Summary
Denne protokol beskriver et enkelt gennemløb for supplerende analytiske og omik teknikker kulminerede i en fuldt parret karakterisering af naturligt organisk materiale og mikrobielle proteomics i forskellige økosystemer. Denne fremgangsmåde tillader robust sammenligninger til identifikation af metaboliske reaktionsveje og transformationer vigtigt til at beskrive greenhouse gasproduktion og forudsige svar til miljøændringer.
Abstract
Naturlig organisk materiale (NOM) er sammensat af en meget kompleks blanding af tusindvis af organiske forbindelser, som historisk set har vist sig vanskeligt at karakterisere. Men for at forstå de termodynamisk og kinetisk kontrol greenhouse gas (kuldioxid [CO2] og metan [CH4]) produktionen som følge af nedbrydning af NOM, en molekylær-niveau karakterisering kombineret med mikrobielle proteom analyser er nødvendige. Yderligere, klima og miljømæssige ændringer forventes at forurolige naturlige økosystemer, potentielt forstyrre komplekse interaktioner, der påvirker både udbuddet af organisk materiale substrater og mikroorganismer, som udfører transformationerne. En detaljeret Molekylær karakterisering af det organiske stof, mikrobiel proteomics, veje og transformationer som organisk materiale nedbrydes vil være nødvendigt at forudsige den retning og omfanget af virkningerne af miljømæssige ændringer. I denne artikel beskrives en metodologisk overførselshastighed for omfattende metabolit karakterisering i en enkelt prøve ved direkte injektion Fourier transform-ion cyclotron resonance massespektrometri (FTICR-MS), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) og proteomics analyser. Denne metode resulterer i en fuldt parret datasæt, som forbedrer statistiske tillid til udlede veje af organisk materiale nedbrydning, den resulterende CO2 og CH4 produktion priser og deres svar til miljømæssige undertrykkelse af netbårne. Heri præsenterer vi resultaterne af at anvende denne metode på NOM prøver indsamlet fra tørvemoser; protokollen er imidlertid gælder for enhver NOM prøve (fx, tørv, grønklædte jord, havsedimenter, osv.).
Introduction
Globalt, er vådområder anslået til at indeholde 529 Pg kulstof (C), for det meste som organisk C begravet i tørv indskud1. I øjeblikket, fungere sådan tørvemoser som en netto C vask, binding 29 Tg C y-1 i Nordamerika alene1. Dog miljømæssige forstyrrelser såsom dræning, brande, tørke og varmere temperaturer kan udligne denne C vask ved at øge organisk materiale nedbrydning resulterer i øget C tab via drivhusgasser (kuldioxid [CO2] og metan [CH4]) produktion1,2. Klimaændringer kan bidrage til C tab hvis varmere temperaturer eller tørretumbler betingelser stimulere hurtigere C nedbrydning af mikroorganismer. Alternativt, højere temperatur og luftens CO2 kan stimulere primærproduktion til at udskille mere CO2 som organisk kulstof (OC). I hvilket omfang og hvor hurtigt OC derefter nedbrydes til CO2 og CH4 afhænger af det komplekse samspil mellem elektron donor substrater, tilgængeligheden af elektronacceptorer og mikroorganismer, der formidler den transformation. I mange tilfælde mekanismerne er ikke godt karakteriseret, dermed deres reaktion på miljømæssige perturbationer er ikke godt begrænset og det er fortsat uklart, hvad Nettoresultatet af klimaændringer vil være på kulstofbalance i tørvemoser økosystemer.
Den komplekse karakter af naturligt organisk materiale (NOM) har lavet selv identificerer de organiske forbindelser i NOM blandinger historisk vanskelig. De seneste fremskridt har væsentligt forbedret vores evne til at karakterisere forbindelser der traditionelt og til dels fortsat betragtes som genstridige humusfraktionerne eller fulvic forbindelser3,4,5. Vi forstår nu, at mange af disse forbindelser er faktisk microbially tilgængeligt og kan nedbrydes, hvis en passende terminal elektron acceptor (te) er gjort tilgængelige6,7. Beregning af den nominelle oxidationstrin kulstof (NOSC) for et stof, der giver en metrikværdi til at forudsige risikoen for nedbrydning og energiudbytte af te kræves. Det kræver dog et molekylært niveau karakterisering af organisk materiale7. NOSC beregnes ud fra den molekylære formel via følgende ligning7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, hvor z er den netto gebyr. NOSC er korreleret med den termodynamiske drivende kraft8, hvori forbindelser med højere NOSC er nemmere at forringe, mens forbindelser med lavere NOSC kræver mere og mere energiske te for at blive reduceret. Forbindelser med NOSC mindre end −2 kræver en høj energi giver te O2, nitrat eller MnIV, og kan ikke blive forringet af almindeligt forekommende lavere energi giver te såsom FeIII eller sulfat7. Dette er en vigtig overvejelse i de vandmættede anoxiske betingelser findes i vådområder hvor O2 og andre høj energi giver teer er knappe9 og derfor nedbrydningen af lavere NOSC forbindelser under disse betingelser er termodynamisk begrænset. Miljømæssige undertrykkelse af netbårne kan påvirke den termodynamisk tilstand af økosystemet gennem hydrologiske ændringer, der påvirker O2 (den mest energiske elektron acceptor), ændringer i økologisk substrater og elektronacceptorer stilles til rådighed af primære produktion, og i mindre grad af temperaturen. Et vigtigt eksempel på temperatureffekter i vådområde systemer sker med hensyn til den afvejning, der opstår mellem homoacetogenesis (dvs., acetat produktion fra CO2 og H2) og hydrogenotrophic () methanogenesis dvs., CH4 produktion fra CO2 og H2). Ved lave temperaturer fremgår det, at homoacetogenesis er lidt begunstiget, mens varmere temperaturer favor CH4 produktion10. Denne temperatur effekt kan have stor betydning for svaret af økosystemer til skiftende klima, som CH4 er en meget kraftigere drivhusgas end CO211 og dermed stigende produktion af CH4 på bekostning af CO2 på varmere temperaturer kan bidrage til en positiv feedback med klima opvarmning.
