Summary
このプロトコルでは、相補的な分析とオミックス技術の天然有機物と異なる生態系における微生物のプロテオミクスの完全にペアの特性で最高潮に達する単一のスループットについて説明します。この方法は、代謝と環境変化への応答を予測する温室効果ガス生産を記述するため重要な変換を識別するための堅牢な比較を許可します。
Abstract
天然有機物 (NOM) は、歴史的に、特徴付けることは困難証明する有機化合物の何千もの非常に複雑な混合物で構成されます。ただし、公称値の分解から生じる温室効果ガス (二酸化炭素 [CO2] と [4CH] メタン) 生産の熱力学的および速度論的コントロールを理解する分子レベルの特性と相まって微生物プロテオーム解析が必要です。さらに、気候や環境の変化は、有機物の基質の供給と、変換を実行する微生物に影響を与える複雑な相互作用を動揺させる可能性のある自然の生態系を混乱させると予想されます。有機物、微生物のプロテオミクスと経路および有機物の分解、変換の詳細な分子特性解析は、方向と環境変化の影響の大きさを予測する必要があります。直接注入するフーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析法 (FTICR MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)、単一サンプルの包括的な代謝産物解析の方法論的スループットについて説明します核磁気共鳴 (NMR) 分光法、液体クロマトグラフィーの質量分析計 (LCMS)、およびプロテオミクス解析。このアプローチは、有機物の分解、結果 CO2 CH4生産率、環境変動への応答の経路を推定の統計的信頼度を向上させる完全にペアのデータセットの結果します。ここを提案する; の泥炭地帯から収集されたサンプルの公称値にこの手法を適用した結果ただし、プロトコルは、任意の公称サンプル(例えば泥炭、森林土壌、海洋堆積物等)に適用されます。
Introduction
世界的に、湿地は、泥炭の沈殿物の1で埋められる有機 C 主として炭素 (C) の 529 の Pg が含まれてと推定されます。現在、このような泥炭地は、北アメリカ単独で1に 29 の Tg C y-1を隔離ネット C シンクとして機能します。しかし、流出、火災、干ばつ、気温などの環境外乱は、温室効果ガスの増加 C 損失を介して有機物分解を増やすことによってこの C シンクを相殺できる (二酸化炭素 [CO2] とメタン [4CH]) 生産1,2。気候変動より暖かい温度や乾燥条件微生物による高速 C 分解を刺激する場合 C の損失に貢献するかもしれない。また、高い温度と大気 CO2濃度の有機炭素 (OC) としてより多くの CO2を隔離する第一次生産を刺激するかもしれない。その OC は CO2に分解されます、どの程度、どのくらいの速と CH4電子ドナー基板、電子アクセプターの可用性および媒介微生物間の複雑な相互作用に依存、変換です。多くの場合、メカニズムよ特徴付けられた、従って環境変動への応答はよく制限されませんは、泥炭地生態系における炭素収支に気候変動の結果がされるかは不明のまま。
天然有機物 (NOM) の複雑な性質も歴史的に困難な公称値の混合物である有機化合物を識別しました。最近の進歩は、伝統的にその化合物を特徴づけるし、ある程度手に負えない腐植またはフルボ化合物3,4、5とみなされる、継続する当社の能力を大幅改善しています。我々 は今、これらの化合物の多くが実際に微生物があり、適切なターミナル電子アクセプター (茶) が利用可能な6,7を行われた場合に分解する可能性がありますを理解します。化合物の炭素 (NOSC) の名目の酸化状態を計算する分解と必要なお茶のエネルギー収率の可能性を予測する指標を提供します。ただし、7有機物の分子レベルの特性評価が必要です。NOSC が、分子式を介して次の方程式7から計算されます: NOSC − = ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S))/(#C)) + 4、z は純充満。NOSC は、熱力学的駆動力8、前記化合物より高い NOSC が低下、低い NOSC 化合物が減少するためにますますエネルギッシュな茶を必要としながら容易に相関しています。NOSC − 2 未満化合物 O2、硝酸マンガンIVなど紅茶を産する高エネルギーを必要とし、一般的に発生することはできませんが低下する鉄IIIなどのお茶をもたらすエネルギーを低くか、7の硫酸塩します。これは水浸しの無酸素状態の湿地帯、O2と茶を産する他の高エネルギーが乏しい9したがってこれらの条件の下で低い NOSC 化合物の分解に重要な考慮事項熱力学的に制限されています。O2 (最もエネルギッシュなの電子アクセプター)、有機基板と可能な電子アクセプターの変化に影響を及ぼす地下水の変化を通じて生態系の熱力学的状態に影響を与える環境の摂動によってプライマリ生産、温度によってより小さい範囲に。Homoacetogenesis (すなわちCO2 H2酢酸生産) と hydrogenotrophic によるメタン生成 (の間に発生するトレードオフに関して発生する湿地における温度の影響の重要な例すなわちCO2 H2CH4生産)。低温では、その homoacetogenesis は、支持は少し暖かい温度を好む CH4生産10が表示されます。この温度の影響は、CH4は CO211とこの犠牲に CH4の生産の増加よりもはるかに強力な温室効果ガス、気候変動に生態系の応答の重要な意味があります。暖かい温度で CO2の気候温暖化の肯定的なフィードバックに貢献するかもしれない。
