Summary
Denne protokollen beskriver en enkelt gjennomstrømning for utfyllende analytisk og omics teknikker i fullt sammen karakteristikk av naturlig organisk materiale og mikrobiell Proteomikk i forskjellige økosystemer. Denne tilnærmingen gir robust sammenligninger for å identifisere metabolske veier og transformasjoner viktig for beskriver drivhus gassproduksjon og forutsi svar til miljøproblemene.
Abstract
Naturlig organisk materiale (NOM) består av en svært kompleks blanding av organiske forbindelser som historisk har vist seg vanskelig å karakterisere. Men for å forstå termodynamisk og kinetisk kontrollene i drivhus gass (karbondioksid [CO2] og metan [lm4]) produksjon som følge av nedbryting av NOM, kombinert molekylær-nivå karakteristikk med mikrobiell proteomanalyser er nødvendig. Videre, klima- og miljømessige endringer forventes å forurolige naturlige økosystemer, potensielt opprørende komplekse interaksjoner som påvirker både tilførsel av organisk materiale underlag og mikroorganismer utfører transformasjonene. Detaljert molekylær karakteristikk av organisk materiale, mikrobielle Proteomikk, veier og transformasjoner som organisk materiale er nedbrutt vil være nødvendig å forutsi retning og omfanget av effekten av miljøendringer. Denne artikkelen beskriver en metodisk gjennomstrømming for omfattende metabolitten karakteristikk i et enkelt utvalg av direkte injeksjon Fourier transform ion cyclotron resonans massespektrometri (FTICR-MS), gass kromatografi massespektrometri (GC-MS), kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, flytende kromatografi massespektrometri (LC-MS) og Proteomikk analyse. Denne tilnærmingen gir et fullt sammen dataset som forbedrer statistiske tillit for inferring veier av organisk materiale nedbryting, den resulterende CO2 og CH4 produksjon priser og deres svar til miljømessige forstyrrelsene. Her presenterer vi resultatene av å bruke denne metoden NOM smakebiter fra permafrostområder; protokollen er imidlertid gjelder for enhver NOM prøven (f.eks torv, skogkledde jord, marine sedimenter, osv.).
Introduction
Globalt, er våtmarker anslått for å inneholde 529 Pg karbon (C), som organisk C gravlagt i torv innskudd1. Foreløpig fungere slik permafrostområder som en netto C vask, fremdeles 29 Tg C y-1 i Nord-Amerika alene1. Imidlertid miljømessige forstyrrelser som drenering, branner, tørke og varmere temperaturer kan kompensere C mottakeren ved å øke organisk materiale nedbryting som resulterer i økt C tap via drivhusgass (karbondioksid [CO2] og metan [lm4]) produksjon1,2. Klimaendringene kan bidra til C tap hvis varmere temperaturer eller tørketrommel forhold stimulere raskere C nedbryting av mikroorganismer. Eventuelt kan høyere temperaturer og luft CO2 -konsentrasjoner stimulere produksjon av primærmetall for å beslaglegge mer CO2 som organisk karbon (OC). I hvilken grad og hvor fort at OC er så nedbrutt til CO2 og CH4 avhenger av komplekse interaksjoner mellom elektron donor substrater, tilgjengeligheten av elektron acceptors og mikroorganismer som megle i transformasjon. I mange tilfeller mekanismene er ikke godt karakterisert, dermed sitt svar på miljømessige forstyrrelser er ikke godt begrenset og det er fortsatt uklart hva resultatet av klimaendringer vil være på karbon balanse i nedbrytning av torvlandskaper slipper økosystemer.
