Summary
Hormone secreted av binyrebarken er avgjørende for dyr mot stress og sykdommer. Her presenterer vi en protokoll til kultur primære rotta adrenal celler. Det kan være en god i vitro plattform for å undersøke mekanismer for reagensen av adrenalin steroidogenesis og lipid biosyntesen.
Abstract
Hormonet som binyrebarken utskiller er avgjørende for dyr mot stress og sykdommer. Metoden beskrevet her er prosedyren for primære kulturperler rotte adrenal celler og relaterte funksjonelle analyser (immunofluorescence farging av lipid slippverktøy overflaten protein, samt corticosterone analyse). I motsetning til en i vivo modell, variasjonen av interexperiments i adrenal monolayer kulturer er mindre og eksperimentelle betingelsen er lett å kontrollere. Dessuten er kilden til rotter også mer stabilt enn andre dyr, som storfe seg. Det er også flere human adrenal cellelinjer (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) som kan brukes i adrenal studier. Steroid produksjon av disse linjene, vil imidlertid fortsatt påvirkes av mange faktorer, som inkluderer serum partinummer, passasjen tall, mutant/tap av forskjellige gener, etc. Bortsett fra mangler 17α-hydroksylase, er primære kultur rotte adrenocortical celler en bedre og enklere teknikk for å studere adrenal fysiologi. Oppsummert kan primære rotte adrenal kulturer være en god i vitro plattform for forskere å undersøke mekanismer for reagensen interesse binyrene systemet.
Introduction
Det endokrine systemet er ansvarlig for å regulere fysiologisk aktivitet og homeostase1. Binyrene ligger på skallen Polen av nyrer er en av de store endokrine organene som skiller mineralkortikoider, glukokortikoider, og androgen2,3. Det er to forskjellige deler av det adrenalin kjortelen: cortex og margen. Binyrebarken består av tre lag: den ytre glomerulosa, den mellomliggende fasciculata og indre reticularis3. Den zona glomerulosa er den opprinnelige secreting aldosteron, en mineralocorticoid, som hjelpemidler i reabsorbing natrium ion og vann i nyrene3. Den zona fasciculata produserer hovedsakelig en basal nivå av glukokortikoider i normale fysiologiske forhold3. Corticosteroids i gnagere og kortisol hos mennesker fungere for å hjelpe kroppen med å mestre stress ved å regulere blod glukose3. I noen grad, kan hemme inflammatorisk svar og regulere immunsystemet4,5. I motsetning til andre pattedyr, mus og rotter har ikke en funksjonell zona reticularis skyldes mangel på en 17α-hydroksylase uttrykk i binyrene6,7. Dermed er binyrene fra mus og rotter blottet for utskillelsen av C-19 binyrene (cortisol og adrenalin androgener).
Primære kulturperler adrenocortical celler har vist seg å være nyttig for å undersøke mekanismer som styrer adrenal fysiologi8. Som andre steroidogenic vev syntetiserer hver adrenal sone sin steroider gratis kolesterol9. På adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulering, gratis kolesterol er løslatt fra sammenbrudd lipid dråper og dermed forbedrer steroid produksjon i fasciculata og reticularis10.
Mange grupper har forsøkt å etablere stabil linjer fra adrenocortical kreftsvulster. Men har flere bekymringer begrenset bruken av adrenocortical linjer som vitro modeller8. Steroid svarene på linjer kan variere mellom passasjer, partinummeret for serum og kvaliteten av serum, etc. Videre skiller kommersiell adrenal cellelinjer (Y1 og SW13) ikke corticosterone, gjør det vanskeligere å studere adrenal steroidogenesis8. Bruke storfe og jevndøgn binyrene som ex vivo modeller kan være et godt valg, selv om vev fra disse markedene kan utydeliggjøre noen ukjente risikoer. Sammenlignet med dem, behandle rotte binyrene er lettere og kilden er relativt mer stabil og patogen. Samlet kan nåværende metoden beskrevet her brukes til å undersøke relaterte mekanisme corticosterone syntese i rotte adrenal fasciculata celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Kaohsiung Medical University.
1. eksperimentelle prosedyren
- Ofre voksen (8 til 12 uke-gamle) kvinne/mann SD rotter av CO2 euthanasia.
- Bruke 70% etanol og la det bli absorbert inn i huden og tørk huden med en papir.
- Putte rotta på en ren plast plate i supine posisjon.