泥炭地は、CO2のグローバル重要な量を作り出すし、有機天然の微生物呼吸を介してCH4の6の問題します。有機炭素基板 NOSC が CO2の相対的な割合を決定します: CH4生産に比べて CO211、しかしまたので CH4の高い放射強制のための重大な変数であります。モデリング作業は、泥炭地12C フラックスの推定の重要なパラメーターとして、この比率を識別しました。CO2以外のターミナル電子アクセプターの不在、それ示すことができる電子バランスで NOSC > 0 にする有機 C 基板が CO2を生成: CH4 > 1、NOSC 有機 C = 0 生成する CO2 CH 4モル比と NOSC 有機 C < 1 が生成されます CO2: チャンネル4 < 113。自然の生態系で OC の分解微生物が媒介、特定の化合物の分解を熱力学的に可能な場合でも速度論的に制限し、無酸素条件下で微生物酵素の活動で、熱力学の原動力 (すなわちNOSC)7。今までは、化合物の存在の多様性のさまざまな補完的な技術を必要とするため、有機物を完全に特徴づけるチャレンジしております。最近の進歩はギャップを閉じています。分析技術のスイートを使用して有機化合物の分子レベルの特性を提供するのと、800 Da ポリ複素環までブドウ糖のような小さな主代謝物から、いくつかのケース定量化の大規模な範囲を分析できます。以前このような大規模な複雑な分子が特徴づけられている単にリグニンやタンニン様と反抗的なされていると仮定します。分子レベルの特性評価、ただし、NOSC のもこれらの大きな複雑な分子のための計算ができます。これら NOSC 値は有機物の分解は、多くの場合これらの複雑な分子が微生物が実際に明らかに使用可能な品質の評価を可能にする熱力学の原動力に線形相関します。湿地で勝つ無酸素条件下でも分解します。
O2の導入により、有機物分解するほぼすべての自然観測 NOSC 値のです、のでここに着目し有機物と微生物のプロテオミクス (はすなわち、湿地における主な要因をする可能性がある変更限られた O2) システム。しかし、について説明しますすべての技術は、あらゆる生態系から有機物に適用できます。一般的に、一括測定に基づいて光と蛍光分析は、有機物質3,14を評価するために使用されています。一括測定など、これらを使用している場合ただし、細部が失われる分子の数が多いを一緒に humics や fulvics のような一般的な条件の下で分類される、これらのカテゴリの定義よく拘束されていないと、実際には、研究から作る比較不可能を異なる場合があります。さらに、一括測定システムを支配する熱力学の計算に必要な分子の詳細を提供していない従って偽りなく有機物質15の評価を下回る。
フーリエなど個々 の技術を変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析 (FTICR MS)、核磁気共鳴 (NMR) 分光法、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)、液体クロマトグラフィーの質量分析計 (LCMS)このような分子レベルの詳細を提供します。これらの方法で独自の制限は、彼らはまた厳格な熱力学的意味での有機物質を定量化するために必要な分子細部を達成するために統合されたアプローチに活用ことができる自分の強みをもたらす.GC-MS は CO2 CH4の生産(例えばグルコース、酢酸等);近位影響を与える可能性のある重要な小さな代謝物を識別するのに役立ちますただし、GC-MS 標準に対する検証を必要とは、既に知られている化合物の新規化合物の同定を防止するデータベース内に存在する限られました。さらに、GC MS は相対濃度変更についての推論を許可するが、たとえばギブズ自由エネルギーを計算するために必要な実際の集中情報を提供していない半定性的手法です。最後に、GC-MS 分析化合物 〜 400 Da よりも小さい解像度を制限する前に分子の誘導体化を必要として揮発性のアルコールは乾燥中に失われます。
一次元 (1 D) 1H 液体状態の NMR により小さな代謝物 (分子量が小さい主代謝物、アルコール、酢酸、アセトン、ギ酸、ピルビン酸、コハク酸のような揮発性物質を含む高度定量化悪名高い欠席または MS ベースのメソッドから侵害された炭水化物の範囲と同様、短いチェーン脂肪酸)、その濃度が熱力学的パラメーターを計算する場合に特に便利です。まだ、GC-MS のような複雑な混合物の 1 次元 NMR データベースに対する標準化が必要です、自然と変化の複雑な生態系で豊富なことを可能性のある新規化合物を容易に識別を単独で許可しませんしたがって。さらに、NMR、MS ベースの手法よりも重要度の低い、したがって、定量的代謝物プロファイリング ヘリウム冷却コールド プローブを搭載した NMR を用いた 1 μ M 以上のみが実現します。ない広く高く評価されて、いくつかの NMR のコールド プローブ耐塩性、小さい直径 (< 3 mm 外径) サンプル チューブ16で使用する場合、millimolar の塩濃度の存在下で混合物の環境分析を許可します。しかし、NMR のそれ以上の合併症は、常磁性金属や鉱物を多量 (例えばFe と Mn 畑土壌における豊富なすることができます、1-3 wt %)上記できますスペクトル特徴を広げるし、NMR スペクトルの解釈を複雑にします。.固相抽出 (SPE) を用いた NMR および MS ベース メタボロミクスの解釈で補佐官をすることができますミネラル塩を減らすとスペクトルの品質が向上します。
