Immobilisering av Live Caenorhabditis elegans individer med en Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic brikke med vann oppbevaring

Summary

En rekke immobilisering metoder er etablert for å tillate den målrettede bestråling av live Caenorhabditis elegans personer som bruker en nylig utviklet ultra-spinkle polydimethylsiloxane microfluidic chip med vann oppbevaring. Denne romanen på prosessoren immobilisering er også tilstrekkelig for imaging observasjoner. Detaljert behandling og programmet eksempler av brikken er forklart.

Abstract

Stråling er mye brukt for biologiske programmer og ion-beam avl, og blant disse metodene, microbeam bestråling representerer en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer. Dette dokumentet beskriver en rekke på prosessoren immobilisering metoder utviklet for målrettet microbeam bestråling av levende individer av Caenorhabditis elegans. Spesielt behandling av polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic brikker som vi utviklet for å nakkens C. elegans enkeltpersoner uten behov for anestesi er forklart i detalj. Denne brikken, referert til som en orm ark, er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides, og elastisitet tillater dyr å være innhyllet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene. Videre ormen arket viser vannretensjon og tillater C. elegans individer utsettes for mikroskopiske observasjon i lange perioder under bor forhold. I tillegg er arket bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner gjennom arket omsluttende dyrene, slik at ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Utvalg av dekselet filmene brukes for omsluttende dyrene er svært viktig for vellykket langvarig immobilisering, vi gjennomført valg av egnet dekke filmene og viste en anbefalt blant noen filmer. Eksempel søknad av chip introdusert vi tenkelig observasjon av muskel aktiviteter av dyr omsluttende mikrovæskekanalen orm arket, i tillegg til microbeam-bestråling. Disse eksemplene viser at ormen arkene har sterkt utvidet mulighetene for biologiske forsøk.

Introduction

Stråling, inkludert røntgenstråler, gammastråling og tunge-ion stråle, er mye brukt for biologiske applikasjoner som kreftdiagnostikk og behandling og ion-beam avl. Tallrike studier og teknologiske er for tiden fokusere på effekter av stråling^1,2,3. Microbeam bestråling er en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer⁴. Den Takasaki avansert stråling Research Institute av nasjonale institutter for Quantum og radiologiske vitenskap og teknologi (QST-Takasaki) har utviklet en teknologien å irradiate enkeltceller under mikroskopisk observasjon med tunge-ion microbeams⁵, og har etablert metoder for å aktivere målrettet microbeam bestråling av flere modell dyr, som Rundormer Caenorhabditis elegans^4,6, silkeormer⁷og Oryzias latipes (japansk medaka)⁸. Målrettet microbeam bestråling av Rundormer C. elegans kan effektiv knockdown av bestemte områder, for eksempel nerve ringen i regionen hodet, dermed bidra til å identifisere roller av disse systemene i prosesser som bevegelse.

En metode for på prosessoren immobilisering av C. elegans individer uten behov for anestesi er utviklet for å tillate microbeam bestråling⁴. I tillegg for å forbedre microfluidic brikker i den tidligere studien⁴, har vi nylig utviklet vannbløtbart, ion-penetrable, polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips, kalles ormen ark (se Tabell for materiale), for immobilizing C. elegans enkeltpersoner⁹. Dette omfatter ultratynne myk ark (tykkelse = 300 µm; bredde = 15 mm; lengde = 15 mm) med flere (20 eller 25) rett microfluidic kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm eller 50 µm; lengde = 8 mm) på overflaten (figur 1A-D). Microfluidic kanaler er åpne og la flere dyr å stå i dem samtidig (figur 1E). Arkene er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides (med ~ 10%, figur 1F) og elastisitet gjør dyr til være omsluttet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene.

De gjør ikke vondt ormer når de står eller når de er samlet. Videre arkene er laget av PDMS, som er i hovedsak hydrofobe, men vannretensjon kan oppnås ved å formidle hydrophilicity til materialet. Vannretensjon og tykkelse er gunstige egenskaper av ormen ark. Vannretensjon kapasiteten forhindrer dehydrering av dyrene etter langvarig immobilisering og gjør det mulig langsiktige observasjoner utføres.

Dessuten, som beskrevet tidligere⁹, er arkene bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner (med en rekke ca 1 mm i vann) gjennom arket omsluttende dyrene. Dette gir ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Videre ormen arkene kan gjenbrukes og er dermed økonomisk. Med metoden konvensjonelle injeksjon dyrene vedlagt er noen ganger død og de kan ikke tas ut av kanalen. egg kan også tette kanalene. Dette gjør chip ubrukelig. Chips er derfor i utgangspunktet disponibel og det kost-nytte-forholdet er dårlig.

I dagens papir, vi beskrive i detalj en rekke metoder for på prosessoren immobilisering av live C. elegans personer som bruker ormen ark. Gjennom bevegelse analyser av dyr 3t etter på prosessoren immobilisering vurdert vi egnet dekke filmen. I tillegg viste vi eksempler på på prosessoren immobiliseringsløsninger til både tenkelig observasjoner og microbeam bestråling.

Protocol

1. stammer og vedlikehold Velg en passende stamme av C. elegans og Escherichia coli (mat) avhengig av formålet av eksperimentet.Merk: I dagens papir, vill-type N210C. elegans (figur 2A) er vanligvis brukt, og HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 – 3 utr, unc-119(+)] V11 er bare ansatt for imaging analysen. E. coli OP50 ble brukt som mat for C. elegans. Noen …

Representative Results

Aktive C. elegans enkeltpersoner kan bli immobilisert vellykket bruker en ultratynn og vannbløtbart PDMS, microfluidic chip (orm ark). Vi undersøkt hensiktsmessigheten av forskjellige cover filmer for tetting ormen arket, som beskrevet i del 3-protokollen. For å evaluere tetting effekten av dekselet filmene, vi bestemt motilitet i dyr 3t etter på prosessoren immobilisering bruke cover glass (tykkelse: 130-170 µm), PET film (tykkelse: 125 µm), og PS film (tykkelse: ~ 130 µm…

Discussion

På prosessoren immobilisering C. elegans under bor forhold med en vannbløtbart PDMS microfluidic brikke muliggjør effektiv målrettet microbeam bestråling av flere dyr. Enkel håndtering og funksjoner for å hindre tørking gjør dette systemet egnet for programmer ikke bare i microbeam bestråling, men også i flere atferdsmessige analyser. Disse ormen ark har allerede blitt kommersialisert og oppnås enkelt. Konvensjonelle microfluidic chips, for eksempel olfactory brikker, er forbundet med problemer inklu…

Materials

C. elegans wild-type strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	N2	Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	CB4845	C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape
C. elegans transgenic strain HBR4	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	HBR4	The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	OP50	E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM17-0001	Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper
Worm Sheet 60	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001	Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C.
Worm Sheet 50	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0002	Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C.
MICRO COVER GLASS	MATSUNAMI GLASS IND. LTD.	C030401	Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001/ BCM18-0002	Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror	TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan	Lumirror T60 (t 125 µm)	PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-060	Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-035	Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q	Merck, France		Ultrapure water
Kimwipe S-200	Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan	62020	120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick	Genesee Scientific Corporation, CA, USA)	59-AWP	Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX16	Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX2-ILLB	This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO1×PF	NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO2XPFC	NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.