- Løft huden med "eksterne" buet tang på midtlinjen og utføre en stump disseksjon ved å opprette en "Y" figur (fra nivået av låret sirkulerer vinkelen).
- Skyll saks med 70% etanol, og deretter klippet muskler, skape en "Y"-figur.
-
Finne venstre binyrene bak magesekken.
Merk: den riktige adrenalin finner du dypt bak leveren.- Bruk ett par tang til å løfte magen eller leveren og isolere binyrene med en annen buet tang.
- Etter å sette binyrene i et sterilt parabol, forsiktig fjerne adrenal kapsel med fine tang.
- Med en delikat saks, kuttet av binyrene i små biter med en liten bit av serum-free Dulbecco modifiserte Eagle's medium (DMEM) / F-12 medium.
-
Forberede tre forskjellige pore-størrelse Pasteur Pipetter for flergangsbruk og bruke den første Pasteur Pipetter inneholder alle adrenal bitene i en 50 mL konisk rør som inneholder medium med collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Forsiktig stykker triturate vevet om lag 10 x. Bruke resten av de Pipetter for flergangsbruk og Gjenta trinnene ovenfor til alle brikkene blir mindre.
Merk: Forskjellige pore størrelsen på de Pasteur Pipetter for flergangsbruk kan opprettes ved å varme dem med ild. Den første Pipetter er den opprinnelige størrelsen (ca 1 mm), porestørrelse av andre er om 0,8 mm, og den tredje Pasteur Pipetter er ca 0,5 mm. I fordøyelsen blir biter av adrenalin mindre. Dermed via mekanisk prosedyren kan av binyrene bli fordøyd mer ferdig. Inkuber røret i et vannbad (på 37 ° C) og rist den hver 5 min, 4 x totalt.
- Forsiktig stykker triturate vevet om lag 10 x. Bruke resten av de Pipetter for flergangsbruk og Gjenta trinnene ovenfor til alle brikkene blir mindre.
- Etter 20 min incubation, Legg frisk og kjølig medium (sixfold volum, for eksempel 5 mL av vev + 25 mL av kule DMEM/F-12 medium) med 2,5% fosterets bovin serum (FBS) og 5% hest serum å opphøre enzym effekten.
- Samle celle pellets med sentrifugering 800 x g i 10 min.
- Legge til en riktig volum på medium å suspendere cellene.
Merk: Hver kjertel kan gjøre om ~ 3 x 105 ~ 4 x 105 celler. - Plate cellene i ønsket plater eller retter med vekstmediet (1:1 [v/v] blanding av DMEM og Ham F-12 medium, supplert med 25 mM HEPES og 1% penicillin og streptomycin) overnatting (dag 0) på 37 ° C, i en fuktet miljø av 95% luft og 5% CO2.
Merk: Vanligvis er vi plate celler i 24-vel plater (fire kjertler/plate) for corticosterone analysen og i 35 retter (en kjertel/omtrent en til to retter) for western blot mm analyse. - Forsiktig vaske cellene 2 x med serum-free varmt DMEM/F-12 medium (dag 1). Erstatt ny vekst medium.
- Opprettholde cellene på 37 ° C i en fuktet miljø av 95% luft og 5% CO2 til dag 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke fremgangsmåten som er beskrevet her, kan primære kulturperler adrenal celler skilles under et mikroskop med fase kontrast (figur 1A). For å bekrefte videre at blemmer i cytoplasma lipid dråper, kan den immunofluorescence flekker adipose differensiering-relaterte protein (ADRP) bli gjennomført på dag-3 kulturer (figur 1B). Cellene ble dyrket på glass coverslips. Cellene ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og fast med 4% paraformaldehyde. Etter vask tre ganger med PBS, cellene ble blokkert og permeabilized med 0,1% Triton X-100 i 5% nonfat melk. Primære ADRP antistoffer ble utvannet (1:50) i 5% nonfat melk og ble inkubert over natten. Etter tre ganger på PBS vasking, cellene ble inkubert med geit anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer (1: 100). Etter gjentatte vask trinnene, cellene var montert med forlenge gull Antifade montering medium og ble undersøkt under fluorescens mikroskop. Videre kan hormon-produserende evne til rotte adrenal cellene bestemmes av corticosterone analysen. Stimulering av ACTH på rotte adrenal celler kan tjene som en positiv kontroll (figur 1 c). Samlet media var utvannet og assayed for corticosterone innhold, i henhold til prosedyren beskrevet av Chen et al.11.