直噴で FTICR MS は単一サンプル由来の代謝産物の数万人を検出できる高感度技術それは酢酸、ピルビン酸、コハク酸など重要な小さな代謝産物をキャプチャしません、困難ですが砂糖や他の炭水化物の17、用も定量的な情報を提供します。ただし、他の技術とは異なり、FTICR MS を識別して新規化合物の分子式を割り当てるに優れています、したがって化合物、その他の記載された方法のいずれかよりもより分子の情報を提供するの最大数を指定します。8特定の反応とその率下での尤度を支配する熱力学の原動力に関連している NOSC を計算する FTICR MS (および他の技術) によって提供される分子情報を使用できるので、これは便利条件7。さらに、タンデム MS と LC の分離技術と FTICR MS を結合することによって構造の定量的な情報が達成でき、この手法の欠点のいくつかを相殺します。LC-MS は脂質のような化合物と他の方法のいずれかによって特徴は他の代謝物を識別するのに役立ちます。一部コレクターと二次元 (2 D) 液体状態 NMR は識別し、未知の化合物18 を定量化のための理想的な状況による構造解明のための興味の特定の未知数の分数を収集 LC-MS FTICR または LC-MS を結合 ,19。しかし、これは必要な場合に使用することができる非常に時間がかかるステップです。個別に撮影、各技術は有機物の別のスナップショットを提供し、統合することで、単独での任意の方法を使用するよりもより完全な理解を実現します。
に関する熱力学的考察を設定、システムで可能な変換に究極の制約、有機物の分解は微生物が酵素反応速度の制御によって媒介されます。したがって、微生物酵素活動にオミクス統合アプローチが必要です完全に有機物の分解と最終的に湿地からの温室効果ガス (CO2 CH4) 生産のコントロールを理解と同様代謝物。この記事では結果を完全にペアの解析でシーケンシャル方式を使用して 1 つのサンプルからこのような包括的な分析を達成するための方法をについて説明します。このアプローチを拡張代謝・蛋白質・脂質の抽出 (MPLex) のプロトコル プロテオミクスだった GC MS と LC MS20定量的代謝物の情報を組み込むことにより小型の代謝、蛋白質および脂質を識別するために結合しています。経由でNMR および大きい二次代謝産物を介してFTICR さん少し MPLex に別の識別、我々 は水抽出し、ますます非極性溶剤使用連続抽出プロトコルを開始します。すべて抽出がボリュームが限られているまたは入手が困難なときはサンプルを節約し異種試料 (例えば、土および泥炭) から因数変異を介しての実験誤差を減少させる 1 つのサンプルで行われるか保管条件と期間の違い。
最後に、微生物群集のプロテオミクス解析と OM の分析を結合することにより経路と有機物分解の変換を記述する代謝ネットワークを構築できます。これにより、私たちは究極の CO2 CH4生産し使用可能な有機基板、電子受容体、微生物群集の変化を通じてのシステムに対する摂動論の影響についての特定の仮説をテストするには反応を介して酵素触媒の活動を仲介します。
このメソッドの全体的な目標はそれにより解析エラーを制限しながら代謝ネットワークを構築するため完全にペア データセットの作成 1 つのサンプルから微生物の蛋白質、脂質、代謝物を分析するため単一スループット プロトコルを提供するために、します。.
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Protocol
1 有機物の土壌、堆積物、または泥炭からの抽出シーケンシャル
- 土壌、堆積物、または泥炭を介して掘削を収集し、(例えば深さ) テストされる仮説によるとコアを分割します。ポリテトラフルオロ エチレンでストア サンプル容器のコーティングし、分析の前にストレージ-80 ° C でフリーズします。
注: このプロトコルの約 25 mg C が必要です。泥炭 (通常 45 %c)、乾燥した泥炭の 50 mg が必要です。低有機サンプル C によって鉱物や森林に覆われた台地土壌コンテンツ (5 g まで) のようなは、大量のサンプルが必要場合があります。有機溶剤による抽出は 2.4 の段階のイオン化に悪影響が、エキスに、ポリエチレング リコール (PEG) を引っ張ってくるためサンプル収集、保管中に任意の時点プラスチックに連絡することができますを避けるために重要ですか抽出します。 - サンプルを分析する準備ができたら、一定重量まで乾燥を凍結し、均質化と集計を破るステンレス スチール研磨ボールを使用して高速ボールミルのサンプルを挽きます。
注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできるし、材料は-80 ° C で保存 - ステンレス製調理器具のエタノール洗浄、乾燥のサンプルのそれぞれの分注 50 mg を各 2 mL ガラスバイアルに使用。これらのサンプルは、連続して各サンプルからますます非極性代謝物を抽出する溶媒の一連を使用して順番に抽出されます。各サンプルに 1 mL の蒸留水、脱水 (H2O) を追加、バイアルのキャップおよびシェーカー テーブルに 2 h のために振る。
- 室温 (RT) で 20 分、それから 30 分間 15,000 × g で遠心分離スタンドへの解決策をできるように揺れ後、デカントし、それぞれから上清を保存します。
注: これらのソリューションは FTICR MS に直接噴射によって挿入されます。 - 今行為 Folch 抽出21 (として知られている MPLEx20) 手順 1.3 の水を 4:3 クロロホルム: メタノール混合 1.3 と 1.4 の-20 ° C の 1 mL を代入の手順を繰り返すことによって抽出された残渣を水します。
