, 1,8 CaCl2, 0,5 mgcl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 glukos, 1,0 laktat, och 10,0 Hepes.
- pH perfusaten till 7,4 på 37 ° c med NaOH och HCl.
- Filtrera parfymen genom ett pormembran på 1 μm.
- Skölj alla rör och kammare i det parfymera hjärt systemet genom att köra och dränera renat vatten genom systemet.
- Överför parfymen i tanken och syresätta med 100% O2 med bubbelflaskan samtidigt som temperaturen vid 37 ° c med hjälp av en uppvärmd cirkulerande vattenbad.
- Tillsätt 2 av 12 μm pormembran filter och Prime systemet med parfymen medan recirkulerande i Langendorff läge.
- Fäst en slangklämma på röret precis ovanför aorta kanyl och justera skruven så att aorta flödet sjunker till ca 10 mL/min.
2. kanin hjärta excision och perfusion
- Hjärt excision
- Anesthetize manliga nya Zeeland vita kaniner (ca 3 kg) via en 1,5 mL intramuskulär injektion av blandningen ketamin/Acepromazin (10:1).
- Cirka 10 – 15 minuter senare, administrera 3% isofluran via inandning för en komplett bedövnings effekt.
- Bekräfta rätt djup anestesi genom tå klämmande och sedan placera en linje i marginella örat ven för administrering av efterföljande läkemedel.
- Injicera 1 500 enheter (eller 1,5 mL 1 000 enheter/mL) heparin och låt cirkulera i 3 minuter.
- Dubbelkolla rätt djup anestesi och sedan euthanize med 6 mEq (eller 3 mL av 2 mEq/mL) av KCl.
- Snabbt öppna bröstet, lokalisera hjärtats Apex och aorta. Ta bort hjärtat genom att skära aorta så långt från hjärtat som möjligt och skära pulmonell venerna så nära lungorna som möjligt.
Anmärkning: avlägsnande av lungor i detta tidiga skede är annorlunda än tidigare publikation23 men har inte påverkat förberedelserna. - Placera hjärtat i en liten bägare av vätska (samma vätska som steg 1,3) sitter i en hink med is för transport från kirurgi till perfusion.
- Hjärt kanylering
- Kanyl och knyta aorta säkert, att se till att inte inkludera några bubblor i aorta linjen.
- Initiera flödet vid 70 mmHg perfusionstryck genom att ta bort slangklämman på aorta linjen och bibehålla detta tryck under återstoden av operationen och kärlet kanylering.
- Separera lungartären från aorta och andra fartyg och ligera Vena cavae och pulmonell vener. Ta bort fett och bindväv fortfarande närvarande.
- Kanyl lungartären att ge ett mått på koronar sinus flöde och syre spänning.
- Kassera initialt flöde ut ur hjärtat (i ca 10 minuter) under beredningen för att eliminera blod och kirurgiskt skräp. Efter denna period, återcirkulera parfymen.
3. Side-bränning fiber optisk placering
- Anslut fiberoptikkatetern till en hög effekt fiber-kopplade LED vit ljuskälla för att hjälpa visualisering samt ge ljuset för spektroskopi en gång i hjärtat.
- Skär en liten bihang av det vänstra förmaket, sätt in katetern i vänster kammare via mitralklaffen, rotera den för att uppnå en upplyst vänster kammare fri vägg.
- Placera pickup Fiber Optic direkt mittemot regionen för maximal belysning av vänster kammare på ca 1 cm från hjärtat.
- Anslut den andra änden av pickup fiber till en snabb scanning spektrometer.
4. Optisk spektroskopi
- Stäng av lamporna i experiment området för att få ett fullständigt mörker.
- Starta det anpassade programmet, införliva spektrometerdrivrutiner för att utföra datainsamling och realtidsanalys av det överförda ljuset.