Tørvemoser producere globalt betydelige mængder af CO2 og CH46via mikrobielle respiration af naturligt forekommende organiske noget. NOSC af organisk kulstof substrater bestemmer den relative andel af CO2: CH4 produceret, hvilket er en afgørende parameter på grund af den højere radiative tvinger CH4 i forhold til CO211, men også fordi modellering bestræbelser har identificeret dette forhold som en afgørende parameter for estimering C flux i tørvemoser12. I mangel af terminal elektronacceptorer end CO2, det kan påvises ved elektron balance at organisk C substrater med NOSC > 0 vil producere CO2: CH4 > 1, organisk C med NOSC = 0 producerer CO2 og CH4 i equimolar forhold, og økologiske C med NOSC < 1 vil producere CO2: CH4 < 113. Nedbrydning af OC i naturlige økosystemer er medieret af mikroorganismer, således at selv når nedbrydning af et bestemt stof er termodynamisk muligt, det kinetically begrænses af aktivitet af mikrobielle enzymer og under iltfattige forhold, af den termodynamiske drivkraft (dvs.NOSC)7. Indtil nu har det udfordrende at fuldt ud for at beskrive det organiske stof, fordi mangfoldighed af forbindelser kræver forskellige supplerende teknikker til deres karakterisering. De seneste fremskridt har lukket hullet; ved hjælp af en suite af analytiske teknikker kan vi analysere en bred vifte af organiske forbindelser giver molekylært niveau karakterisering og i nogle tilfælde kvantificering, fra små primære metabolitter som glukose op til 800 Da poly-heterocycles. Tidligere ville sådanne store komplekse molekyler have været kendetegnet simpelthen så lignin-lignende eller tannin-lignende og antages at have været genstridige. Molekylær-niveau karakterisering, men tillader beregning af NOSC for selv disse store komplekse molekyler. Disse NOSC værdier er lineært korreleret med den termodynamiske drivende kraft giver mulighed for en vurdering af kvaliteten af organisk materiale til nedbrydning, som i mange tilfælde afslører, at disse komplekse molekyler kan faktisk være microbially nedbrydelige selv under de iltfattige forhold i vådområder.
Siden indførelsen af O2 tillader organisk materiale af næsten alle naturligt observerede værdier for NOSC at være nedbrydes, fokuserer heri vi på ændringer i organisk materiale og mikrobielle proteomics, som er tilbøjelige til at være de primære drivere i vådområde (dvs., begrænset O2) systemer. Men alle de teknikker, som vi vil diskutere kan anvendes til organisk materiale fra ethvert økosystem. Almindeligt, bulk målinger baseret på optiske og fluorescens analyser har været brugt til at vurdere organisk stof kvalitet3,14. Når du bruger bulk målinger som disse, men går fine detaljer tabt som stort antal molekyler er kategoriseret sammen under generiske udtryk som humics eller fulvics. Definitioner af disse kategorier er ikke godt begrænsede og faktisk kan variere fra undersøgelse til undersøgelse gør sammenligninger umulige. Yderligere, bulk målinger ikke give den molekylære detaljer nødvendige for beregning af termodynamik for systemet og derfor ikke kommer op virkelig vurdere organisk stof kvalitet15.
Enkelte teknikker som Fourier transform ion cyclotron resonance massespektrometri (FTICR-MS), Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, gaskromatografi masse massespektrometri (GC-MS) og væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) gør give sådanne Molekylær-detaljeringsgrad. Mens hver af disse teknikker præsenterer sine egne begrænsninger, sætter de også deres egne styrker, der kan udnyttes i en integreret tilgang til at opnå den fine molekylære detaljer nødvendige for kvantificering af organisk stof kvalitet i en streng termodynamisk forstand . GC-MS er nyttig til at identificere kritiske lille metabolitter, der er tilbøjelige til at have proksimale indflydelse på CO2 og CH4 produktion (fx, glukose, acetat, osv.); Men, GC-MS kræver kontrol mod en standard og er derfor begrænset til allerede kendte stoffer findes i databasen forhindrer identifikation af nye forbindelser. Desuden, GC-MS er en semi-kvalitative teknik giver inferens om ændringer i relative koncentrationer, men ikke med faktiske koncentration oplysninger nødvendige for beregning af Gibbs frie energi for eksempel. Endelig, GC-MS kræver forædling af molekyler inden analyse, som begrænser opløsning til forbindelser mindre end ~ 400 Da og flygtige alkoholer er tabt under trinnet til tørring.
