Summary
Det hormon som utsöndras av binjurebarken är avgörande för djuren mot stress och sjukdomar. Här presenterar vi ett protokoll till kultur primära råtta adrenal celler. Det kan vara en bra in vitro-plattform för att undersöka mekanismerna av reagens intresse adrenal Steroidsyntes och lipid biosyntes.
Abstract
Hormonet som binjurebarken utsöndrar är avgörande för djuren mot stress och sjukdomar. Den metod som beskrivs här är tillvägagångssättet av primära odlade råtta adrenal celler och relaterade funktionella analyser (immunofluorescens färgning av lipid droplet ytan protein, liksom kortikosteron analys). Till skillnad från en in vivo modell, variationen av interexperiments i adrenal enskiktslager kulturer är mindre och experimentella villkoret är lätt att kontrollera. Dessutom är källan till råttor också mer stabil än andra djur, som nötkreatur och kära. Det finns också flera mänskliga adrenal cellinjer (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) som kan användas i adrenal studier. Steroid produktionen av dessa rader kommer dock fortfarande att påverkas av ett flertal faktorer, bland annat serum hel nummer, passage, mutant/förlust av olika gener, etc. Utom saknas 17α-hydroxylas, är primära kulturen i råtta adrenokortikal celler en bättre och bekvämare teknik för att studera adrenal fysiologi. Sammanfattningsvis, kunde primära råtta adrenal kulturer vara en bra in vitro-plattform för forskare att undersöka mekanismerna av reagens sevärdheter i binjuren systemet.
Introduction
Det endokrina systemet ansvarar för att reglera fysiologiska aktiviteter och homeostas1. Binjurarna ligger på den kraniala Polen i njurarna är en av de större endokrina organ som utsöndrar mineralkortikoider, glukokortikoider och androgen2,3. Det finns två distinkta delar av binjuren: cortex och medulla. Binjurebarken består av tre lager: den yttre glomerulosa, de mellanliggande fasciculata och den inre reticularis3. I zona glomerulosa är Aldosteron, en mineralkortikoida, vilket underlättar reabsorbing natrium ion och vatten i njurarna3utsöndrar Originalplats. Den zona fasciculata producerar främst en basal nivå av glukokortikoider i normala fysiologiska villkor3. Kortikosteroider hos gnagare och kortisol hos människa agera för att hjälpa kroppen att hantera stress genom att reglera blod glukos3. I viss mån kan de hämma inflammatoriska svar och reglera immunförsvaret4,5. Till skillnad från andra däggdjur, möss och råttor har inte en funktionell zona reticularis på grund av ett 17α-hydroxylas uttryck i binjuren6,7. Binjurar från möss och råttor är således saknar utsöndringen av adrenal C-19 steroider (kortisol och adrenal androgener).
Primära odlade adrenokortikal cellerna har visat sig vara användbara för att undersöka mekanismer som styr den adrenal fysiologi8. Som andra steroidogena vävnader syntetiserar varje binjure zon dess steroider från gratis kolesterol9. Vid adrenokortikotropt hormon (ACTH) stimulering, gratis kolesterol frigörs från uppdelning lipid droppar och, därmed, ökar steroid produktion i fasciculata och reticularis10.
Många grupper har försökt att etablera stabila cellinjer från adrenokortikal carcinom. Flera problem har dock begränsad användning av adrenokortikal cellinjer som vitro modeller8. Steroid Svaren av cellinjer kan skilja sig mellan passager, partinumret för serum och kvaliteten av serum, etc. Kommersiella adrenal cellinjer (Y1 och SW13) dessutom inte utsöndrar kortikosteron, vilket gör det svårare att studera adrenal Steroidsyntes8. Med nötkreatur och hästdjur binjurar som ex vivo modeller kan vara ett bra val, även om vävnader från dessa marknader kan dölja vissa okända risker. Jämfört med dem, hantera råtta binjurarna är lättare och källan är relativt mer stabil och patogenfria. Sammantaget kan den nuvarande metoden som beskrivs här användas att undersöka relaterade mekanismen av kortikosteron syntes i råtta adrenal fasciculata celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden inklusive animaliska ämnen har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av Kaohsiung medicinskt universitet.
1. experimentell förfarande
- Offra vuxen (8 till 12 veckor gamla) hona/hane SD råttor av CO2 dödshjälp.
- Tillämpa 70% etanol och låt den absorberas in i huden och torka sedan huden med en pappersnäsduk.
- Lägg råtta på en ren plast tallrik i ryggläge.