Obs: en körbar version av den konsoliderade versionen av spektralförvärvet och analysprogrammet tillhandahålls som en kompletterande kodnings fil. Källkoden är tillgänglig på begäran till författarna. - Navigera genom alla prompter, välja alternativ för perfunderade hjärtspektroskopi förvärvs läge. På nästa sida anger du om insamling av tilläggsdata sker. Ange slutligen anskaffnings parametrar, inklusive placering av båda förekommer-Referensspektra och data som ska sparas.
- Ange en bandbredd på 490 – 630 nm.
- Ange en samplingsfrekvens på 2 Hz (d.v.s. 2 prov/SEK).
- Samla in en mörk ström, eller noll ljus, spektrum att korrigera för bakgrunds signalnivåer genom att stänga av ljuskällan.
- Klicka för att välja de kromofor referenser som önskas för att användas i den passande rutinen.
- På sidan Hämta data justerar du positionen för både katetern och pickup-fibern för att maximera det överförda ljuset som visas på programvaran med särskild uppmärksamhet på signalamplituden i 500 Nm-regionen, där den syrade myoglobin- absorbanserna observeras.
- Se till att det överförda ljuset inte mättas detektorn i 600 Nm-regionen.
- Se till att inga externa ljuskällor bidrar till det insamlade spektrumet genom att stänga av kateter belysningen och bekräfta att inget ljus nu upptäcks.
- Initiera datainsamlingen genom att klicka på knappen Save Spectra .
- Klicka på Ange som kontroll för att Visa differensabsorbansspektrat från framtida spektra till det aktuella "kontroll" spektrumet.
- Utför någon fysiologisk störning som önskas.
- Protokoll 1: effekten av cyanid på hjärtats prestanda och Kromophore absorption
- Stoppa recirkulerande vätska från hjärtat perfusion.
- Med hjälp av en sprutpump, injicera cyanid (2,5 till 75 mm vid pH 7) i olika hastigheter i parfymen strax före aorta kanyl att uppnå önskade koncentrationer av cyanid (0,025 till 1 mm, beräknat från aorta flödet) i flödande vätska i hjärtat medan övervakning av hjärtats funktion och optiska egenskaper.
- Stoppa cyanidsprutpumpen när effekterna på koronarflöde och hjärtfrekvens tillsammans med den optiska transmissionen genom hjärtväggen är vid steady state.
- Protokoll 2: ischemia/hypoxi
- Stoppa cyanidinfusion.
- Efter 5 minuter byta bubblande gasen från 100% syre till 100% kväve för att avlägsna syre från systemet.
- Efter ca 10 minuter, stoppa flödet för att simulera en total ischemisk/hypoxisk tillstånd.
- Protokoll 1: effekten av cyanid på hjärtats prestanda och Kromophore absorption
5. analys av spektraldata
- Kör programmet i det parfymera hjärt analys läget.
- Välj lämplig spektrometer.
- Ange data fils Sök vägen och referens Spectra-filen och välj kateter ljuskälla, som laddar det redan sparade spektrumet av kateterns ljuskälla.
- Välj Läs bin data.
- Välj ange min och Max våglängd.
- Ange bandbredden för dataanalysen som 490 – 630 nm.
- Välj återgå till huvudmenyn.
- Välj Läs referenser.
- Bekräfta Referensspektra som ska användas i analysen.
- Välj återgå till huvudmenyn.
- Välj tidspunkter i huvudmenyn.
- Välj en t0-tidspunkt som kontroll och Ställ in intervallet till 100 poäng.
- Välj en T1-tidspunkt som experiment period vid ett intervall på 100 poäng.
- Observera RAW-differensspektrumet i den genomsnittliga ABS. Spectrum -fliken.
- Välj Beräkna passningskoefficienter och klicka sedan på fliken Fit koefficienter för att observera tidsförloppet för Referensspektra Fit.
- Återgå till huvudmenyn och välj Beräkna differens ABS.
- Välj t0 och ΔT1 på alla positioner. Observera det monterade spektrumet i fönstret för differenspektrat och passande element i referensvikt fönstret.
- Upprepa proceduren om du vill jämföra andra tidspunkter i experimentet.