Endimensional (1D) 1H flydende tilstand NMR tillader meget kvantitative karakterisering af små metabolitter (herunder primær små molekylvægt metabolitter og flygtige stoffer som alkoholer, acetat, acetone, formate, pyruvat, succinat, kort-lænket fedtsyrer, samt en vifte af kulhydrater notorisk fraværende eller kompromitteret fra MS-baserede metoder) og deres koncentrationer er især nyttig til beregning af termodynamiske parametre. Endnu, som GC-MS, 1D NMR af komplekse blandinger kræver standardisering i forhold til en database og derfor alene tillader ikke nem identifikation af nye forbindelser, der sandsynligvis vil være rigelige i komplekse naturlige og skiftende økosystemer. Derudover NMR er mindre følsomme end de MS-baserede teknikker og derfor kvantitative metabolit profilering er opnået kun over 1 µM ved hjælp af NMR systemer udstyret med helium-cooled cold-sonder. Ikke meget værdsat, nogle NMR kolde-sonder er salt-tolerant og tillade miljømæssige blanding analyse i overværelse af millimolar salt koncentrationerne anvendes i mindre diameter (< 3 mm ydre diameter) prøve rør16. Men en yderligere komplikation af NMR er der store mængder af Paramagnetiske metaller og mineraler (f.eks., Fe og Mn over 1-3 wt %), som kan være rigelige i højlandet jorder, kan udvide spektrale beskrivere og komplicere fortolkningen af NMR-spektre . Ved hjælp af faste fase ekstraktion (SPE) kan aide i fortolkningen af både NMR- og MS-baseret metabolomics metoder ved at reducere de mineralske salte og øge spektrale kvalitet.
FTICR-MS ved direkte injektion er en yderst følsom teknik i stand til at opdage titusinder af metabolitter fra en enkelt prøve, men det ikke fange de kritiske lille metabolitter som acetat, pyruvat, succinat og er notorisk vanskeligt at brug for sukker og andre kulhydrater17, eller indeholder det kvantitative oplysninger. Men i modsætning til de andre teknikker, FTICR-MS udmærker sig ved at identificere og tildele roman forbindelser molekylformel og derfor identificerer det største antal forbindelser mere molekylære oplysning end nogen af de andre beskrevne teknikker. Dette er nyttigt, fordi de molekylære oplysningerne fra FTICR-MS (og andre teknikker) kan bruges til at beregne NOSC, som er relateret til den termodynamiske drivende kraft for sandsynligheden for visse reaktioner8 og deres priser under visse forhold7. Derudover ved at koble FTICR-MS med adskillelse teknikker, såsom LC sammen med tandem MS, kan kvantitative strukturelle oplysninger nås, modregning nogle af ulemperne ved denne teknik. LC-MS er nyttigt til identificering af lipid-lignende forbindelser og andre metabolitter, som ikke er godt præget af nogen af de andre metoder. Kobling LC FTICR-MS eller LC-MS med en brøkdel samler og indsamle brøkdele af specifikke ubekendte af interesse for strukturelle udredning af todimensionale (2D) flydende tilstand NMR er den ideelle situation for at identificere og kvantificere ukendte forbindelser18 ,19. Dette er dog en meget tidskrævende skridt, der kunne bruges, hvis og når det er nødvendigt. Taget enkeltvis, hver af disse teknikker giver et anderledes øjebliksbillede af det organiske materiale, og ved at integrere dem, kan vi opnå en mere komplet forståelse end at bruge nogen af teknikkerne i isolation.
Mens de termodynamiske betragtninger de ultimative begrænsninger på hvad transformationer er muligt i et system, er organisk materiale nedbrydning medieret af mikroorganismer hvis enzym aktiviteter kontrollere reaktion priser. Således fuldt ud forstå kontrol på organisk materiale nedbrydning og i sidste ende greenhouse gas (CO2 og CH4) produktionen fra vådområder kræver en integreret omik tilgang til karakterisering af mikrobielle enzym aktiviteter samt metabolitter. I denne artikel vil beskrive vi en metode til at opnå en omfattende analyse fra en enkelt prøve ved hjælp af en sekventiel tilgang, der resulterer i en fuldt parrede analyse. Denne tilgang udvider på metabolit, proteiner og lipid udvinding (MPLex) protokol, hvor proteomics blev kombineret med GC-MS og LC-MS20 at identificere små metabolitter, proteiner og lipider ved at indarbejde kvantitative metabolit oplysninger via NMR og identifikation af større sekundære metabolitter via FTICR-MS. lidt anderledes end MPLex, begynder vi protokol med en vand udvinding og derefter bruge sekventielle ekstraktion med i stigende grad ikke-polære opløsningsmidler. Alle ekstraktioner er udført på en enkelt prøve, som sparer prøve, når mængderne er begrænset eller vanskeligt at opnå og nedsætter eksperimentelle fejl indført gennem variation blandt delprøver fra heterogen prøve matricer (fx, jord og tørv) eller forskelle i opbevaringsforhold og varighed.
Endelig, ved at koble OM analyser med proteomics analyser af den mikrobielle samfund, kan vi bygge metaboliske netværk, der beskriver de veje og transformation af organisk materiale nedbrydning. Dette gør det muligt for os at teste specifikke hypoteser om hvordan perturbationer til systemet vil påvirke ultimative CO2 og CH4 produktion gennem ændring af de tilgængelige økologisk substrater, elektronacceptorer og de mikrobielle samfund mægle reaktioner via aktiviteten af enzymet katalysatorer.
Det overordnede mål med denne metode er at give et enkelt gennemløb protokol til at analysere metabolitterne, lipider og mikrobielle proteiner fra en enkelt prøve, hvorved der skabes et fuldt parrede datasæt for opbygning af metaboliske netværk mens begrænsende analytiske fejl .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sekventiel udvinding af organisk stof fra jord, sedimenter eller tørv
- Indsamle jord, sedimenter eller tørv via coring og opdele kerner ifølge hypotesen bliver testet (f.eks., dybde). Butik prøver i Teflon belagt containere og fryse ved-80 ° C til opbevaring inden analyse.
