Summary
La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.
Abstract
La hormona que segrega la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. El método descrito aquí es el procedimiento de células suprarrenales primarios de rata cultivadas y ensayos funcionales relacionados (tinción de inmunofluorescencia de proteína superficial de la gota de lípidos, así como análisis de corticosterona). A diferencia de un modelo in vivo, la variación del interexperiments en cultivos monocapa suprarrenal es inferior y la condición experimental es fácil de controlar. Además, la fuente de las ratas también es más estable que otros animales, como bovinos. También hay varias líneas de células suprarrenales humanas (NCI-aviones usados H295 NCI-H295R, SW13, etc.) que pueden utilizarse en estudios suprarrenales. Sin embargo, la producción de esteroides de estas líneas todavía se verá afectada por numerosos factores, que incluyen el número de lote de suero, pasaje número, mutante, pérdida de genes distintos, etcetera. Excepción de falta de 17α-hidroxilasa, el cultivo primario de células adrenocorticales de rata es una técnica mejor y más conveniente para el estudio de fisiología suprarrenal. En Resumen, culturas suprarrenal de la rata principal podrían ser una buena plataforma in vitro por investigadores investigar los mecanismos del reactivo de interés en el sistema de la glándula suprarrenal.
Introduction
El sistema endocrino es responsable de la regulación de actividades fisiológicas y homeostasis1. Glándulas suprarrenales, situadas en el polo craneal de los riñones son uno de los principales órganos endocrinos que secretan mineralocorticoides, glucocorticoides y andrógenos2,3. Hay dos partes distintas de la glándula suprarrenal: la corteza y la médula. La corteza suprarrenal se compone de tres capas: la glomerulosa externa, fasciculada intermedia y los reticularis interno3. La zona glomerular es el sitio original de la secreción de la aldosterona, un mineralocorticoide, que ayuda en la reabsorción de iones de sodio y agua en los riñones3. La zona fasciculada produce principalmente un nivel basal de glucocorticoides en condiciones fisiológicas normales3. Corticosteroides en roedores y cortisol en los seres humanos actúan para ayudar al cuerpo para lidiar con el estrés mediante la regulación de la glucosa de sangre3. Hasta cierto punto, pueden inhibir las respuestas inflamatorias y regulan el sistema inmune4,5. A diferencia de otros mamíferos, ratones y ratas no tienen un reticularis de zona funcional debido a la falta de una expresión de 17α-hidroxilasa en la glándula suprarrenal6,7. Así, las glándulas suprarrenales de las ratas y ratones están desprovistas de la secreción de esteroides de C-19 suprarrenales (cortisol y andrógenos suprarrenales).
Primario las células adrenocorticales cultivadas han demostrado ser útiles para investigar los mecanismos que controlan la fisiología suprarrenal8. Como otros tejidos steroidogenic, cada zona suprarrenal sintetiza sus esteroides colesterol libre9. Sobre el estímulo de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), el colesterol libre se libera de gotitas de lípidos de ruptura y, por lo tanto, mejora la producción de esteroides en el fasciculata y reticularis10.
Muchos grupos han tratado de establecer líneas celulares estables de carcinomas adrenocorticales. Sin embargo, varios problemas han limitado el uso de líneas de células adrenocorticales como en vitro modelos8. Las respuestas de esteroides de las líneas celulares pueden diferir entre pasajes, el número de lote de suero y la calidad del suero, etcetera. Por otra parte, líneas de células suprarrenales comercial (Y1 y SW13) no secretan de corticosterona, lo que es más difícil estudiar la esteroidogénesis suprarrenal8. Uso de bovinas y Equinas, las glándulas suprarrenales como ex vivo modelos pueden ser una buena opción, aunque los tejidos de estos mercados pueden ocultar algunos riesgos desconocidos. En comparación con ellos, dirigiendo las glándulas suprarrenales de rata es más fácil y la fuente es relativamente más estable y libre de patógenos. Tomados en conjunto, el presente método descrito aquí podría utilizarse para investigar el mecanismo relacionado de la síntesis de corticosterona en las células de fasciculada suprarrenal de rata.
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Protocol
Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por institucional Animal cuidado y uso Comité de Kaohsiung Medical University.
1. experimental procedimiento
- Sacrificio de las ratas de SD hembra/macho adulto (8 a 12 semanas de edad) por eutanasia de CO2 .
- Aplicar etanol al 70% y dejar ser absorbidos por la piel y luego limpie la piel con un papel de tejido.
- Colocar la rata en una placa de plástico en la posición supina.
- Levante la piel con unas pinzas curvas "externas" en la línea media y realizar una disección Roma mediante la creación de una forma de "Y" (desde el nivel del muslo en el ángulo subcostal).
- Enjuague tijeras con etanol al 70% y, a continuación, cortar el músculo, creando una forma de "Y".