注意: クロロホルム、メタノール、可燃性と毒性。皮膚への接触を避けるために、直火を避けるため適切な個人用保護具 (PPE) を使用します。 - 慎重に別の 2 つの溶媒、分離による FTICR 質量分析法による独立した分析のため、視覚的に区別されるレイヤー漏斗または単に慎重なピペッティングで最上位のレイヤーを削除の結果します。
注: クロロホルム含有割合になります下部にメタノール含有率は密度が低く、上になります。 - クロロホルム抽出 (ステップ 1.6) 1:1 のメタノールと水抽出物 (手順 1.4) 2:1 直接注入による FTICR MS のエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 効率を改善するためにメタノールで希釈します。
注: ステップ 1.7 からメタノールを含む画分は希釈する必要はありませんさらにメタノールで。メタノール層は FTICR MS の噴射によって実行されます。
2.FTICR 質量分析
- チューニング ・ ソリューションの 100 μ L に直接注入して FTICR 分析計のキャリブレーション (材料の表を参照してください) FTICR MS に約 100 1,300 Da の質量範囲に 。
- スワニー川フルボ酸標準を準備 (材料の表を参照) 1 mg mL-1ソリューション フィルター純水、20 μ g mL-1メタノール中で得られた溶液を希釈することによって。
- 3.0 μ L 分-1の流量に設定シリンジ ポンプを介して FTICR 分光器と結合 ESI ソースこの最終的な解決策の 23 μ L を直接挿入します。4.4 針電圧に設定 kV、150 m/zと 180 ° C で毛細管ガラスに Q1検査結果のスペクトル解析ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、データの品質を確認します。
- サンプルを実行する前に、サンプリングで持ち越しを監視するのに HPLC グレードのメタノールを使用します。各抽出経由で直噴 3.0 μ L 分-1の流量に設定シリンジ ポンプを介して FTICR 分光器と結合 ESI ソースに 23 μ をご紹介します。4.4 針電圧に設定 kV、150 m/zと 180 ° C で毛細管ガラスに Q1
- サンプルまたは C 濃度の変動を考慮してサンプルのグループごとにイオン蓄積時間 (IAT) を調整します。典型的な値は各サンプルは、平均 0.1 から 0.3 米 144 の収集スキャンのスキャンおよび相同 CH2 を用いた内部校正を行う (すなわち、14 Da 分離) シリーズ。
注: 後 FTICR 質量分析、決定可能か水を結合して、残りの手順を合理化するためにメタノール抽出分数または分数以降の手順の中で独立した保つことができます。長所と短所がそれぞれのアプローチは、長さで議論で説明されます。これを行うには場合、は、水とメタノール抽出画分を組み合わせます。 - コンセントレーターを使用してエキスを乾燥し、抽出物の残りの部分を保存 (〜 1 mL) その後 GC-MS (水、メタノールまたは水 + メタノール)、液体クロマトグラフィー-質量 (クロロホルム) (水 + メタノール) NMR 分析に。
注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできる、材料は-20 ° C で保存
3. FTICR MS データ処理
- 共同大量シフトを削減し、式の割り当て先 Formularity ソフトウェア22を使用してピーク割り当てを標準化データセット全体のすべてのサンプル ピークのリストを配置します。
- Formularity ソフトウェア22を使用して信号を用いた分子式を割り当てる対雑音比が 7 以上の場合、質量測定エラー < 1 ppm と他のすべての要素を除外しながら C、H、O、N、S、P を許可します。
- 複数候補の数式が (500 Da 上頻繁に) 特定大量に返された場合は、サンプリング対象の材料と一貫性のある制約を課します。たとえば、泥炭、典型的な制約を含める: 質量誤差が最小、ヘテロ原子 (N, S, P) の最小数と P が酸化型である必要がある場合、(すなわち式に各 P 原子の少なくとも 4 つの O 原子がある必要があります)。
4 GC-MS の化学誘導体化
- GC-MS オートサンプラー バイアル23HPLC 級ヘキサンの空白のコントロールのサンプルを準備します。溶解 100 mg 脂肪酸メチルエステル (FAMEs: C8 - C28) ヘキサン 200 μ L の標準混合物の保持時間。
- カルボニル基を保護するためにステップ 2.6、ブランク、名声校正サンプル23からメタノール抽出液と水抽出物 (または複合メタノール/水抽出液を用いた場合) のそれぞれに 30 mg mL-1 methoxyamine ピリジン塩酸の 20 μ L を追加します。キャップと瓶をシールします。
注意: ピリジンは毒性と可燃性です。皮膚や眼との接触を防止し、火気を避けるために適切な PPE を着用します。さらに、ピリジンが RT 有害な空気汚染の原因で揮発します。ヒューム フードの下でよく換気されたスペースでのみ動作します。 - 渦は 60 のための 20 の s. Sonicate エキスの抽出 s。その後、100 x g で 90 分の 37 ° C で遠心分離機でエキスを孵化させなさい。