Bemærk: Ca 25 mg C er nødvendig for denne protokol. For tørv (typisk 45% C) er 50 mg tørret tørv påkrævet. Større mængder af prøven kan være behov for lavt organisk prøver som mineralsk eller skovklædte højlandet jord afhængigt af C indhold (op til 5 g). Fordi ekstraktion med organiske opløsningsmidler vil trække enhver polyethylenglycol (PEG) i uddrag, som vil påvirke negativt ionisering under trin 2.4, er det vigtigt at undgå at lade prøver at kontakte plast på ethvert tidspunkt under indsamling, opbevaring eller udvinding. - Når du er klar til at analysere prøverne, fryse tør til konstant vægt og derefter male prøver i en høj hastighed bolden ved hjælp af rustfrit stål slibning bolde at homogenisere og bryde op nogen aggregater.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt på dette punkt og materialet opbevares ved-80 ° C. - Ved hjælp af en ethanol-vasket rustfrit stål køkkenredskaber, alikvot 50 mg af hvert af de tørrede prøver i individuelle 2 mL hætteglas. Disse prøver vil udvindes sekventielt, ved hjælp af en række opløsningsmidler til fortløbende uddrag i stigende grad ikke-polære metabolitter af hver prøve. Der tilsættes 1 mL destilleret, afgassede vand (H2O) til hver prøve, cap hætteglassene og ryste i 2 timer på en shakerbord.
- Efter omrystning give løsninger til at stå ved stuetemperatur (RT) for 20 min. derefter centrifugeres ved 15.000 x g i 30 min, dekanteres og gemme supernatanten fra hver.
Bemærk: Disse løsninger vil blive injiceret i FTICR-MS ved direkte injektion. - Adfærd en Folch udvinding21 (også kendt som MPLEx20) på nu vand udpakkede restkoncentrationer ved at gentage trin 1.3 og 1.4 erstatte 1 mL af en-20 ° C 4:3 chloroform: methanol blanding for vand i trin 1.3.
Forsigtig: Chloroform og methanol er både yderst brandfarlige og giftige. Bruge relevante personlige værnemidler (PPE) til at undgå kontakt med huden og undgå åben ild. - Forsigtigt adskille de to resulterer opløsningsmiddel lag, som vil være visuelt skelnes, for særskilt analyse af FTICR-MS ved hjælp af en adskillelse tragt eller blot fjerne det øverste lag af omhyggelige pipettering.
Bemærk: Chloroform-holdige brøkdel vil være i bunden, mens methanol-holdige brøken er mindre tæt og vil være på toppen. - Fortyndes chloroform ekstrakt (trin 1,6) 1:1 i methanol og vand ekstrakt (trin 1.4) 2:1 i methanol forbedre electrospray Ionisation (ESI) effektivitet for FTICR-MS ved direkte injektion.
Bemærk: Den methanol-holdige fraktion fra trin 1.7 behøver ikke at blive udvandet yderligere i methanol. Methanol lag vil blive kørt ved direkte injektion på FTICR-MS.
2.FTICR-MS analyse
- Kalibrer FTICR spektrometer ved direkte injektion 100 µL af en tuning løsning (Se Tabel af materialer) strækker sig over en massiv vifte af ca 100-1.300 Da ind i FTICR-MS.
- Forberede Suwannee floden fulvussyre standard (Se Tabel af materialer) ved at gøre en 1 mg mL-1 løsning i ultrarent filtreret vand og derefter fortynde den resulterende løsning til 20 µg mL-1 i methanol.
- Direkte injicere 23 µL af denne endelige løsning på de ESI kilde koblet til FTICR spektrometer gennem en sprøjte pumpen indstillet til en gennemstrømningshastighed på 3,0 μL min-1. Sæt nål spænding til +4.4 kV, Q1 til 150 m/z og glas kapillær ved 180 ° C. Inspicere resulterende spectra ved hjælp af analyse software (Se Tabel af materialer) at bekræfte kvaliteten af dataene.
- Brug HPLC grade methanol før du kører prøver og hele prøveudtagning overvåge fremførsel. Indføre 23 μL af hver ekstrakt via direkte indsprøjtning til de ESI kilde koblet til FTICR spektrometer gennem en sprøjte pumpen indstillet til en gennemstrømningshastighed på 3,0 μL min-1. Sæt nål spænding til +4.4 kV, Q1 til 150 m/z og glas kapillær ved 180 ° C.
- Justere ion akkumulering tid (IAT) for hver prøve eller gruppe af prøver for at tage højde for variation i C koncentration. Typiske værdier er mellem 0,1 til 0,3 s. indsamle 144 scanninger for hver prøve, gennemsnitlige scanninger og derefter foretage en intern kalibrering ved hjælp af homologe CH2 (dvs., 14 Da separation) serien.
Bemærk: Efter FTICR-MS analyse, beslutningen kan træffes til enten Kombiner vand og methanol udvundet brøker for at strømline de resterende trin eller fraktioner kan holdes adskilt hele efterfølgende trin. Fordele og ulemper ved hver metode er beskrevet udførligt i diskussionen. Hvis dermed Kombiner vand og methanol-udvundet fraktioner. - Tør ekstrakter ved hjælp af en koncentrator og gemme resten af uddrag (~ 1 mL) for efterfølgende GC-MS (vand, methanol eller vand + methanol), LC-MS (chloroform) og NMR (vand + methanol) analyse.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt på dette punkt og materialet opbevares ved-20 ° C.
3. FTICR-MS databehandling
- Co justere alle prøve peak lister for hele datasættet at reducere masse forskydninger og standardisere peak tildelinger ved hjælp af Formularity software22 foran formlen tildeling.
- Bruge Formularity software22 tildele Molekylær formel ved hjælp af en signal-støj-forholdet er større end 7, masse måling fejl < 1 ppm, og så C, H, O, N, S og P mens udelukke alle andre elementer.
- Hvis flere kandidat formler er returneret for en given masse (hyppige over 500 Da) pålægge begrænsninger i overensstemmelse med det materiale, der indgik i stikprøven. For eksempel i tørv, typisk begrænsninger omfatter: laveste masse fejl, laveste antal heteroatomer (N, S, P), og når der forekommer Pedersen skal være i oxideret form (dvs., der skal være mindst 4 O atomer for hvert P-atom i formlen).
