Summary
ההורמון מופרש על ידי קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות החולדה הראשית תאי בלוטת יותרת הכליה. זה יכול להיות פלטפורמה במבחנה טוב עבור חוקרים את המנגנונים מהתרכובת עניין steroidogenesis בלוטת יותרת הכליה, ביוסינטזה השומנים.
Abstract
ההורמון מפריש קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. השיטה המתוארת כאן היא ההליך העיקרי עכברוש בתרבית תאים בלוטת יותרת הכליה, קשורים מבחני פונקציונלי (immunofluorescence צביעת של השומנים droplet הדם, כמו גם ניתוח corticosterone). בניגוד מודל ויוו, הווריאציות של interexperiments בתרבויות טפט יותרת הכליה הוא פחות ואת התנאי ניסיוני הוא קל לשלוט בהם. חוץ מזה, המקור של חולדות יציב גם יותר חיות אחרות, כמו שור אלה. ישנם גם שורות תאים אנושיים יותרת הכליה מספר (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, וכו ') יכול לשמש במחקרים בלוטת יותרת הכליה. עם זאת, ייצור הסטרואידים שורות אלה עדיין תושפע גורמים רבים, אשר כוללים מספר הרבה בסרום, מעבר מספר, חשבונאי/הפסד של גנים שונים, וכו '. פרט חסר 17α-hydroxylase, התרבות העיקרי של תאים adrenocortical חולדה היא טכניקה יותר טוב ונוח יותר עבור לימודי פיזיולוגיה של הכליה. לסיכום, תרבויות האדרנל החולדה הראשית יכולה להיות פלטפורמה במבחנה טוב לחוקרים לחקור את המנגנונים מהתרכובת של עניין במערכת בלוטת יותרת הכליה.
Introduction
המערכת האנדוקרינית אחראי על ויסות פעילות פיזיולוגית והומאוסטזיס1. יותרת הכליה ממוקם בקוטב הגולגולת של הכליות הן אחד האיברים האנדוקרינית הגדולות אשר מפרישים mineralocorticoids, glucocorticoids ו-2,אנדרוגן3. ישנם שני חלקים ברורים של בלוטת יותרת הכליה: קליפת המוח, לשד. קליפת יותרת הכליה מורכבת משלוש שכבות: את glomerulosa החיצוני של fasciculata ביניים, את reticularis הפנימי3. Glomerulosa zona הוא אתר מפרישים המקורי של אלדוסטרון, מינרלוקורטיקואידים, אשר מסייע להתפתחות reabsorbing יון נתרן ומים של הכליות3. Fasciculata zona מייצרת בעיקר לרמת הבסיס glucocorticoids נורמלי בתנאים פיזיולוגיים3. קורטיקוסטרואידים בחולדות, קורטיזול אצל בני אדם לפעול כדי לסייע לגוף להתמודד עם הלחץ על ידי ויסות גלוקוז בדם3. במידה מסוימת, הם יכולים לעכב תגובות דלקתיות, לווסת את המערכת החיסונית4,5. בניגוד יונקים אחרים, עכברים וחולדות אין reticularis zona פונקציונלי בשל היעדר ביטוי 17α-hydroxylase ב6,7בלוטת יותרת הכליה. לפיכך, האנדרנלין של עכברים וחולדות אין ההפרשה של סטרואידים C-19 יותרת הכליה (קורטיזול ואנדרוגנים האדרנל).
ראשי בתרבית תאים adrenocortical הוכחו להיות שימושי עבור חוקרים מנגנוני שליטה על פיזיולוגיה של הכליה8. כמו רקמות אחרות שחלת בקר, כל אזור בלוטת יותרת הכליה מסנתז שלה סטרואידים כולסטרול חינם9. על גירוי הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (זינק), רמת הכולסטרול חינם הוא שוחרר מן פירוק השומנים טיפות, לפיכך, מגביר את ייצור הסטרואידים ב- fasciculata ו- reticularis10.