-
Encontrar la glándula suprarrenal izquierda detrás del estómago.
Nota: la adrenal derecha se encuentra profundamente detrás del hígado.- Utiliza un par de fórceps para levantar el estómago o el hígado y aislar las glándulas suprarrenales con otro fórceps curvado.
- Después de poner las glándulas suprarrenales en un recipiente estéril, retire con cuidado la cápsula suprarrenal con pinzas finas.
- Con un delicado par de tijeras, corte las glándulas suprarrenales en pequeños trozos con un poco poco de Dulbecco sin suero de modificado medio de águila (DMEM) / F-12 medio.
-
Prepare tres pipetas de Pasteur diferentes tamaño de poro y use la primera pipeta de Pasteur para aspirar todas las piezas suprarrenales en un tubo cónico de 50 mL que contiene medio con colagenasa II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Suavemente triture el tejido de piezas de 10 x. Usar el resto de las pipetas y repita los pasos anteriores hasta que todas las piezas se hacen más pequeñas.
Nota: Los tamaños de poro diferentes de las Pipetas Pasteur se pueden crear por calentamiento con fuego. La primera pipeta es el tamaño original (aproximadamente 1 mm), el tamaño del poro del segundo es aproximadamente de 0,8 mm y la tercera pipeta de Pasteur es de aproximadamente 0,5 mm. Durante la digestión, las piezas de la suprarrenal será más pequeño. Así, mediante el procedimiento mecánico, las glándulas suprarrenales pueden ser digeridas más completa. Incubar el tubo en un baño de agua (a 37 ° C) y agitarlo cada 5 min x 4 en total.
- Suavemente triture el tejido de piezas de 10 x. Usar el resto de las pipetas y repita los pasos anteriores hasta que todas las piezas se hacen más pequeñas.
- Después de la incubación de 20 minutos, añadir medio fresco y fresco (sixfold volumen; por ejemplo, 5 mL de tejido + 25 mL de medio DMEM/F-12 cool) que contiene 2,5% suero bovino fetal (FBS) y 5% de suero de caballo para detener el efecto de la enzima.
- Recoger los pellets de células por centrifugación a 800 x g por 10 min.
- Añadir un volumen adecuado de medio para suspender las células.
Nota: Cada glándula puede hacer unos ~ 3 x 105 a ~ 4 x 105 células. - Las células en placas deseadas o platos de la placa con medio de crecimiento (mezcla 1:1 [v/v] de medio DMEM y Ham F-12 complementado con 25 mM HEPES y 1% de penicilina y estreptomicina) durante la noche (día 0) a 37 ° C, en un ambiente humidificado de 95% aire y 5% CO2.
Nota: Generalmente, la placa de células en placas de 24 pozos (cuatro glándulas/placa) para el ensayo de corticosterona y en 35 mm platos (una glándula/aproximadamente uno o dos platos) para western blot análisis. - Lavar cuidadosamente las células 2 x con suero caliente medio DMEM/F-12 (día 1). Vuelva a colocar el nuevo medio de crecimiento.
- Mantener las células a 37 ° C en un ambiente humidificado de 95% aire y 5% de CO2 hasta el día 3.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento descrito aquí, las células suprarrenales cultivadas primarias podían distinguirse bajo el microscopio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar aún más que las vesículas dentro del citoplasma son gotitas del lípido, la tinción de inmunofluorescencia de proteína relacionada con la diferenciación adiposa (ADRP) podría llevarse a cabo en día 3 culturas (figura 1B). Las células fueron cultivadas en el cubreobjetos de vidrio. Las células fueron lavadas tres veces con tampón fosfato salino (PBS) y fija con paraformaldehído al 4%. Después de lavarse tres veces con PBS, las células fueron bloqueadas y permeabilized con 0,1% Tritón X-100 en 5% de leche descremada. El anticuerpo primario de ADRP fue diluido (1:50) en la leche descremada en polvo 5% y se incubó durante la noche. Después de tres veces de lavado PBS, las células se incubaron con anticuerpos contra cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 secundaria (1: 100). Después de repetir los pasos de lavado, las células fueron montadas con medio de montaje Antifade oro prolongar y se examinaron bajo el microscopio de fluorescencia. Por otra parte, la capacidad de producción de la hormona de las células suprarrenal de rata se podía determinar por análisis de corticosterona. Estimulación de la ACTH en las células suprarrenales rata podría servir como un control positivo (figura 1). Los medios recogidos fueron diluidos y analizados para contenido de corticosterona, siguiendo el procedimiento descrito por Chen et al11.