4. kemiske forædling for GC-MS
- Forberede Tom kontrolprøver af HPLC-renhed hexan i GC-MS autosampler hætteglas23. Opløs 100 mg fedtsyre methylestere (FAMEs: C8 - C28) blanding retentionstid standard i 200 µL af hexan.
- For at beskytte carbonyl grupper, tilføje 20 μL af 30 mg mL-1 methoxyamine hydrochlorid i pyridin til hver af methanol ekstrakter og vand ekstrakter (eller kombinerede methanol/vand ekstrakter hvis bruger) fra trin 2.6, tomme og berømmelse kalibrering prøver23. Forsegle hætteglas med hætter.
Forsigtig: Pyridin er både yderst giftige og brandfarlige. Bære passende PPE for at forhindre huden eller øjenkontakt og undgå åben ild. Derudover volatilizes pyridin på RT forårsager skadelig luftforurening. Virker kun i godt ventilerede rum under et stinkskab. - Vortex ekstrakter til 20 s. Sonicate ekstrakter til 60 s. Altså Ruger ekstrakter i en centrifuge ved 37 ° C til 90 min. ved 100 x g.
Bemærk: En stor mængde af kulhydrater eller salte kan forårsage metabolitter til crystalize efter at blive tørret ned. Sonicating prøverne vil hjælpe til at rekonstruere de krystaliseres metabolitter i det derivatizing reagens. - Efter inkubering tilsættes 80 μl N-methyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorsilan til hver prøve, vortex ekstrakter til 20 s. Sonicate ekstrakter til 60 s og inkuberes ekstrakter igen i en centrifuge ved 37 ° C i 30 min. ved 100 x g.
- Cool ekstrakter til RT (20-24 ° C), derefter overføre til GC-MS autosampler hætteglas.
5. GC-MS analyse
- Tune og kalibrere MS efter kreditor anbefalinger (Se Tabel af materialer) inden analyse for at sikre maskinen læser MS data korrekt. Kontroller, at helium gas pres er inden for angivne tolerance.
- Separate polar metabolitter på en GC kolonne (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Sæt ovn temperatur protokol som følger: (1) indledende temperatur på 60 ° C i 1 min, (2) rampe til 325 ° C med en hastighed på 10 ° C min-1, og (3) hold på 325 ° C i 5 min.
- Analysere ekstrakter ved hjælp af en GC koblet til en enkelt Quadrupol MS. Set injektion port temperatur til en konstant 250 ° C. Der indsprøjtes 1 μL af hver derivatized ekstrakt i tilstanden splitless.
6. GC-MS databehandling
- Inspicere alle datafiler for at sikre, at de korrekt blev erobret. Være opmærksom på potentielle forskydninger med hensyn til intern standard retentionstider og intensiteter at bekræfte, at, som dataene blev fanget konsekvent i hele analysen.
- Konvertere leverandør specifikke MS dataformat til en generel MS-format, hvis det kræves. Processen rå datafiler ved hjælp af MetaboliteDetector24 kalibrering fastholdelse indeks baseret på FAME interne standarder. Efter justering retentionstider af alle datafiler, fortsætte med deconvolution og endelig metabolit identifikation af matchende fastholdelse indekser og GC-MS spectra mod FiehnLib polar metabolit bibliotek25.
- Cross-check resterende uidentificerede metabolitters mod NIST14 GC-MS biblioteket ved hjælp af spektrale matchende. Validere identifikationer individuelt for at eliminere falske identifikationer og reducere deconvolution fejl.
7. flydende tilstand NMR analyse
- Fortynd resten af vandet ekstrakter (~ 300 µL) med 10% (vol/vol) med en 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 intern standard. Alternativt kan du kombinere vand og methanol ekstrakter fra trin 1 derefter resubstitute i vand. Gør det dog, kan nogle af de flygtige forbindelser være tabt under freeze-drying trin. Typiske slutprøven diskenheder er i intervallet 180-300 µL.
- Overfør blandingen ind i en høj kvalitet 3 mm ydre diameter (OD) borsilikatglas NMR rør.
- Indsamle spectra ved hjælp af et NMR-spektrometer (ideelt mindst 600 MHz) udstyret med en 5 mm tredobbelt resonans salt-tolerant kolde sonde og en kold-carbon forforstærker.
- Indsamle 1D 1H spectra ved hjælp af en 1 D nukleare Overhauser kraft spektroskopi (NOESY) presaturation eksperiment på 298 K med en 4 s erhvervelse tid, 1,5 s genanvende forsinkelse, 65.536 komplekse point og 512 scanninger.
- Indsamle 2D 1H -13C heteronuclear single-quantum korrelation (HSQC) og 1H -1H samlede korrelation (TOCSY) spektre kan hjælpe i tildeling af metabolitter og validering.
- Behandle, tildele og analysere alle spektre ved hjælp af NMR analyse software (Se Tabel af materialer) at kvantificere støtteintensiteter i forhold til den interne standard. Identificere metabolitter ved at matche kemiske Skift, J-kobling og intensitet information i prøver mod biblioteket.
Bemærk: Biblioteket forstærkes yderligere af brugerdefinerede målrettede metabolit standarder og metabolitten tilføjelser på en regelmæssig basis. Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette punkt og materialet opbevares ved-20 ° C.
8. LC-MS Lipidomics analyse
- Rewet det tørrede chloroform ekstrakt genereret under trin 2,5 med 200 μl af methanol.