- Återgå till huvudmenyn.
- Spara data och analys i en kalkylbladsrapport genom att skriva in önskat namn och välja Spara data för vidare analys med andra program.
Anmärkning: om inget namn skrivs sparas rapporten med samma namn som indatafilen. Rapporten sparas i en mapp med namnet Excel-analysfiler, som finns i samma mapp som den ursprungliga indatafilen.
Representative Results
Det system som används är en av hyllan små djur perfusion hjärt system men var kraftigt modifierad för användning med en kanin hjärta. Modifikationerna var främst att öka borrhålet storleken på alla slangar för att säkerställa adekvat flöde leverans till kanin hjärta. Stor omsorg gjordes för att försäkra, vid perfusionstryck som används, flödet av det infödda per fusions systemet överskred flödet med hjärta fäst med minst 5-faldigt. 2 – 12 μm pormembran filter placerades parallellt mellan vätske pumpen och aorta förlast bubbla fälla kammare för att ta bort skräp från hjärtat.
Genomlysnings ljus från kanin hjärta
Figur 1 visar kateterns spektrum (figur 1A) och det råa spektrumet av det överförda ljuset från kaninens hjärtfria vägg (figur 1B). Dessa data avslöjar en mycket stor dämpning av ljus i den blå regionen av spektrumet, men banden av absorbans från myoglobin och mitokondriella cytokrom kan direkt observeras mellan 490 och 580 nm i insatsen. Det är viktigt i dessa studier för att säkerställa tillräckligt genomlysnings ljus upptäcks i regionen från 490 till 630 Nm för att få information om de metaboliskt lyhörd hjärtinkromoforer. Placeringen av externa och interna fibrer justeras innan du sparar data för att maximera ljusintensiteten men inte mätta detektorn i 625 nm-regionen.
Referens reduceras minus oxiderade spektra av Referenskromoforer i hjärtat.
Figur 2 visar de Referensspektra som används för att passa de differensspektra som samlats in i dessa studier. Dessa referenser inkluderar myoglobin, cytokrom AA3 (alternativt cytokrom a605 och cytokrom a607, beroende på vilken typ av störning22), cytokrom a580, cytokrom bL, cytokrom bH , cytokrom c, cytokrom c1, FAD, en absorbans representation av infallande ljus (betecknas i0, som används för att redogöra för siktat ljus, det vill, fotoner som gick igenom vävnaden utan att absorberas), och en linje (med varierande lutning och skärningspunkt för att redovisa spridningen, visas inte i figur 2). Vissa spektra är bullriga, eftersom koncentrationen av det rena referensmaterialet var mycket låg22.
Tidsförlopp för Referensspektra passar under total experiment
Figur 3 representerar tidsförloppet för ett typiskt experiment beräknat i steg 5,15 i protokollet. Detta består av en kontrollfas, följt av en cyanid injektion fas, följt av en cyanid washout, följt av en deoxygenation fas, och slutligen ischa. Förändringarna i de enskilda förekommer (myoglobin, cytokrom AA3, och cytokrom c) över tiden är plottas över tiden tillsammans med koronar flödeshastighet. Den optiska täthet ändringen av varje kromofor uppskattas, genom att multiplicera den passande koefficienten som erhålls från de linjära minsta kvadrerar rutinmässigt, och representanten som är maximal av chromophmalen (eller maximat absorbans av Said kromofor). Till exempel, för myoglobin, är passningskoefficienten för myoglobin-referensen multiplicerad med värdet av myoglobin-referenspektrat vid 580 nm. Observera den snabba syresättning av myoglobin till tillägg av cyanid matchas av ökningen i flödet men är före den signifikanta minskningen av cytokrom. Denna effekt återfås delvis med tvättningen av cyanid. Slutligen, fullständig reduktion av cytokrom och deoxygenering av myoglobin erhålls med ischa. Dessa data visar att dynamiska data om hjärtats metaboliska status lätt kan erhållas med denna metod. Placeringen av de spektra som används för differensspektra är markerade på denna tids kurs som: C baseline, CN cyanid Injection, CNW cyanid washout, H N2 hypoxi (kväve som bubblas i parfymen istället för syre), och Hi No Flow ischa (ingen parfymen flödar genom hjärtat).