Den komplekse naturen naturlig organisk materiale (NOM) har gjort selv identifiserer de organiske forbindelsene finnes i NOM blandinger historisk vanskelig. Nylige fremskritt har forbedret vår evne til å karakterisere forbindelser som tradisjonelt, og til dels fortsette, ansett som gjenstridige humic eller fulvic forbindelser3,4,5. Vi nå forstår at mange av disse forbindelsene er faktisk microbially tilgjengelig og kan deles hvis en egnet terminal elektron acceptor (te) er gjort tilgjengelig6,7. Beregne nominell oksidasjonstallet til karbon (NOSC) for et sammensatt gir en beregning for å forutsi potensialet for nedbryting og energi avkastningen av te kreves. Det krever imidlertid molekylært nivå karakteristikk av organisk materiale7. NOSC beregnes fra den molekylære formel via følgende ligning7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, der z er netto kostnader. NOSC er korrelert med termodynamisk drivende kraft8, hvor forbindelser med høyere NOSC er enklere å dårligere, mens forbindelser med lavere NOSC krever stadig mer energisk te for å bli redusert. Forbindelser med NOSC mindre enn 2 krever en høy energi som gir te som O2, nitrat eller MnIV, og kan ikke reduseres ved vanlig forekommende lavere strømproduserende te som FeIII eller sulfate7. Dette er en viktig faktor i de vannfylte anoksisk forholdene i våtmarker hvor O2 og andre høy energi som gir te er knappe9 og derfor nedbrytning av lavere NOSC forbindelser under disse forholdene er thermodynamically begrenset. Miljømessige forstyrrelsene kan påvirke termodynamisk delstaten økosystemet gjennom hydrologiske endringer som påvirker O2 (den mest energiske elektron acceptor), endringer i organisk underlag og elektron acceptors gjort tilgjengelig av primær produksjon, og i mindre grad av temperatur. Et viktig eksempel på effektene temperatur i våtmark systemer oppstår når det gjelder bytteforholdet mellom homoacetogenesis (dvs., acetat produksjon fra CO2 og H2) og hydrogenotrophic methanogenesis ( dvsCH4 produksjon fra CO2 og H2). Ved lave temperaturer vises som homoacetogenesis er litt favorisert, mens varmere temperaturer favorisere CH4 produksjon10. Denne temperaturen effekten kan ha viktige implikasjoner for respons av økosystemer til skiftende klima, som CH4 er en mye sterkere klimagass enn CO211 , og dermed øke produksjonen av CH4 på bekostning av CO2 på varmere temperaturer kan bidra til en positiv tilbakemelding med klimaet oppvarmingen.
Permafrostområder produsere globalt betydelige mengder av CO2 og CH46via mikrobiell åndedrett av naturlig forekommende organisk saken. NOSC av organisk karbon underlagene bestemmer den relative andelen CO2: CH4 produsert som er en viktig parameter på grunn av det høyere strålingspådrivet CH4 sammenlignet CO211, men også fordi arbeidet med modellbyggingen har identifisert dette forholdet som en viktig parameter for å estimere C forandring i permafrostområder12. I fravær av terminal elektron acceptors enn CO2, kan det bli vist av elektron balanse at organisk C underlag med NOSC > 0 vil produsere CO2: CH4 > 1, organisk C med NOSC = 0 produserer CO2 og CH4 i ekvimolare forhold og organisk C med NOSC < 1 produsere CO2: CH4 < 113. Nedbryting av OC i naturlige økosystemer er formidlet av mikroorganismer, slik at selv når nedbrytning av et bestemt stoff er thermodynamically mulig, det kinetically er begrenset av aktiviteten av mikrobielle enzymer og, under anoksisk forhold, av den termodynamisk drivkraft (dvs.NOSC)7. Til nå har det vært utfordrende for fullt karakterisere organisk materiale fordi mangfoldet av forbindelsene til stede krever forskjellige komplementære teknikker for deres karakteristikk. Nylige fremskritt har lukket gapet; ved hjelp av en rekke analytiske teknikker kan vi analysere et stort utvalg av organiske forbindelser gir molekylært nivå karakterisering og i noen tilfeller kvantifisering, fra små primære metabolitter som glukose opptil 800 Da poly-heterocycles. Tidligere ville slike store komplekse molekyler ha blitt preget bare som lignin-lignende eller tannin som og antatt å ha vært gjenstridige. Molekylær nivå karakterisering, men lar beregning av NOSC for selv disse store, komplekse molekyler. Disse NOSC verdier er lineært korrelert med termodynamisk drivkraften slik at en vurdering av kvaliteten på organisk materiale tilgjengelig for nedbryting, som i mange tilfeller avslører at disse komplekse molekyler kan faktisk være microbially nedbrytbart selv under anoksisk forholdene som råder i våtmarker.