- Tilføre en ultra-performance flydende chromatografen koblet til en Orbitrap massespektrometer ved hjælp af en omvendt fase opkrævet overflade hybrid kolonne (3,0 mm × 150 mm × 1.7 μm partikelstørrelse) 10 μL af hver udskrift. Angive en 34-min gradient (mobil fase A: acetonitril/H2O (40/60) indeholdende 10 mM ammoniumacetat; Mobil fase B: acetonitril/isopropanol (10:90) der indeholder 10 mM ammoniumacetat) med en væskehastighed på 250 µL/min. brug, både negative og positive ionisering tilstande med højere energi kollision dissociation og kollision induceret dissociation.
Forsigtig: Acetonitril er øjet, huden, og respiratoriske irriterende. Bære passende PPE. Derudover er acetonitril brændbart. Tillad ikke for at kontakte oxidationsmidler, giftige dampe kan fremstilles under brændingen. - Uploade de rå LC-MS/MS datafiler i væske sammen med destinationsfilen (dvs., liste over > 25.000 lipid arter) for den respektive ionisering tilstand (positive eller negative). Proces den rå fil. Manuelt validere de resulterende identifikationer ved at undersøge MS/MS-spektre for tilstedeværelsen af diagnostiske ioner, hvis relevant, matchende fragmentioner (f.eks. fed acyl kæder), isotopisk separation, masse ppm fejl af prækursorer og for retentionstid. Eksportere resulterende liste over trygt identificerede lipider som .tsv fil.
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette tidspunkt og gemme materialet på-20 ° C.
9. Proteomics analyser
- Uddrag proteiner ifølge MPLEx protokol20 fra resten af den methanol fase som følge af trin 2.4, ved at vaske ekstrakt med 20 gange ekstrakt mængden af ekstra kolde (-20 ° C) methanol.
- Bruge en 1 mL/50 mg silica-baserede sorptionsmiddel (Se Tabel af materialer) til betingelse C18 SPE kolonner med 3 mL methanol, 2 mL af 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i vand, efterfulgt af tilsætning af ekstrakt fra trin 9.1 med en sats på højst 1 mL/min.
- Efter tilsætning af prøven, vaske kolonnen med 4 mL af 95:4.9:0.1 vand: acetonitrile:TFA, så giver mulighed for at tørre. Placere en 1,5 mL collection tube under kolonnen SPE og elueres prøve med 1 mL af 80:19.9:0.1 methanol: vand: TFA.
- Koncentrat ekstrakter til 100 µL under vakuum-assisteret fryse tørretumbler, derefter måle proteinkoncentration af bicinchoninic syre (BCA) kolorimetriske assay26 ved en bølgelængde på 562 nm.
- Centrifuge uddrag på 10.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Resulterende supernatanten og tør de resterende pellet under vakuum for 5 min. resuspenderes protein i vand til en endelig koncentration på 0,1 µg peptid pr. µL.
- Tilføje dithiothreitol til en endelig koncentration på 5 mM og Inkuber ved 60 ° C i 30 min. Dilute 10-fold med 100 mM NH4HCO38 M urea-opløsning og inkuberes ved 37 ° C til 3 h 1 mM CaCl2 og svin trypsin på en 1:50 enzym til protein forholdet.
Bemærk: Protokol kan afbrydes midlertidigt på dette tidspunkt og gemme materialet på-20 ° C. - Separat ekstrakter via væskekromatografi ved hjælp af en eksponentiel forløb af en 0,1% myresyre i vand Mobil fase (A) og en 0,1% myresyre i acetonitril Mobil fase (B) på 10 kpsi og 500 nL min-1.
- Hældes en ESI-kombineret massespektrometer indsamling spektre fra 400-2.000 m/z med 100.000 opløsning på m/z 400 i en lineær ion trap (LTQ) Orbitrap massespektrometer resulterende elueringsvæsken.
- Konvertere RAW spectra filer mzML formatet ved hjælp af msConvert eller ProteoWizard at acceptere alle standardparametre. Brug værktøjet universal database Søg MSGFPlus for at søge resulterende proteomes en målrettet protein database over protein sekvenser forudsagt fra relevante metagenome samlet genomer.
- Føj fælles forurenende stoffer (fx, trypsin, keratin, albumin) og fjerne alle præcis duplikerede protein sekvenser for at forbedre peptid-til-mass-spektrum match statistik. Evaluere de resulterende MSGF spektrale sandsynlighed scores for at afgøre, hvilke peptid-til-mass-spektrum match er bedst. Brug Q-værdien fra MSGFPlus til at filtrere hele data bunken til 1% falsk opdagelse sats (FDR).
10. Metabolomics analyse og metaboliske netværksopbygning
- Kompiler alle metabolit molekylformel identificerede i trin 3, 6, 7 og 8 i en enkelt database af metabolitter til stede i prøverne. Kombinere disse metabolitter med enzym Kommissionens (EF) eller KEGG Orthology (KO) antallet af enzymer identificerede i trin 9. Søg denne kombinerede datasæt mod KEGG27 database, stofskifteveje sektion.
- Manuelt evaluere resultaterne for at identificere mest sandsynlige veje og integrere i en metabolisk model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udførte den beskrevne supplerende analyse protokol og sammenlignet tørv med dybde i S1 mosen i webstedet Gran og tørvemoser svar Under skiftende miljøer (Gran) i Minnesota, USA. Disse resultater er sammenlignet med dem fra en permafrost Mose og fen fra det nordlige Sverige at vise, hvordan websteder kan variere i metabolit og enzym aktiviteter. Vi identificerede 3,312 enzymer i proteomics analyser. En analyse af enzymer aktiviteter med dybde afslører, at antallet af enzymer afviser skarpt mellem 15 cm og 45 cm i Gran mosen (figur 1).