Skillnaden spektrum av cyanid behandling kontra kontroll och passform av cyanid skillnaden spektrum från kanin hjärta.
För att erhålla ett differensspektrum subtrastreras två absoluta spektra. Varje absolut spektrum erhålls genom att ta ett genomsnitt av många (typiskt 100) spektra för att optimera signal-brus-förhållande. Figur 4 A representerar skillnaden spektrum av kontroll (C) och cyanid (CN) behandlade hjärtat. Med hjälp av de Referensspektra som beskrivs i figur 2beräknas Fit-spektrumet. Restspektrumet är subtraktion av passformen från rådata. Samma system används för alla efterföljande spektrala presentationer. Figur 4 B visar de spektra amplituderna för referensspektrat (visas i figur 2) som används för att passa figur 4A. Kraftig ökning av absorbans hos de flesta cytokromer observeras eftersom flödet av elektroner ner i cytokrom kedjan blockerades av cyanid i steady-state. Dessutom ökade den syrade Myoglobins absorbans när syreförbrukningen eliminerades med cyanid. Figur 4 C visar differensspektrat och passform för differenspektret från CNW och CN, vilket avslöjar en partiell återföring av cyanideffekten. Detta åstadkoms genom att välja tidspunkter i protokoll steg 5,18, flytta t0 till CNW och T1 till CN-regionen i tidsförloppet. Figur 4 D presenterar skillnaden spektrum av Hi och C, som representerar helt syrefattigt och reducerad tillstånd av Cytosol och mitokona kontra kontrollvillkoret. Återigen, detta utfördes vid protokoll steg 5,18, flytta t0 till C och T1 till HI.
Initial tidsförlopp för cyanideffekter på koronarflöde och förekommer
Figur 5 A visar ett exempel på initiering av cyanideffekten på vävnaden. Den passar för myoglobin, cytokrom en605 och cytokrom c tillsammans med koronar flödet presenteras för ett enda hjärta. Dessa tidsförlopp skapades vid protokoll steg 5,15 för cyanidexperimentet. Den individuella skillnaden jämfört med baslinjen (position 1) visas i figur 5B. Spektra genererades från motsvarande positionsnummer (1-4) på tids banan. Detta uppnåddes vid protokoll steg 5,18, där t0 var alltid i position 1, och därefter olika spektra (2 – 4) skapades genom att flytta T1 till position 2, 3 och 4 respektive. Något förvånande var observationen att flödet och myoglobin syresättning ökade innan betydande förändringar i cytokrom redox tillstånd. Initiering av förändringar i flöde och kromofores absorbans beräknades genom linjär extrapolering av den initiala förändringstakten från baslinjen. Med hjälp av denna metod, och ställa in förändringen i koronarflöde som Time Zero, ökningen av myoglobin syresättning initieras 1,71 min ± 0,39 min efter förändringen i flödet, medan cytokrom a605 och cytokrom c absorbans var nästan identiska men mycket långsammare vid 4,24 min ± 0,76 min och 4,34 min ± 0,77 min respektive (n = 8). Dessa data tyder på att cyanid slappnar vaskulär tonen24 innan en stor förändring i hjärtmuskeln metabola tillstånd inträffar. Denna effekt är sannolikt orsakad av cyanid stöter på den vaskulära glatt mus kula innan att nå effektiv dos runt hjärtats myocyter.
Uppskattningar av myoglobin syresättning i kontroll hjärtan
Användning av cyaniddata som en uppskattning av total myoglobin syresättning och ischa data för helt syrefattigt myoglobin, vi uppskattar att under kontrollförhållanden myoglobin var endast 88,2% ± 1,0% (n = 10) syresatt, i enlighet med tidigare studier20 , 21 , 25.