קבוצות רבות ניסו ליצור שורות תאים יציבה מן adrenocortical קרצינומות. עם זאת, מספר חששות מוגבלת השימוש של שורות תאים adrenocortical כמו דגמים חוץ גופית8. התגובות סטרואידים של שורות תאים עשויים להיות שונים בין הקטעים, מספר גדול של סרום איכות סרום, וכו '. יתר על כן, שורות תאים בלוטת יותרת הכליה מסחרי (Y1 ו- SW13) לא מפרישים corticosterone, וכך קשה יותר ללמוד האדרנל steroidogenesis8. באמצעות האדרנלים שור, הרכיבה כפי שמחוץ מודלים עשוי להיות בחירה טובה, אף-על-פי רקמות מן בשווקים אלה עשוי לטשטש כמה סיכונים לא ידועים. בהשוואה אליהם, ניהול עכברוש יותרת הכליה קל והוא המקור יחסית יותר יציבה ונטולת הפתוגן. יחדיו, נוכח השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לחקור את מנגנון הקשור של סינתזה corticosterone בתאי בלוטת יותרת הכליה fasciculata חולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה של המשחקים העולמיים האוניברסיטה הרפואית.
1. ניתוח ניסיוני
- להקריב את החולדות SD נקבה/זכר בוגר (8-12 בת שבוע) על ידי CO2 המתת חסד.
- החלת 70% אתנול ולתת לו להיספג לתוך העור ולאחר מכן לנגב את העור עם נייר טישו.
- לשים את החולדה על צלחת פלסטיק נקי במצב פרקדן.
- להרים את העור עם מלקחיים מעוקל "חיצוניים" בקו האמצע ולבצע ניתוח בוטה על-ידי יצירת צורה "Y" (מן הרמה של הירך לזווית subcostal).
- לשטוף מספריים עם 70% אתנול, ואז לחתוך את השריר, גם יצירת צורה "Y".
-
למצוא את בלוטת יותרת הכליה השמאלית מאחורי הקיבה.
הערה: האדרנל נכון יכול להימצא עמוק מאחורי הכבד.- השתמש זוג מלקחיים להרים את הבטן או הכבד ולבודד ריגושים עם מלקחיים מעוקל עוד.
- לאחר הצבת בלוטות האדרנל לתוך תבשיל סטרילי, הסר בזהירות את הקפסולה יותרת הכליה עם מלקחיים משובחים.
- עם זוג מספריים עדין, לחתוך את האנדרנלין לחתיכות קטנות עם קצת קצת Dulbecco ללא סרום המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) / F-12 בינונית.
-
להכין שלוש pipets פסטר שונים בגודל נקבובית ולהשתמש pipet הראשון את פסטר לרוקן את כל החלקים האדרנל לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכילות בינוני עם collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- בעדינות triturate הרקמה חתיכות 10 x. להשתמש בשאר pipets, חזור על השלבים שלעיל עד כל החלקים מצטמצמות.
הערה: גודל הנקבוביות שונים pipets פסטר יכולים להיווצר על-ידי חימום אותם באש. Pipet הראשון הוא הגודל המקורי (בערך 1 מ מ), גודל הנקבוביות השני הוא כ- 0.8 מ מ, pipet פסטר שלישית כ 0.5 מ מ. במהלך העיכול, החלקים של יותרת הכליה יהיו קטנים. לכן, באמצעות ההליך מכני, ריגושים יכול להיות מתעכל יותר מוגמר. דגירה הצינור באמבט מים (ב 37 מעלות צלזיוס), לנער את זה כל 5 דקות, 4 x סה כ.
- בעדינות triturate הרקמה חתיכות 10 x. להשתמש בשאר pipets, חזור על השלבים שלעיל עד כל החלקים מצטמצמות.
- לאחר הדגירה 20 דקות, להוסיף בינוני צח וקריר (sixfold נפח; לדוגמה, 5 מ של רקמות + 25 מיליליטר מגניב בינוני DMEM/F-12) המכילה 2.5% עוברית שור סרום (FBS) ו 5% סרום סוס כדי להפסיק את האפקט אנזים.
- לאסוף את כדורי התא על ידי צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 10 דקות.
- הוסף אמצעי אחסון המתאים של מדיום להשעות את התאים.