Figura 1: caracterización de células suprarrenales y la respuesta de corticosterona al tratamiento de las hormonas ADRENOCORTICOTRÓFICAS. (A) imagen de contraste de fase de células suprarrenales de rata cultivadas primaria día 3. (B) ADRP coloración aparece. (C) día-3 células suprarrenales cultivadas de rata fueron tratadas con ACTH (13:00 y 1 nM) durante 6 h. Los medios de comunicación fueron recogidos y almacenados en un refrigerador de-80 ° C hasta su uso. Se midieron los niveles de corticosterona por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las glándulas suprarrenales desempeñan un papel clave en la adaptación al medio3. La hormona que segrega la corteza suprarrenal puede regular y ajustar las funciones fisiológicas y homeostasis3. El modelo in vivo refleja los efectos fisiológicos reales en el cuerpo. Sin embargo, todavía está influenciada por muchos factores complejos, causando efectos inestables en experimentos. En contraste, el modelo de célula en vitro tiene ventajas que lo hace incomparable para el modelo animal. En primer lugar, la condición ambiental es fácil de controlar en el sistema in vitro. Hormonas son propensos a ser afectados por cualquier estímulo. Experimentos in vivo generalmente dan lugar a una reacción no específica porque los animales son propensos a la angustia. En segundo lugar, las sustancias no son fáciles de controlar en el cuerpo pero son responsables en el sistema de cultivo. En tercer lugar, el sistema in vitro reduce las variaciones entre cada experimento independiente. Muchos informes científicos muestran un medio de cultivo de células adrenocorticales que contiene 10% – 20% FBS12,13,14,15, mientras que el protocolo presentado aquí utiliza 5% FBS y 2.5% suero de caballo para mantener la crecimiento de células suprarrenales durante hasta una semana.
Esteroidogénesis se inicia desde el escote de colesterol libre por enzimas de citocromo P450 cadena lateral hendidura. Como se muestra en la figura 1AB, células suprarrenales presentan numerosas y diferentes tamaños de gotas de lípidos, sugiriendo que es una buena herramienta para la investigación de la biología de biosíntesis o lípido esteroide (fasciculada células tienen lípidos prominentes y grandes gotas)1,3. ADRP, también conocido como perilipin 2, es una proteína de superficie de gota lipídica que ayuda en el almacenamiento de lípidos neutros en el lípido gotitas16. Debido a las células adrenocorticales exhibiendo una cantidad de lípidos, la ADRP (u otras proteínas superficiales de la gota lipídica, como perilipin) puede usarse para examinar si los agentes probados afectan hormona síntesis16.
El crecimiento y la función de las glándulas suprarrenales son controlados firmemente por hormona hipotalámica liberadora de corticotrófico pituitaria ACTH, neuropéptidos, neurotransmisores y factores de crecimiento, etc.17. Figura 1 revela que la producción de corticosterona significativamente fue inducida por el tratamiento de las hormonas ADRENOCORTICOTRÓFICAS de una manera dependiente de la concentración. Por otra parte, las hormonas ADRENOCORTICOTRÓFICAS en 13:00 y 1 nM estimula la producción de corticosterona sobre 30 - y 70-fold, respectivamente. Se ha demostrado que células suprarrenales primarias cultivadas día 3 exhiben una mejor respuesta a la estimulación de ACTH15. Esta es también la razón por qué la cultura dia-3 fue utilizada en el presente estudio. Además, la medición de la corticosterona por kit de ELISA también es una herramienta sencilla y fácil para la investigación. Por lo tanto, las células suprarrenales primarios de rata cultivadas no sólo proporcionan la plataforma para el estudio de la esteroidogénesis suprarrenal pero también pueden aplicarse a la investigación de enfermedades inflamatorias.
Los pasos críticos en el presente Protocolo son la digestión de las glándulas suprarrenales y el control de la contaminación. Por lo tanto, control del tiempo de digestión, fuerza de succión física y observación del nivel de digestión del tejido son muy importantes para la supervivencia de la célula. Además, también es importante el método de cortar la piel y aislar las glándulas suprarrenales. Siempre sumerja todos los instrumentos en etanol al 70% para evitar cualquier contaminación por piel de animales. Para obtener más células, la frecuencia de succión se debe controlar menos de diez veces en cada succión. También, si la condición de los tejidos no es buena para otros pasos, la incubación en que contienen colagenasa medio no debe tener más de 30 minutos.
Porque las glándulas suprarrenales de las ratas son pequeñas, la capa glomerulosa puede perderse durante la peladura de la cápsula suprarrenal. Se ha demostrado que decapsulation resultó en la eliminación de la cápsula de tejido conectivo y la entera zona glomerulosa18. Las glándulas suprarrenales de las ratas masculinas son más pequeñas que las de las ratas hembra. Además, las gotitas de lípidos parecen ser mayores en 11 semanas de edad hombre o mujer ratones6. Con respecto a las células disponibles, hembras pueden ser una buena opción para los experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Taiwán de Consejo Nacional de ciencia (NSC102-2320-B-037-008-MY3) y una nacional Cheng Kung University Hospital beca de investigación (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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