Figur 1 : Spektra av den optiska sidokatetern. (A) detta är ett spektrum av det avgivna ljuset från den avlägsna ljuskällan genom katetern detekteras med pickup fiber på ca 1 cm från katetern. I denna geometri, hjärtat är frånvarande och intensiteten i ljuskällan är inställd så att detektorn inte mätta. (B) sido bränning kateter sätts in i vänster kammare och det överförda ljuset från hjärtat samlas in och visas. Skäret visar 400 till 580 nm regionen expanderat, avslöjar komplexa överföring av ljus från denna region. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Referensspektra av hjärtkromoforer som används för spektral montering. Spektra samlades in via en mängd olika metoder22 och är av reducerat – oxiderat (för cytokrom) och syrefattigt – syresatt (för myoglobin). För I0, är spektrumet i figur 1A omvandlas helt enkelt till en absorbans term för att göra referensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flödes-och optiska förändringar över tid. Den optiska täthet ändringen (δod) av varje kromofor är enkelt den monterade individen chromophores Spectrum på dess maximum absorbans. De maximala absorbansfrekvenserna var som tidigare beskrivits20,26. Den presenterade tid kursen är för ett experiment, som visar en baslinje, följt av cyanid injektion (0,10 mm vid maximalt vätska flöde), cyanid Wash-out, kväve hypoxi utförs genom att ersätta syre med kväve, och sedan slutföra ischit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Monterade differensspektra av olika förhållanden. A spektrum av cyanidinjektion minus baslinjen. Den Fit spektrum erhålls från den minsta kvadratiska rutin är också plottas. Restspektrumet är skillnaden mellan RAW-och Fit Spectra. B) de Referensspektra som används för att skapa den passform som presenteras i figur 4A. Programmet skalar referenserna i figur 2 till deras relativa bidrag i det aktuella skillnads spektrumet. (C) samma som i A, men visar skillnaden spektrum av blekt kontra cyanid injektion. (D) samma som i A, men visar skillnaden spektrum av ischa kontra baseline. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Hög temporal upplösning av cyanidinfusion effekt på utvalda cytokrom, myoglobin och hjärt flöde. A ) tidsförlopp för hjärtats flöde, deoxymyoglobin, reducerad cytokrom A605, och reducerad cytokrom c. Siffrorna avser placeringen av de spektra som tagits i förhållande till baslinjen i figur 5B. (B) differensspektra för de 4 positionerna märkta i figur 5A kontra kontroll (position 1). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den isolerade retrograd eller arbetar parfymera hjärtat förberedelse är en stöttepelare i studiet av hjärtfysiologi samt preklinisk undersökning av tekniker och droger på hjärtat. Nyckeln till dess användning har varit lätt att förbereda, robusta funktionella egenskaper och kontroll av experimentella parametrar samt förmågan att mäta många funktionella parametrar i det slående hjärtat. Optisk absorbansspektroskopi ger insikt i vävnadsyresättning samt mitokonskens metaboliska aktiviteter. Optisk spektroskopi har i första hand genomförts i de isolerade parfymera hjärt studierna i reflektans läge som är svåra att tolka på grund av rörelse och lätta spridnings komplikationer.