- Lyfta huden med ”externa” böjd pincett vid mittlinjen och utföra en trubbig dissektion genom att skapa en ”Y” form (från nivån av låret till subcostal vinkeln).
- Skölj sax med 70% etanol, och sedan skär muskeln, att också skapa en ”Y”-form.
-
Hitta den vänstra binjuren bakom magsäcken.
Obs: den höger binjure kan hittas djupt bakom levern.- Använd ett par pincett att lyfta magen eller levern och isolera binjurarna med en annan böjd pincett.
- Efter att sätta binjurarna i en steril skål, ta försiktigt bort adrenal kapseln med fin pincett.
- Med en delikat sax, klippa binjurar i små bitar med en liten bit av serumfritt Dulbecco ändrade örnens medium (DMEM) / F-12 medium.
-
Förbered tre olika por-storlek Pasteur pipetter och använda den första Pasteur Pipettera som aspirerar alla adrenal bitar till en 50 mL konisk tub som innehåller medium med kollagenas II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Försiktigt pulverisera vävnad bitar om 10 x. Använd resten av pipetter och upprepa stegen ovan tills alla bitar blir mindre.
Obs: De olika porstorlek på de Pasteur-pipetter kan skapas genom att värma dem med eld. Den första Pipettera är den ursprungliga storleken (ca 1 mm), porstorlek av den andra är ca 0,8 mm och den tredje Pasteur Pipettera är ca 0,5 mm. Under matsmältningen blir bitar av adrenal mindre. Således, via mekaniska förfarandet, binjurar kan smältas mer klar. Inkubera röret i vattenbad (vid 37 ° C) och skaka den varje 5 min, 4 x totalt.
- Försiktigt pulverisera vävnad bitar om 10 x. Använd resten av pipetter och upprepa stegen ovan tills alla bitar blir mindre.
- Efter 20 min ruvning, lägga till fräsch och sval medium (sixfold volym; exempelvis 5 mL av vävnad + 25 mL cool DMEM/F-12 medium) som innehåller 2,5% fetalt bovint serum (FBS) och 5% häst serum att stoppa enzym effekten.
- Samla in cell pellets genom centrifugering vid 800 x g i 10 min.
- Lägga till en lämplig volym av medium att avbryta cellerna.
Obs: Varje körtel kan göra ca ~ 3 x 105 till ~ 4 x 105 celler. - Platta celler i önskad plattor eller rätter med odlingsmedium (1:1 [v/v] blandning av DMEM och Hams F-12 medium, kompletteras med 25 mM HEPES och 1% penicillin och streptomycin) övernattning (dag 0) vid 37 ° C, i en fuktig miljö av 95% luft och 5% CO2.
Obs: Oftast, vi platta celler i 24 brunnar (fyra körtlar/platta) för kortikosteron analysen och i 35 rätter (en körtel/cirka en till två rätter) för western blot mm analys. - Noggrant tvätta cellerna 2 x med serumfritt varma DMEM/F-12 medium (dag 1). Ersätta nya odlingsmedium.
- Behålla cellerna vid 37 ° C i en fuktig miljö av 95% luft och 5% CO2 till dag 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda proceduren som beskrivs här, skulle primära odlade adrenal celler kunna skiljas under ett faskontrastmikroskop (figur 1A). För att ytterligare bekräfta att blåsor inom cytoplasman lipid droppar, kunde immunofluorescens färgningen av fett differentiering-relaterade protein (ADRP) utföras på dag-3 kulturer (figur 1B). Celler odlades på glas coverslips. Cellerna var sköljas tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fast med 4% paraformaldehyd. Efter tvätta tre gånger med PBS, cellerna blockerades och permeabilized med 0,1% Triton x-100 i 5% nonfat mjölk. Den primära ADRP antikroppen var utspädda (1:50) i 5% nonfat mjölk och var inkuberas över natten. Efter tre gånger med PBS tvättning, cellerna inkuberades med get-anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundära antikroppar (1: 100). Efter upprepande tvätt stegen, cellerna var monterade med förlänga guld Antifade monteringsmedium och undersöktes under mikroskopet fluorescens. Dessutom kunde hormonproducerande förmågan hos råtta adrenal cellerna fastställas av kortikosteron assay. Stimulering av ACTH på råtta adrenal celler skulle kunna fungera som en positiv kontroll (figur 1 c). Insamlade media var spädas ut och analyseras för kortikosteron innehåll, enligt proceduren som beskrivits av Chen et al.11.