Figur 1: karakterisering av adrenal celler og corticosterone svaret ACTH behandling. (A) kontrast bilde av dagen-3 primære kulturperler rotte adrenal celler. (B) ADRP flekker vises. (C) dag-3 kulturperler rotte adrenal celler ble behandlet med ACTH (1 pM og 1 nM) 6 h. Media ble samlet inn og lagret i kjøleskap-80 ° C før bruk. Corticosterone nivåer ble målt ved enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Binyrene spille en nøkkelrolle i miljømessige tilpasning3. Hormonet som binyrebarken utskiller kan regulere og justere fysiologiske funksjoner og homeostase3. I vivo modellen reflekterer de ekte fysiologiske effektene i kroppen. Imidlertid er det fortsatt påvirket av mange komplekse faktorer, forårsaker ustabil effekter eksperimenter. I kontrast har i vitro celle modellen fordeler som gjør det sammenlignes med dyr modellen. Først er miljømessige tilstanden lett å kontrollere i vitro. Hormoner er sannsynlig å bli berørt av noen stimulans. In vivo eksperimenter resultere vanligvis i en spesifikk reaksjon fordi dyrene er utsatt for nød. Andre stoffer er ikke lett å overvåke i kroppen, men er ansvarlig i kulturperler systemet. Tredje reduserer i vitro systemet avvik mellom hver uavhengige eksperiment. Mange vitenskapelige rapporter viser en kultur medier adrenocortical celler som inneholder 10%-20% FBS12,13,14,15, mens protokollen presenteres her bruker 5% FBS og 2,5% hest serum for å opprettholde den veksten av adrenal celler i opptil en uke.
Steroidogenesis er startet fra spalting av gratis kolesterol av cytochrome P450 side-kjeden cleavage enzymer. Som vist i figur 1AB, adrenal celler utstilling mange og ulike størrelser av lipid dråper, tyder det er et godt verktøy for etterforskningen av steroid biosyntesen og/eller lipid biologi (fasciculata celler har fremtredende og større lipid dråper)1,3. ADRP, også kjent som perilipin 2 er et lipid slippverktøy overflaten protein som bistår i lagring av nøytrale lipider i lipid dråper16. På grunn av adrenocortical celler viser en mengde lipid, ADRP (eller andre lipid slippverktøy overflaten proteiner, som perilipin) kan brukes til å undersøke om testet agentene påvirker hormon syntese16.
Vekst og funksjon av binyrene er strengt kontrollert av hypothalamus corticotropic-releasing hormone og hypofysen ACTH, neuropeptides, nevrotransmittere og vekstfaktorer, etc.17. Figur 1 c avslører at corticosterone produksjonen var betydelig indusert av ACTH behandling i en konsentrasjon-avhengige mote. Videre ACTH på 1 og 1 nM stimulerte corticosterone produksjon ca 30 - og 70-fold, henholdsvis. Det har blitt demonstrert at dag-3 kulturperler primære adrenal celler ha en bedre respons til ACTH stimulering15. Dette er også grunnen hvorfor dag-3 kultur ble brukt i studien. I tillegg er måling av corticosterone av ELISA kit også en enkel og lett verktøy for forskning. Derfor primære kulturperler rotte adrenal cellene ikke bare gi plattformen for å studere adrenal steroidogenesis men også gjelde for etterforskningen av provoserende-relaterte sykdommer.
De avgjørende skritt i stede protokollen er fordøyelsen av binyrene og kontroll av forurensning. Kontroll av fordøyelsen tid, fysisk sugekraft makt og observasjon av vev fordøyelsen nivået er derfor svært viktig for celle overlevelse. Videre er kutte huden og isolere binyrene også betydelig. Alltid fordype alle instrumentene i 70% etanol å hindre enhver kontaminering av dyret. For å få flere celler, bør suge frekvensen kontrolleres mindre enn ti ganger under hver sugekraft. Også om tilstanden til vev ikke er bra for ytterligere skritt, inkubasjon i collagenase inneholder middels må ikke være lengre enn 30 min.
Fordi binyrene rotter er små, kan glomerulosa laget gå tapt under peeling av adrenal kapselen. Det har blitt demonstrert at utpakking resulterte i fjerning av bindevev kapsel og hele zona glomerulosa18. Binyrene av mannlig rotter er mindre enn kvinner rotter. I tillegg synes lipid dråper å være større i 11 uke gammel kvinne eller mann mus6. Angående tilgjengelig cellene, kan hunnrotter være et godt valg for eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Council Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) og en National Cheng-Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