Siden introduksjonen av O2 tillater organisk materiale av nesten alle naturlig observert NOSC verdier som skal deles, fokusere her vi på endringene i organisk materiale og mikrobiell Proteomikk som vil være de primære driverne i våtmarksområde (dvs. begrenset O2) systemer. Alle teknikkene som vi vil diskutere kan imidlertid brukes til organisk materiale fra noen økosystemet. Vanligvis bulk målinger basert på optisk og fluorescens analyser har blitt brukt til å vurdere organisk materiale kvalitet3,14. Når du bruker bulk målinger som disse, men går fine detaljer tapt så stort antall molekyler er kategorisert sammen under generiske termer som humics eller fulvics. Definisjonene av disse kategoriene er ikke godt begrenset, og faktisk kan variere fra å studere gjør sammenlikninger umulige. Videre bulk mål ikke gi molekylær detaljer nødvendig for å beregne termodynamikken styrer systemet og derfor bommer virkelig vurdere organisk materiale kvalitet15.
Individuelle teknikker som Fourier transformere ion cyclotron resonans massespektrometri (FTICR-MS), kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, gass kromatografi masse massespektrometri (GC-MS) og flytende kromatografi massespektrometri (LC-MS) gjør gi slike molekylært nivå detaljer. Mens hver av disse teknikkene presenterer sine egne begrensninger, ta de også med sine egne styrker som kan brukes i en integrert tilnærming for å oppnå den molekylære detaljen nødvendig for kvantifisere organisk materiale kvalitet i en streng termodynamisk følelse . GC-MS er nyttig for å identifisere kritiske liten metabolitter som har proksimale innflytelse på CO2 og CH4 produksjon (f.eks, glukose, acetate, etc.); men GC-MS krever bekreftelse mot en standard og er derfor begrenset til allerede kjente forbindelser i databasen hindre identifikasjon av romanen forbindelser. Videre er GC-MS en semi kvalitativ teknikk slik at slutning om endringene i relativ konsentrasjoner, men ikke gi faktiske konsentrasjon informasjon nødvendig for beregning av Gibbs gratis energier for eksempel. Endelig GC-MS krever derivatization av molekyler før analyse som begrenser oppløsning til forbindelser mindre enn ~ 400 Da og flyktige alkoholer går tapt under tørking trinnet.
Endimensjonal (1D) 1H flytende form NMR lar svært kvantitative karakteristikk av små metabolitter (inkludert primære små molekylvekt metabolitter og flyktige som alkoholer, acetate, aceton, formiat, pyruvate, succinate, kort-lenket fettsyrer, samt en rekke karbohydrater notorisk fraværende eller utsatt fra baserte metoder) og konsentrasjonene er spesielt nyttig for å beregne termodynamisk parametere. Likevel, som GC-MS, 1D NMR komplekse blandinger krever standardisering i forhold til en database og derfor alene tillater ikke enkel identifisering av romanen forbindelser som trolig vil være rikelig i komplekse naturlig og skiftende økosystemer. I tillegg NMR er mindre sensitive enn baserte teknikker og derfor kvantitative metabolitten profilering oppnås bare over 1 µM bruker NMR-systemer som er utstyrt med helium-avkjølte kulde-sonder. Ikke mye verdsatt, noen NMR kald-sonder er salt-tolerant og lar miljømessige blanding analyse i nærvær av millimolar salt konsentrasjoner i mindre diameter (< 3 mm ytre diameter) eksempel rør16. En mer komplikasjon av NMR er imidlertid at store mengder spinn metaller og mineraler (f.eksFe og Mn over 1-3 wt %), som kan være rikelig i høyereliggende jord, kan utvide spectral funksjoner og komplisere tolkning av NMR spekter . Bruke solid fase utvinning (SPE) kan rådgiver i tolkningen av både NMR og baserte metabolomics metoder av å redusere mineral salter og øke spectral kvalitet.