Figur 1: karakterisering av adrenal celler och kortikosteron behandlingssvaret ACTH. (A) faskontrast bild av dag-3 primära odlade råtta adrenal celler. (B), ADRP färgning visas. (C) dag-3 odlade råtta adrenal celler behandlades med ACTH (1 pM och 1 nM) för 6 h. Media samlades in och förvaras i kylskåp-80 ° C fram till användning. Kortikosteron nivåerna mättes av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Binjurarna har en central roll i miljöanpassning3. Hormonet som binjurebarken utsöndrar kan reglera och justera fysiologiska funktioner och homeostas3. Invivo modellen speglar de verkliga fysiologiska effekterna i kroppen. Dock är det fortfarande påverkad av många komplexa faktorer, orsakar instabil effekter i experiment. Däremot har den in vitro rapportör cell modellen fördelar vilket gör att det är makalös till djurmodell. Första är villkoret miljö lätt att kontrollera i in vitro-systemet. Hormoner kommer sannolikt att påverkas av någon stimulans. In vivo experiment resultera brukar i en ospecifik reaktion eftersom djur drabbas av ångest. Andra ämnen är inte lätt att övervaka i kroppen men ansvarar i odlade systemet. För det tredje, in vitro-systemet minskar avvikelser mellan varje oberoende experiment. Många vetenskapliga rapporter visar en kultur media adrenokortikal celler som innehåller 10 – 20% FBS12,13,14,15, medan protokollet presenteras här använder 5% FBS och 2,5% häst serum för att bibehålla den tillväxten av adrenal celler för upp till en vecka.
Steroidsyntes startas från klyvning av gratis kolesterol av cytokrom P450-sidokedjan klyvning enzymer. Som visas i figur 1AB, adrenal celler uppvisar många och olika storlekar av lipid droppar, tyder på det är ett bra verktyg för utredning av steroid biosyntes eller lipid biologi (fasciculata celler har framstående och större lipid droppar)1,3. ADRP, även känd som perilipin 2, är en lipid droplet ytan protein som hjälper till lagring av neutrala lipider inom de lipid droppar16. På grund av adrenokortikal celler uppvisar en mängd lipid, ADRP (eller andra lipid droplet yta proteiner, som perilipin) kan användas för att undersöka om de testa agenterna påverkar hormonet syntes16.
Tillväxt och funktion av binjurarna styrs hårt av hypotalamus corticotropic-frisättande hormon och hypofysär ACTH, neuropeptider, signalsubstanser och tillväxtfaktorer, etc.17. Figur 1 c avslöjar att kortikosteron produktionen var betydligt induceras av ACTH behandling på ett koncentrationsberoende sätt. Dessutom ACTH vid 1 pM och 1 nM stimuleras kortikosteron produktion ca 30 - och 70-fold, respektive. Det har visats att dag-3 odlade primära adrenal celler uppvisar ett bättre svar på ACTH stimulering15. Detta är också anledningen till varför dag-3 kultur användes i föreliggande studie. Mätning av kortikosteron av ELISA kit är dessutom också en enkel och lätt redskap för forskning. Därför primära odlade råtta adrenal cellerna inte bara tillhandahålla plattformen för att studera adrenal Steroidsyntes men kan även tillämpas på utredningen av inflammatoriska sjukdomar.
De kritiska steg i detta protokoll är nedbrytning av binjurarna och kontroll av förorening. Kontroll av matsmältning tid, fysiska sugstyrka och observation av vävnad matsmältningen nivå är därför mycket viktigt för cellöverlevnad. Dessutom är metoden att skära huden och isolera binjurarna också betydande. Alltid fördjupa alla instrument i 70% etanol att förhindra kontaminering av djurens päls. För att få fler celler, bör sug frekvensen kontrolleras mindre än tio gånger under varje sugning. Även om tillståndet i vävnaderna inte är bra för ytterligare steg, inkubering i som innehåller kollagenas medium bör inte vara längre än 30 min.
Eftersom binjurarna hos råttor är små, förloras glomerulosa lagret under peeling av adrenal kapseln. Det har visats att avkodning av inkapsling resulterade i avlägsnandet av en bindväv kapsel och de hela zona glomerulosa18. Binjurarna hos hanråttor är mindre än de hos honråttor. Dessutom verkar lipid droppar vara större i 11 veckor gamla kvinnliga eller manliga möss6. Angående de tillgängliga cellerna, kan honråttor vara ett bra val för experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från de nationella Science rådet Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) och ett nationellt Cheng-Kung University Hospital forskningsanslag (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