Vi har infört ventrikel vägg transmission Optisk spektroskopi (VWTOS) för att ge en robust metod för övervakning av kardiell vävnad metaboliska chromophores. I en tidigare publikation, vi visade att en LED hårdkodade till spetsen av koaxialkabeln20 gör en unik intrakardiell Side-bränning ljuskälla som kan användas för vwtos parfymera hjärtan. Den Side-bränning hänvisar till projektionen av ljus vinkelrätt mot den långa axeln av katetern, perfekt för belysning av ventrikeln fri vägg. LED-katetern var liten nog att inte påverka hjärtfunktionen men krävde specialiserad tillverkning i laboratoriet. Den aktuella studien presenterar användningen av en 500 micron kommersiell Side-bränning kateter som kan kopplas till någon ljuskälla kompatibel med fiberoptik. Dessa Side-bränning optiska katetrar var kommersiellt utvecklad för laser ablation vinkelrätt mot den långa axeln av fiber. Naturligtvis använder vi ljusstyrka mycket lägre än vad som krävs för photoablation. Mindre fibrer är tillgängliga för användning på mindre preparat såsom parfymerad mus hjärta27. Detta fiberoptiska system som tillräcklig belysning genom hjärtväggen i våglängdsområdet där hjärtats förekommer absorbera (450-630 nm). Med hjälp av en pickup fiberoptik på utsidan av hjärtat, kan absorbans av myoglobin och mitokondierna cytokrom övervakas med utmärkt tidsmässiga och spektrala upplösning (se figur 5). Den Side-bränning fiberoptisk strategi har flera fördelar jämfört med LED-katetern för VWTOS, inklusive en mycket mindre tvärsnitts profil av katetern som minimerar effekten av katetern på hjärtat, mer flexibel minska påverkan på hjärtklaffen och ventrikeln prestanda, inga elektriska anslutningar som kan kort ut i saltlösning perfusate, och slutligen en kateter som använder en extern ljuskälla som ökar flexibiliteten i ljuskälla val för VWTOS.
På grund av den starka absorbans av hjärtat under 490 nm, är det svårt att generera mycket information om Soret band av cytokrom i regionen 410-445 nm eller NADH vid 340 nm. Sålunda, den breda absorbans av FAD vid 450 nm är den lägsta frekvensen absorbans som observeras, även om hela absorptionen toppen av denna förekommer inte samplas. Använda VWTOS signal-brus-förhållande är mycket hög eftersom hela väggen samplas i motsats till ytan reflektion spektroskopi, vanligen används20, som bara prover ytan av hjärtat med många spridnings frågor. VWTOS provtagning hela hjärtväggen är mer jämförbar med kärnmagnetisk resonans spektroskopi (NMRS) åtgärder av många hjärtmetaboliter såsom 31P detekterat adenosintrifosfat och kreatinfosfat28, 13C detekterad märkta metaboliter29,30 inklusive hyperpolariserade etiketter31,32och 1H detekterade metaboliter33. Eftersom VWTOS kan utföras med hjälp av icke-magnetiska enheter, är det helt möjligt att NMR och VWTOS kan genomföras samtidigt. Vwtos är inte begränsat till endogena förekommer och kan användas för att övervaka absorption från optiska sonder för pH, ca2 +, och plasmamembran potential.
Vi använder 2 Hz (dvs. 2 prover/SEK) som ger utmärkt enda spektrum signal till brus. Även om högre samplingsfrekvenser kan uppnås som tillåter hjärt cykel analys, tidigare studier har visat att det finns ingen Beat att slå variation i kromofor absorbans, så ingen ansträngning för att selektivt samla in ljus som en funktion av hjärt cykeln var Made34. På grund av VWTOS geometri är detektering av ljus mindre beroende av vävnads rörelse än reflektions metoder, eftersom de komplexa ytspridnings händelserna elimineras. Vi finner att svår rörelse kan störa dessa åtgärder, men realtid spektralanalys snabbt avslöjar spektralöver gångar som är oförenliga med vävnad kromofor övergångar. Återigen, detta sker endast när hjärtat rör sig grovt bort från att samla fiber dramatiskt minska mängden insamlade genomlysnings ljus.
Vwtos data analyseras med hjälp av fullständig spektralmontering rutin baserad på ett referens bibliotek av spektra av hjärtats Kromoforer och spektrumet av ljuskällan som tidigare beskrivits20,22,27, 35 med en enkel linjär minsta kvadratmetoden. Detta spektrala monterings förfarande kompenserade för överlappande absorbans spektrum och förlitar sig inte på "isobestic" våglängder. Denna fullständiga spektrum analys eliminerar artefakter i samband med gemensamma Dual beam (dvs. två våglängd) analys1,3,6 som har visat sig vara problematiskt20. Den extra fördelen med full spektralanalys är generering av en godhet av passform från RESIDUALS, inte finns i Dual beam protokoll.