הערה: כל בלוטת יכול לעשות כ ~ 3 x 105 ~ 4 x 105 תאים. - צלחת את התאים הרצויים צלחות או מנות עם מדיום הגידול (1:1 [וי/v] תערובת של בינוני F-12 של DMEM וחזיר, בתוספת פניצילין HEPES ו 1% 25 מ מ, סטרפטומיצין) לילה (יום 0) ב 37 מעלות צלזיוס, בסביבה humidified של 95% אוויר ו-5% CO2.
הערה: בדרך כלל, אנחנו צלחת בתאים. ובכן 24 צלחות (ארבע בלוטות צלחת) עבור וזמינותו corticosterone, 35 מ"מ מנות (אחד בלוטת/כ 1-2 מנות) המערבי כתם ניתוח. - לשטוף היטב את התאים 2 x DMEM/F-12 ללא סרום חמים בינונית (יום 1). החלף את מדיום הגידול החדש.
- לשמור על התאים ב 37 ° C בסביבת humidified של 95% אוויר ו-5% CO2 עד ליום 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המתואר כאן, ראשי בתרבית תאי בלוטת יותרת הכליה יכול להבחין במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1 א'). כדי נוספת לאשר כי השלפוחיות המוגלתיות בתוך הציטופלסמה הם השומנים טיפות, ההכתמה immunofluorescence של אדיפוז הקשורות בידול חלבון (ADRP) יכול להתנהל על תרבויות היום-3 (איור 1B). התאים גדלו על coverslips זכוכית דקה. התאים היו שלוש פעמים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) שטופים קבוע עם 4% paraformaldehyde. לאחר כביסה שלוש פעמים עם PBS, התאים נחסמו, permeabilized עם 0.1% טריטון X-100 בחלב דל שומן 5%. הנוגדן ADRP העיקרי היה מדולל (1:50) בחלב דל שומן 5%, נדגרה בן לילה. אחרי שלוש פעמים של PBS כביסה, התאים היו מודגרות עם עז אנטי-ארנב 488 עבור חיל הים אלקסה משני נוגדנים (1: 100). לאחר חזרה על השלבים כביסה, התאים רכוב להאריך Antifade זהב הרכבה בינונית, נבחנו תחת המיקרוסקופ זריחה. יתר על כן, היכולת לייצר הורמונים של תאי הכליה עכברוש יכול להיקבע על ידי corticosterone וזמינותו. גירוי של זינק על תאי הכליה עכברוש יכול לשמש פקד חיובי (איור 1C). התקשורת שנאספו מדולל, לבדיקה עבור תוכן corticosterone, על-פי ההליך המתואר על-ידי חן ואח '11.
איור 1: אפיון תאי הכליה ואת התגובה corticosterone לטיפול זינק. (א) שלב חדות תמונה של היום-3 ראשי עכברוש בתרבית תאים בלוטת יותרת הכליה. (B) ADRP מכתים מוצג. (ג) יום-3 עכברוש בתרבית תאי הכליה טופלו עם זינק (1 pM ו- 1 ננומטר) במשך 6 שעות. התקשורת נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש. רמות corticosterone נמדדו על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בלוטת יותרת הכליה לשחק תפקיד מפתח הסתגלות סביבתית3. שבו קליפת יותרת הכליה מפרישה את ההורמון יכול לווסת ולהתאים פונקציות פיזיולוגיים והומאוסטזיס3. המודל ויוו משקף את ההשפעות הפיזיולוגיות מאוד בגוף. עם זאת, זה עדיין מושפע על ידי גורמים מורכבים רבים, גרימת תופעות לא יציב בניסויים. לעומת זאת, המודל תא במבחנה יש יתרונות שהופכים אותו לילדם בבעלי חיים. ראשית, התנאי סביבתי הוא קל לשלוט במערכת במבחנה. הורמונים נוטים להיות מושפעים על ידי גירוי כלשהו. ניסויים in vivo בדרך כלל תוצאה של תגובה לא ספציפית כי בעלי חיים נוטים מצוקה. שנית, החומרים אינם קל לעקוב אחר בגוף, אך עלולים במערכת בתרבית. שלישית, המערכת במבחנה מפחית את השונויות בין ניסוי עצמאית. דו חות מדעיים רבים מראים באמצעי התקשורת התרבות של תאים adrenocortical המכיל 10% – 20% FBS12,13,14,15, ואילו הפרוטוקול המובאת כאן משתמש 5% FBS ו- 2.5% הסוס סרום לשמור צמיחה של תאי הכליה עד שבוע.