注: 炭水化物または塩の過剰な量を乾燥させて後に代謝産物があります。Sonicating サンプルは、誘導体化試薬に結晶化代謝物を再構築するのに役立ちます。 - インキュベーション後、N の 80 μ L を追加-メチル - N-(トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミド各サンプルに 1% トリメチルクロロシランと、渦を 60 20, Sonicate 抽出物の抽出 s 100 × g で 30 分間、37 ° C で遠心分離機で再度抽出を孵化させなさいと。
- RT (20-24 ° C) にクールな抽出物は、GC-MS オートサンプラー バイアルに転送します。
5. GC/MS 分析
- チューニングし、ベンダーの推奨事項に従って MS を調整 (材料の表を参照) を確認する分析する前に、マシン読んで MS データ正しく。ヘリウム ガス圧が指定した許容範囲内であることを確認します。
- 独立した代謝物 GC カラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 μ m) に。オーブン温度プロトコルを次のように設定: (1) 初期温度 60 ° C 1 分、(2) は 325 ° C まで 10 ° C 分-1、325 ° c 5 分押し (3) の割合でランプが。
- シングル四重極さんセット射出ポート温度 250 ° c を定数と結合した GC を使用して抽出物を分析します。スプリットレス モードで各 derivatized 抽出物の 1 μ L を注入します。
6. GC/MS データ処理
- 彼らは正しくキャプチャされたことを確認するすべてのデータ ファイルを調べます。データを全体で一貫してキャプチャした内部標準保持時間とそれを確認する強度に関して潜在的なシフトに注意を払う、分析。
- 必要な場合、ベンダー特定の MS データ形式を一般的な MS 形式に変換します。プロセス生データ ファイル MetaboliteDetector24名声の社内基準に基づいて保持指標のキャリブレーションを使用しています。すべてのデータ ファイルの保存期間を合わせ後に、、保持指標と FiehnLib 極性代謝物図書館25に対して GC MS スペクトル マッチングによってデコンボリューションと最後に代謝物同定を続行します。
- クロス チェックは、残りのスペクトル マッチングを用いた NIST14 GC-MS ライブラリに対して正体不明の代謝産物。虚偽の識別を除去し、デコンボリューション エラーを減らすのために個別に識別情報を検証します。
7. 液体状態の NMR 解析
- 水抽出液の残りを希釈 (~ 300 μ L) 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 内部標準で 10% (巻/巻)。また、水を組み合わせて、ステップからのメタノール抽出水に 1、resubstitute。ただしこれにより揮発性の化合物のいくつかは凍結乾燥のステップの間に失われる可能性があります。典型的な最終サンプル ボリューム、180-300 μ L の範囲内。
- 高品質 3 mm 外径 (外径) ホウケイ酸ガラス NMR チューブに混合物を転送します。
- NMR 分光計 (理想的には、少なくとも 600 MHz) 5 mm トリプル共鳴耐塩コールド プローブと冷たい炭素前置増幅器を用いたスペクトルを収集します。
- 実験を使用して 1 D 核オーバーハウザー効果分光 (NOESY) プレサチュレーション 4 s 取得時間、1.5 s リサイクル遅延、65,536 の複雑なポイント 512 スキャンと 298 K で 1 D 1H スペクトルを収集します。
- 2 D 1h-13C 25pxn-1 異核単一量子相関 (HSQC) と1h1H 合計相関 (非) スペクトル代謝産物および検証の設定のために収集します。
- プロセス、割り当て、および NMR 解析ソフトウェアを使用してすべてのスペクトルの解析 (材料の表を参照) 内部標準を基準にして強度を定量化します。ライブラリとサンプルの化学シフト、J カップリングおよび強度の情報を照合することによって代謝を識別します。
注: ライブラリは、カスタム対象となる代謝物標準および代謝物追加が定期的に行わによって更に高めます。プロトコルをこの時点で一時停止することができ、材料は、-20 ° C で保存
8. LC-MS リピド分析
- メタノール 200 μ L と 2.5 ステップ中に生成された乾燥クロロホルム抽出を装します。
- 各抽出液の 10 μ L を表面ハイブリッド列 (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μ m 粒子径) を充電逆相を用いた Orbitrap 質量分析計と結合した超高性能液体クロマト グラフに注入します。正および負流量 250 μ L/分使用で 34 分グラデーション (10 mM 酢酸アンモニウムを含む移動相 a: アセトニ トリル/H2O (40: 60); 移動相 b: アセトニ トリル/イソプロパノール (10: 90) 10 mM 酢酸アンモニウムを含む) を設定します。高エネルギー衝突解離と衝突誘起解離イオン化モード。