I denna studie fokuserade vi på effekten av cyanid på de optiska egenskaperna hos hjärtat. Som cyanid blockerar cytokrom oxidas, det hämmar syreförbrukning och i huvudsak resulterar i en nettominskning av alla cytokrom som elektronerna tillbaka upp i cytokrom kedjan. Dock är membranet potential tydligen fortfarande hög, eftersom redox förändringar i bL och bH är mycket små jämfört med cytokrom c13. Med upphörande av syreförbrukning, syre spänningen i vävnaden bör närma sig parfymen och vi noterade en tidig ökning av oxygenerade myoglobin med cyanid förenligt med uppfattningen att saltlösning parfymerat hjärta, även i retrograd perfusion lägen, är inte helt syresätta myoglobin i Cytosol19,20,21,36. Jämföra den maximala effekten av cyanid på syresatt myoglobin med helt deoxygenerade spektrum som erhållits med ischemi avslöjar en myoglobin syresättning av endast ca 88%, i överensstämmelse med tidigare studier.
Det är viktigt att notera i denna studie att cyanideffekterna på myoglobin syresättning och cytokrom reduktion var temporally lösta. Det är förvånande att effekterna av cyanid först observerades på koronarflöde och myoglobin innan stora förändringar i hjärtats cytokrom redox tillstånd observerades. Den tidiga markant ökning av flödet tyder på att en effekt på arteriell glatta muskler24,37 kan förekomma innan brutto metabola effekter i hjärtat celler observeras. Ökningen av flödet, potentiellt med en blygsam cyanid inducerade minskning av andning, sannolikt resulterar i den omedelbara ökningen av oxygenerade myoglobin orsakas av ökningen av syre leverans. Med spridningen av cyanidhämning till myocyterna, en ytterligare ökning av koronarflöde observeras (se regionen märkt 3 i figur 5a), troligen driven av många metabola faktorer38. Den stora tidiga effekten av cyanid på flödet tyder på att metabolismen av den vaskulära glatta muskeln kan vara mer potent i att förändra vaskulär ton än metabolismen av myocyter. Dessa data stöder den väletablerade uppfattningen att myoglobin har en mycket lägre affinitet för syre än COX, även i intakt hjärta, som myoglobin syresättning inträffade långt före förändringar i mitokonsamen redox tillstånd (figur 5). Denna höga nivå av deoxygenerade myoglobin under kontrollförhållanden är förenlig med tidigare studier som tyder på att den isolerade saltlösning perfunderade hjärtat kan vara delvis hypoxisk även under kontrollvillkor9,19, 20,21,27,36, understryker vikten av att övervaka hjärtvävnad syresättning när du använder denna viktiga modell i hjärtats fysiologi.
Vi presenterar här de experimentella detaljerna för att bedriva transmissionabsorptionsspektroskopi på det isolerade parfymera hjärtat. Vi har framgångsrikt anpassat denna teknik för användning på hjärtan från kanin till musen genom att använda en tunn Side-bränning intrakardiell optisk fiber. Utnyttja toppmoderna full spektrala montering rutiner, den komplexa optiska interaktionen av hjärtats förekommer kan lätt extraheras ger, en nära realtid mått av kritiska element av myokardmetabolism samtidigt med konventionella funktionella åtgärder.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes fullt ut av NHLBI interna program (Project # ZIA HL00460131).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
| BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
| BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
| Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
| Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
| Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
| Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
| Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
| High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
| Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
| Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
| Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
| PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
| Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
| Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
| Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
| Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
| Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
| Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
| Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |
References
- Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 2 Pt 2 683-697 (1999).
- Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
- Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
- Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
- Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 6 Pt 2 2561-2568 (1995).
- Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
- Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
- Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
- Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, Pt 14 2180-2189 (2015).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
- Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
- Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
- Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
- Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
- Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
- Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
- Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
- Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).
- Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
- Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 1 Pt 2 160-168 (1995).
- Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
- Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
- Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
- Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
- Paul, R. J. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. , American Physiological Society. 201-252 (1980).
- Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).