Mens proteomics resultaterne angiver, hvilke proteiner er udtrykt, viser de metaboliske data, hvilke reaktioner forekommer faktisk. Alt i alt, vi identificeret 67,040 metabolitter (herunder lipider) i alle tørv prøver fra kombinationen af FTICR-MS, NMR, GC-MS, og LC-MS analyser. Af disse var vi i stand til at tildele molekylformel 15,385 forbindelser (figur 2). Den kombinerede metaboliske data strækker sig over en række oxidationstrin, masserne og sammensatte klasser.
Dette er typisk visualiseres ved hjælp af en van Krevelen diagram som atomare H/C forhold til identificerede formel afbildes mod deres atomare o/c nøgletal28. Vi har inkluderet en ekstra dimension til den typiske 2D format, skildrer NOSC ved hjælp af farvekodningen de symboler, der repræsenterer individuelle formel (figur 3 og figur 4). Med stigende dybde i Gran mosen, der er en stigning i det samlede antal store sekundære metabolitter identificeret ved FTICR-MS, specielt i meget kondenseret (nederste venstre af van Krevelen plot) og hydrogenerede formler (toppen af plot) (figur 4 ). Over de samme dybder er der et fald i antallet af små meget energiske forbindelser identificeret ved GC-MS og lipider (figur 5). Dette kunne tyde på, enten at lipider og små metabolitter forbruges i den overflade tørv før nå dybere dybet eller at nedbrydning satser i de dybe tørv er hurtigere end i overfladen så nedadgående advecting forbindelser er hurtigt forbruges. Skelne mellem disse to konkurrerende hypoteser kræver en procesniveau forståelse af C cykling på webstedet. Sådan en proces-niveau forståelse kan kun opnås ved at koble metabolomics og proteomics DataSet. Vi opnå dette ved cross-validering af de kombinerede FTICR-MS, GC-MS, LC-MS, og NMR identificeret metabolitter mod KEGG database. Dermed finde vi, at de forbindelser, vi identificeret er involveret i fælles metaboliske reaktionsveje som tricarboxylic syre (TCA) cyklus, glykolyse og sukker metabolismen. Da enkelte metabolitter kan være involveret i øger flere veje bekræftelse med enzymerne, der vores tillid til tildeling af veje (figur 6).
Gennem denne kortlægning finder vi beviser af saccharose og stivelse metabolisme i overfladen tørv, mens pyruvat og andre gæringsprodukter i dybere dybet opbygge (figur 6). Disse resultater stemmer overens med den første hypotese, sukker og andre energiske metabolitter er forringet i de overflade tørv og ikke nå dybere tørv dybder. Som det kan ses i figur 5, sukker (NOSC = 0) og aminosyrer (0 < NOSC < 1) forbruges i overfladen tørv, mens lipider (-2 < NOSC < -1) synes at akkumulere med dybde. Dette er i overensstemmelse med forventninger baseret på NOSC værdier at højere NOSC forbindelser er mere let forringet, mens lavere NOSC forbindelser fortsætter i den stærkt anaerobe (dvs., te-limited) betingelser af undergrunden tørv. Denne tilgang skelner også med held mellem jordtyper fra forskellige miljøer. For eksempel, ser jordbundens organiske materiale fra boreal tørvemoser kompositorisk anderledes end permafrost tørvemoser, samt inden for fen og Mose i regionen permafrost. Disse resultater stemmer overens med en tidligere undersøgelse, der viste forskelle i stedet Geokemi mellem disse habitater29, tyder på, at webstedet Geokemi har en stor effekt på mikrobiel nedbrydning af C under jorden.
Figur 1 : Proteomics analyse viser stærk dybde stratificering af antallet af enzymer. Angiver gennemsnit og fejllinjer angive én standardafvigelse af mængder. Dette tyder på, at mikroorganismer er mest aktive i tørv overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Antallet af forbindelser identificeret ved hver teknik i overfladen tørv (< 30 cm) af hver naturtype samt de mid (45 cm) og dyb (87 cm) tørv fra Gran mosen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : The van Krevelen diagram (atomic H/C vs o/c hver identificeret Molekylær formel) til overfladen (15 cm) SPRUCE Mose dybde for at demonstrere dækning af forbindelser karakteriseret ved hver teknik. FTICR-MS gør det muligt for os at identificere de største antal forbindelser (små cirkler), mens GC-MS (trekanter) er godt for differentiering og identificere sukker (H/C = 2 og o/c = 1). NMR (firkanter) spektroskopi giver kvantitative oplysninger om energisk vigtige forbindelser såsom sukker, aminosyrer, pyruvat, osv. LC-MS (diamanter) indeholder oplysninger om lipider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : The van Krevelen diagram (atomic H/C vs o/c hver identificeret molekylformel) for dybet (87 cm) SPRUCE Mose dybde for at demonstrere dækning af forbindelser karakteriseret ved hver teknik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Den relative fraktion af forskellige kemiske klasser identificeret via de forskellige teknikker i de forskellige dybder. Barer er afbildet som gennemsnit for hver dybde ± én standardafvigelse. Klasser afbildet omfatter aminosyrer, sphingolipids (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (GD), triglycerider (TG) og sukker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Kombinerer resultaterne for at oprette en metabolisk netværk. Dybde distributioner af metabolitter identificeret ved NMR (en) og GC-MS (b) og et forenklet metaboliske kort (c) viser et udvalgt antal af transformationer identificeret på Gran mose. Grønne kasser angive metabolitter, der falder med dybden, brune kasser angive metabolitter, der stiger med dybden. Grøn forbindende pile angiver enzym identificeret i vores datasæt, der mægle den angivne transformering (enzym EF tal angivet ved pile). Grå forbindende pile angiver transformeringer for som enzymer ikke identificeret i vores datasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-overførselshastighed, fuldt kombineret analyse stream bruges til at karakterisere metabolitter og proteomet giver indsigt i de veje, af hvilken C cykling foregår i et komplekst økosystem. Jord og tørv er heterogene matricer, og en af de afgørende trin i denne metode opstår derfor i de tidligste trin for at sikre, at start tørv eller jord materiale er meget homogene. Det er at foretrække at male prøven samt aggregater kan reducere ekstraktionseffektivitet. Dette er et særligt problem for aggregerede jord og jord med lavt C og høj mineral indhold, der kan kræve brug af en rustfrit stål bolden grinder til tilstrækkeligt homogeniseres. Fordi rumlige heterogenitet af jord og tørv i en eksperimentel site kan være høj, er biologiske replikater stærkt anbefales.