注意: アセトニ トリルは目、皮膚、呼吸器を刺激です。適切な PPE を着用します。さらに、アセトニ トリルは可燃性です。酸化の代理店に連絡することはできません、燃焼時に有毒ガスが生じることがあります。 - それぞれイオン化モード (正または負) の液体にターゲット ファイル (すなわち、> 25,000 脂質種のリスト) と共に raw の LC ・ MS/MS データ ファイルをアップロードします。Raw ファイルを処理します。手動で適用可能な対応するフラグメント イオン (例えば、脂肪酸アシル鎖) 同位体分離質量 ppm エラー保持時間と、前駆体の場合診断のイオンの存在の MS/MS スペクトルを調べることによって結果の識別を検証します。.Tsv ファイルとして自信を持って識別された脂質の結果のリストをエクスポートします。
注: プロトコルこの時点で一時停止することができます、-20 ° C で保存
9. プロテオミクス解析
- ステップ 2.4, から 20 回追加冷 (-20 ° C) メタノール抽出量と抽出物を洗浄することにより生じるメタノール相の残りの部分から MPLEx プロトコル20に従ってタンパク質を抽出します。
- 条件 C18 SPE 列 3 mL メタノール、1 mL/分以上の速度でステップ 9.1 から抽出物を添加した水で 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 2 mL に 1 mL/50 mg シリカ系吸着剤してください (テーブルの材料) を使用します。
- サンプルの追加により、次の 4 ml 95:4.9:0.1 水: acetonitrile:TFA のコラムを洗浄し、乾燥させてください。SPE カラム下 1.5 mL コレクション チューブを置き、80:19.9:0.1 メタノール: 水: TFA の 1 ml サンプルを溶出します。
- 減圧下で 100 μ L にエキスを凍結乾燥機、濃縮ビシンコニン酸 (BCA) 比色定量法26波長 562 でタンパク質濃度を測定し nm。
- 4 ° C で 10 分間、10,000 × g で遠心分離抽出します。結果として得られる上澄みを廃棄し、5 分は μ L あたり 0.1 μ g ペプチドの最終濃度に水でタンパク質ペレットを再懸濁しますの真空下で残りのペレットを乾燥します。
- ジチオトレイトールを最終濃度 5 mM に追加し、10 倍の 60 ° C で 30 分間 Dilute インキュベート 100 mM NH4HCO38 M 尿素溶液とし, 3 h 1 mM CaCl2とブタのトリプシンの存在下で 37 ° C で、1:50 でタンパク質を酵素比率。
注: プロトコルこの時点で一時停止することがあります、-20 ° C で素材を保存 - 別抽出物を介して液体クロマトグラフィー アセトニ トリル 10 関西研と 500 nL 分-1(B) で移動相 (A) と 0.1% ギ酸水移動相で 0.1% ギ酸の急激な勾配を使ったします。
- M/z線形イオン トラップ (焼入れ) Orbitrap 質量分析計で 400 で 100,000 解像度 400 2,000 m/zからスペクトルを収集、ESI 結合質量分析に結果の溶離液をご紹介します。
- 生スペクトル ファイルを msConvert または ProteoWizard すべての既定のパラメーターを受け入れるを使用して mzML の形式に変換します。普遍的なデータベース検索ツール MSGFPlus を使用して組み立て関連するメタゲノム ゲノムから予測蛋白質シーケンスのターゲット蛋白質のデータベースに対する結果のプロテオームを検索します。
- 一般的な汚染物質 (例えばトリプシン、ケラチン、アルブミン) を追加し、ペプチドの質量スペクトル マッチの統計を改善するためにすべて正確に重複してタンパク質のシーケンスを削除します。どのペプチドの質量スペクトルの一致が最優先を決定する MSGF スペクトルの確率スコアの結果を評価します。MSGFPlus から Q 値を使用すると、1% 偽の発見率 (FDR) 杭全体のデータをフィルター処理します。
10. メタボロミクス解析と代謝ネットワークの構築
- 代謝物のサンプルで現在の単一のデータベースに 3、6、7、および 8 の手順で特定したすべての代謝物の分子式をコンパイルします。手順 9 で確認した酵素の酵素委員会 (EC) または KEGG Orthology (KO) の番号と組み合わせて、これらの代謝物質。代謝経路のセクション27 kegg に対してこの複合データセットを検索します。
- 手動で最もありそうな経路を特定して代謝モデルに統合結果を評価します。
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Representative Results
記述の相補的な分析のプロトコルを行いアメリカ、ミネソタ州のトウヒと泥炭地の応答の下を変更する環境 (トウヒ) サイトに S1 沼の深さが付いている泥炭を比較します。これらの結果は、サイトが代謝物質および酵素活性の異なる場合がありますどのように見るには北欧から永久凍土湿原と湿原からのそれらと比較されます。プロテオミクス解析で 3,312 酵素を同定しました。深さと酵素活性の解析では、15 cm と 45 cm スプルース湿原 (図 1) の酵素の数が急激に低下を明らかにします。
プロテオミクスが示唆されたどの蛋白質を表現、代謝のデータを示すどの反応が実際に発生しています。全体的にみて、NMR、FTICR MS の組み合わせから泥炭のサンプルのすべての 67,040 の代謝物質 (脂質を含む) がわかりました GC-MS と LC MS 解析。これらの分子式を 15,385 化合物 (図 2) に割り当てることができました。データを結合代謝酸化状態、固まり、および化合物クラスが多岐にわたります。