Steroidogenesis התחיל מ המחשוף של כולסטרול חינם על ידי ציטוכרום P450 מחשוף צד-שרשרת אנזימים. כפי שמוצג באיור 1 א'ב', תאי הכליה התערוכה רבים, גדלים שונים של טיפות השומנים, מציע את זה הוא כלי טוב עבור החקירה בביולוגיה ביוסינטזה ו/או השומנים הסטרואידים (תאים fasciculata יש השומנים גדול יותר בולטים 1,טיפות)3. ADRP, הידוע גם בשם perilipin 2, הוא ליפיד droplet משטח חלבון אשר מסייע האחסון של ליפידים נייטרלי בתוך ה-טיפות השומנים16. עקב adrenocortical תאים מפגין כמות השומנים, את ADRP (או השומנים droplet משטח לחלבונים אחרים, כמו perilipin) ניתן להשתמש כדי לבחון אם הסוכנים שנבדקו משפיע הורמון סינתזה16.
הצמיחה ואת תפקוד בלוטת יותרת הכליה נשלטים בחוזקה על ידי ההיפותלמוס הורמון corticotropic משחרר הורמון יותרת המוח זינק, neuropeptides, נוירוטרנסמיטרים, גורמי גדילה, וכו17. איור 1C מגלה כי ההפקה corticosterone היה משמעותי המושרה על ידי טיפול זינק באופן תלוי-ריכוז. יתר על כן, זינק ב 01:00, 1 ננומטר המרצת ייצור corticosterone בערך 30 - ו 70-fold, בהתאמה. זה הוכח, כי היום-3 תאים בלוטת יותרת הכליה העיקרי בתרבית התערוכה מענה טוב יותר זינק גירוי15. זהו גם הסיבה למה היום-3 התרבות השתמשו במחקר הנוכחי. בנוסף, מידת corticosterone מאת אליסה קיט הוא גם כלי פשוט וקל למחקר. לכן, תאי הכליה עכברוש בתרבית העיקרי לא רק לספק פלטפורמת לימוד steroidogenesis האדרנל אך עשוי לחול גם לחקירת במחלות דלקתיות.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול הנוכחי הם העיכול של ריגושים ושליטה של זיהום. לכן, פקד של זמן עיכול, פיסי היניקה, תצפית של רמת עיכול רקמת חשובים מאוד עבור הישרדות cell. יתר על כן, השיטה של חיתוך העור ובידוד ריגושים הוא גם משמעותי. תמיד לטבול כל הכלים ב- 70% אתנול למנוע כל זיהום על ידי פרוות בעלי חיים. על מנת לקבל יותר תאים, תדירות השאיבה צריכה להיות נשלטת פחות מ 10 פעמים במהלך כל שאיבה. בנוסף, אם התנאי של הרקמות לא טוב עוד יותר שלבים, הדגירה, המכילות collagenase בינוני לא צריך להיות יותר מ 30 דקות.
כי בלוטת יותרת הכליה של חולדות קטנות, השכבה glomerulosa ייתכן יאבד במהלך הפילינג של הקפסולה בלוטת יותרת הכליה. זה הוכח, ש-decapsulation הזה הביא ההסרה של הקפסולה רקמת חיבור, כולו zona glomerulosa18. בלוטת יותרת הכליה של חולדות זכרים קטנים מאלה של חולדות נקבות. בנוסף, טיפות השומנים להיראות גדול יותר ב- 11 עכברים נשית או גברית בת שבוע6. לגבי תאי זמין, חולדות נקבות עשוי להיות בחירה טובה עבור ניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של טייוואן המועצה הלאומית למדע (NSC102-2320-B-037-008-MY3) ואת הלאומית צ'נג קונג אוניברסיטת בית החולים במענק מחקר (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