Denne metode udnytter tre opløsningsmidler: vand, methanol og chloroform, som bias typer af forbindelser det er muligt at udtrække. I princippet bør dette sekventiel ekstraktion metode solubilize forbindelser, der dækker en bred polaritet vifte. Men disse opløsningsmidler er ikke optimeret til udvinding af organo-mineral komplekser eller stærkt stabiliseret komplekser. Hvis sådanne forbindelser er af interesse, hårdere opløsningsmidler som stærke syrer og baser er at foretrække, men hårdere udvinding processer kunne ændre kemien i prøverne. Indarbejde disse opløsningsmidler i slutningen af udvinding sekvens kan minimere denne effekt. Derudover vil chloroform inaktivere klinisk vigtige jord og tørv bakterielle og virale patogener og andre patogene sygdomsfremkaldende biologiske agenser ved at opløse cellens membran lipider. Således vil indarbejde chloroform i udvinding protokollen reducere risiciene ved biologiske undersøgelser af prøver potentielt inficeret af patogener fra forskellige regioner i verden. Hvis der er bekymringer om døde mikrobielle celler, snavs eller partikler efter ekstraktion, anbefales filtrering ekstrakterne gennem en 0,2 µm glas fiber filter.
For at strømline processen, vand og methanol kunne ekstrakter kombineres for GC-MS analyse under trin 4.1. Disse ekstrakter skal dog forblive adskilt for FTICR-MS analyse på grund af ioniserende stråling effektivitet spørgsmål med ESI kilden. Fordelen ved kører den kombinerede ekstrakt på GC-MS er, at flere metabolitter (der dækker en større vifte af polaritet) vil blive identificeret. Ulempen ved at kombinere uddragene på dette punkt er, at en af de vigtigste metabolitter vigtigt i mikrobiel behandling af organisk materiale er methanol. Spor af methanol vil altid forblive i den samlede stikprøve, selv efter tørring, så hvis methanol er en metabolit af interesse, vand ekstrakt skal køres separat. At have god kontrol med ingen analysander vil også hjælpe med at identificere potentielle forurening i prøverne.
I trin 7.1 forberede ekstrakter til NMR-analyse, som GC-MS analyse, enten vand ekstrakt alene eller kombinerede vand og methanol ekstrakter kan anvendes. Ulemperne ved at gøre dette er magen til dem, der er nævnt i den foregående præmis. Fordelen ved at kombinere ekstrakter methanol og vand er at nogle af de mindre polar metabolitter, der er oploeses i methanol brøkdel vil blive identificeret. Men på grund af det freeze-drying skridt, mange mere flygtige forbindelser vil gå tabt. Dette er en særlig ulempe hvis kvantificere flygtige fedtsyrer er en vigtig del af forsøget.
I denne procedure for at identificere proteomics, eneste fuldt tryptic peptider er søgt, således endogene peptidase aktivitet og i kilde fragmenterings vil blive savnet. På den anden side kan oxideret methionin betragtes som en posttranslationel modifikation for peptid kandidater som denne ændring almindeligvis opstår under prøvetagning behandling og håndtering. Kvantificering af enzymer ved hjælp af peptid eluering områder kan gøres, men er omfattet af dette projekt.
Mange de seneste fremskridt i analysen af NOM og mikrobielle parametre giver et væld af teknikker til forståelse af organisk C cykling. Ved at kombinere disse teknikker i et enkelt strømlinet protokol, får vi en roman opfattelse af de processer, der finder sted. Kobling proteomics analyser med de metaboliske analyser giver overbevisende corroborative tegn på, at en reaktion sker faktisk. Metaboliske analyse alene er begrænset, det meddeler os hvilke metabolitter er højere eller lavere koncentration i sammenligninger mellem websteder eller efter en behandling virkning, men ikke kan skelne årsagerne til disse ændringer. For eksempel, vi identificeret faldende sukker koncentrationer med dybde i mosen, men uden yderligere oplysninger det er uklart om tilbagegang med dybde er på grund af langsom indgange eller hurtig nedbrydning i den dybe tørv. Analyse af proteomet og den faldende enzym udtryk med dybde gør det muligt for os at afvise den anden hypotese. Snarere er vores resultater konsistente med hurtig sukker nedbrydning i overfladen tørv begrænsende indgange til dybere dybder. Disse særlige indsigt er kun muligt, når alle teknikker betragtes i tandem, som hver giver en unik, men kritisk stykke af C cykling puslespil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke J.P. Chanton, J.E. Horadric og M.M. Kolton for bistand med indsamling af tørv prøver. Dele af dette arbejde blev udført på det miljømæssige Molecular Sciences laboratorium, en DOE Office of Science bruger Facility sponsoreret af Office af biologiske og miljømæssige forskning. PNNL drives af Battelle for DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830. Dette arbejde blev støttet af det amerikanske Department of Energy, Office of Science og Office af biologiske og miljømæssige forskning (tilskud: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 og DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H.
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