これは通常、識別された式の原子の H/C 比がその原子の O/C 比28に対してプロットされてバン Krevelen ダイアグラム機能を用いた可視化します。(図 3および図 4) 個々 の数式を表すシンボルの色分けによる NOSC を描いた典型的な 2D 形式に追加されたディメンションを含めました。スプルースの沼の深さを増加は大規模な二次代謝産物の合計数の増加 FTICR-MS、特に高い凝縮 (ヴァン Krevelen プロットの左下) によって識別され、式 (プロットの上) を水素化 (図 4).同じ深さに脂質 (図 5)、GC-MS によって識別される小型高エネルギー化合物の数の減少があります。これは、脂質と小さな代謝物表面の泥炭で深い深さに達する前に消費されてまたは深い泥炭の分解速度が表面でより速いその下方の有機化合物が急速に消費されることをお勧めでした。これらの 2 つの競争の仮説間の差別化、サイト自転車競技 C のプロセス レベルの理解が必要です。このようなプロセス レベルの理解は、メタボロミクスとプロテオミクスのデータセットを結合することによってのみ得られます。複合の FTICR MS、GC-MS、LC-MS のクロス検証をしてこれを実現して、NMR 識別 KEGG データベースに対して代謝産物。そう、我々 はトリカルボン酸 (TCA) サイクル、解糖系、糖代謝などの関与する共通の代謝経路である我々 が同定された化合物を見つけます。個々 の代謝に関係するので、酵素を複数経路確認は経路 (図 6) を割り当てることで自信を増加します。
このマッピングによってより深い深度でピルビン酸と他の発酵製品は (図 6) を構築中に表面の泥炭のデンプンおよびショ糖代謝の証拠を見つけます。これらの結果は、糖と他の精力的な代謝物表面の泥炭の劣化し、深い泥炭の深さに到達しない最初の仮説と一致しています。図 5でわかるように、糖 (NOSC = 0) とアミノ酸 (0 < NOSC < 1) 脂質中の泥炭で消費 (-2 < NOSC <-1) の深さを蓄積するが表示されます。これは低い NOSC 化合物保持高度嫌気性でいる間、高 NOSC 化合物がより容易に劣化 NOSC 値に基づく予想と一致 (すなわち、茶限定) する地下の泥炭の条件。このアプローチも正常に異なる環境から土壌の種類を区別します。たとえば、フェンと永久凍土地域の湿原内にあるだけでなく、永久凍土の泥炭地よりも異なる組成する北方泥炭土壌有機物が表示されます。これらの結果は、地面の下 C の微生物分解に大きな影響を与えるこれらの生息地29、示唆そのサイト地球化学のサイト地球化学の違いを示した前の研究と一致しています。
図 1: プロテオミクス解析酵素の数の強い深さ成層を示します。バーは、平均値を示すし、誤差範囲を示す元素の 1 つの標準偏差。微生物が泥炭表面で最も活発なことが示唆されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 泥炭 (< 30 cm) のそれぞれの生息地と同様、半ば (45 cm) とスプルースの湿原から (87 cm) 深い泥炭のそれぞれの手法で同定された化合物の数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ザ ・ ヴァン ・ Krevelen 図 (原子 H/C 対それぞれの O/C 識別分子式) (15 cm) スプルース材沼地それぞれの手法によって特徴付けられる化合物の範囲を示すための深さ。FTICR MS 化合物 (小さな円) の最大数を特定することができます GC-MS (三角形) は区別し、糖を識別するための良い (H/C = 2 と O/C = 1)。Nmr (正方形) は、糖、アミノ酸、ピルビン酸など精力的に重要な化合物の定量的な情報を提供します。LC MS (ダイヤモンド) は、脂質に関する情報を提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ザ ・ ヴァン ・ Krevelen 図 (原子 H/C 対それぞれの O/C 識別分子式) 深い (87 cm) スプルース沼地それぞれの手法によって特徴付けられる化合物の範囲を示すための深さ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 特定された異なった化学クラスの相対割合経由で異なる深さで様々 な技術。バーは各深さ ± 1 標準偏差の平均としてプロットされます。クラス プロットにはには、アミノ酸、スフィンゴ脂質 (Cer)、glycerophosphocholines (PC)、phosphoethanolamines (PE)、diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA)、ジアシルグリセ ロール (DG)、トリアシルグリセ ロール (TG)、および糖が含まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 代謝ネットワークを作成する結果を組み合わせること。NMR (、) と GC-MS (b)、およびトウヒ湿原識別変換の選択数を示す簡略化代謝地図 (c) によって識別される代謝物の深さ分布。緑色のボックスを示し深さ、茶色ボックスとともに減少代謝産物は深さと増加する代謝産物を示します。接続の緑色の矢印は、示された変換 (酵素 EC 番号矢印の横に示されます) を仲介する私たちのデータセットで特定された酵素を示します。灰色矢印でつなぐは、変換の酵素は、私たちのデータセットで識別されていないを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
シングル スループット代謝産物とプロテオームを特徴付けるために使用完全連成解析ストリームは、複雑な生態系の循環が発生して C によって経路への洞察を提供します。異種の行列は、泥炭土、したがって、このメソッドの重要な手順の 1 つは開始泥炭または土材料は均質な高度を確保する上で最初のステップで行われます。集計は、抽出効率を減らすことができますだけでなく、サンプルを粉砕することをお勧めします。これは低 C と十分に均質化するステンレス鋼ボール グラインダーを使用する必要があります高のミネラル内容集約された土壌と土壌の特定問題。実験サイト内の泥炭土壌の空間的異質性が高くなる可能性があります、ため生物学的複製は強くお勧めします。
この方式では 3 つの溶剤: 水, メタノール, 及びクロロホルム、バイアス型化合物を抽出することが可能です。原則として、この逐次抽出法が化合物の極性の広い範囲をカバーを可溶化する必要があります。ただし、これらの溶媒は有機無機複合体または非常に安定した錯体を抽出する最適化されていません。このような化合物は、関心のある、強い酸や塩基など厳しい溶剤が好ましいが厳しい抽出プロセスは、サンプルの化学を変えることができます。抽出シーケンスの終わりにこのような溶剤を組み込むことと、この効果を最小限に抑える可能性があります。さらに、クロロホルムが細胞膜の脂質を溶解することにより臨床的に重要な土壌と泥炭細菌とウイルスの病原体他の病原性の病気の原因となる生物兵器を不活性化します。抽出のプロトコルでクロロホルムを組み込むこと、生物学サンプルの潜在的に世界のさまざまな地域からの病原体による感染のリスクが減ります。死んだ微生物細胞、破片や微粒子抽出についての懸念がある場合は 0.2 μ m のガラス繊維フィルターを介して抽出物をフィルタ リングすることをお勧めします。
プロセス、水とメタノールを合理化するには、段階 4.1 ガスクロマトグラフィー質量分析は、エキスが組み合わせることができます。しかし、これらの抽出物は、ESI ソースのイオン化効率の問題により FTICR 質量分析の分離になりません。GC-MS で複合抽出を実行する利点はより多く代謝産物 (極性の大きい範囲をカバー) が識別されます。この時点での抽出物を組み合わせることの欠点は、メタノールである有機物の微生物処理で重要な主要な代謝産物の 1 つです。水抽出液を個別に実行する必要がある場合は興味の代謝物であるメタノール、ので、メタノールの痕跡は常に組み合わせサンプルで「乾燥後もまま。検体で良いコントロールを持っていることも、サンプルの潜在的な汚染を識別するに役立ちません。
手順準備エキス NMR 分析、ガスクロマト グラフ質量分析のようにどちらか単独での水抽出または結合水の 7.1 およびメタノール抽出液を使用することができます。この方法の欠点は、前項に列挙に似ています。メタノールと水抽出物を組み合わせることの利点は、メタノール画分に溶解したより少なく北極の代謝物のいくつかは識別することです。ただし、凍結乾燥のステップのため、多くの以上の揮発性の化合物は失われます。これは、揮発性脂肪酸の定量実験の重要なコンポーネントは、特定の不利なです。
プロテオミクスを識別するためここでは唯一の完全にトリプシン ペプチドは、検索、したがって内因性ペプチダーゼ活性とソース内の分裂が惜しまれます。その一方で、酸化メチオニンと思われる翻訳後修飾ペプチド候補のサンプリング処理と処理の間にこの変更が生じると。ペプチド溶出区分による酵素の定量化は行うことができますが、このプロジェクトの範囲外にあります。
NOM と微生物パラメーターの解析の多くの最近の進歩は有機態 C を理解するため、さまざまな技法を提供しているサイクリングします。1 つの合理化されたプロトコルではこれらの技術を組み合わせることで行われているプロセスの視点を得るため。代謝解析とプロテオミクス解析をカップリング反応が実際に発生しているれっきとした証拠を魅力的な提供します。代謝解析だけで代謝が高いか比較サイトの中で、治療効果の後で濃度の低いが、これらの変更のための原因を見分けることができない、それは私達を知らせるという制限があります。たとえば、沼の深さの減少砂糖濃度がわかりましたがさらに情報なしそれは不明かどうか深さの減少は、遅い入力または深い泥炭の高速劣化。プロテオームと深度の低下の酵素の発現の解析では、第二の仮説を拒否することが出来ます。むしろ我々 の結果は、深い深さに泥炭制限入力で高速砂糖分解と一致しています。これらの特定の洞察力、各 1 つのユニークな提供とタンデムですべてのテクニックを考慮する場合は可能なだけでなくサイクリング パズル. C の重要な部分
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
泥炭のサンプルを収集することが支援のため j. p. Chanton、J.E. コストカと MM のコルトンに感謝したいと思います。この作品の一部は、DOE のオフィスの科学ユーザー施設オフィスの生物と環境研究主催の環境分子科学研究所行った。バテル契約 DE AC05 76RL01830 下 DOE のなりが運営しています。この作品は、米国エネルギー省科学局、オフィスの生物学・環境研究によって支えられた (付与: デ SC0014416、・ デ ・ SC0012088、DESC0010580 ・ デ ・ SC0004632 ・ デ ・ AC05 00OR22725)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
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