FTICR-MULTIPLE Sclerosis ved direkte injeksjon er en høylig følsom teknikk i stand til å oppdage titusenvis av metabolitter fra en enkelt prøve, men det ikke fange kritiske liten metabolitter som acetate, pyruvate og succinate og er notorisk vanskelig å for sukker og andre karbohydrater17heller gir kvantitative opplysninger. Men i motsetning til de andre teknikkene, FTICR-MS utmerket til identifisere og tilordne molekylære formel romanen forbindelser og identifiserer derfor det største antallet forbindelser gir mer molekylære informasjonen enn noen av de andre beskrevne teknikkene. Dette er nyttig fordi molekylære informasjonen fra FTICR-MULTIPLE Sclerosis (og andre teknikker) kan brukes til å beregne NOSC som er relatert til termodynamisk drivkraften for sannsynligheten for visse reaksjoner8 og deres priser under visse betingelser7. Videre ved å koble FTICR-MULTIPLE Sclerosis med separasjon teknikker, som LC sammen med tandem MS, kan kvantitativ strukturinformasjon oppnås, utligner noe av ulempene med denne teknikken. LC-MS er nyttig for å identifisere lipid-lignende forbindelser og andre metabolitter som ikke er godt karakterisert av noen av de andre metodene. Kopling LC FTICR-MS eller LC-MS med en brøkdel samler og samle fraksjoner av bestemte ukjente av interesse for strukturelle forklaring av todimensjonal (2D) flytende staten NMR er den ideelle beliggenheten for å identifisere og kvantifisere ukjent forbindelser18 ,19. Men er dette en svært tidkrevende skritt som kan brukes etter behov. Tatt individuelt, hver av disse teknikkene gir en annen mellomkopi av organisk materiale, og ved å integrere dem, kan vi oppnå en mer fullstendig forståelse enn å bruke noen av teknikkene i isolasjon.
Mens de termodynamisk hensyn satt de ultimate begrensningene på hva transformasjoner er mulig i et system, er organisk materiale nedbryting formidlet av mikroorganismer enzym aktiviteter kontrollere reaksjonen priser. Dermed fullt forstå kontrollene på organisk materiale nedbryting og drivhus gass (CO2 og CH4) produksjon fra våtmarkene krever en integrert omics tilnærming til karakteriserer mikrobiell enzym aktiviteter samt metabolitter. I denne artikkelen beskriver vi en metode for å oppnå så omfattende analyse fra en enkelt prøve med en sammenhengende tilnærming som resulterer i en fullt sammenkoblede analyse. Dette utvider på metabolitten, protein og lipid utvinning (omfattende) protokollen der Proteomikk ble kombinert med GC-MS og LC-MS20 å identifisere liten metabolitter, proteiner og lipider ved å innlemme kvantitative metabolitten informasjon via NMR og identifikasjon av større sekundære metabolitter via FTICR-MS. litt forskjellig fra omfattende, begynner vi protokollen med vann trekking og deretter Bruk sekvensiell ekstraksjon med stadig ikke-polare. Alle utdrag utføres på et enkelt utvalg som sparer prøven når volumer er begrenset eller vanskelig å få og reduserer eksperimentelle feil introdusert gjennom variant blant dele fra heterogene eksempel matriser (f.eks, jord og torv) eller forskjeller i lagringsforhold og varighet.
Til slutt, ved å koble OM analysene med Proteomikk analyser av mikrobielle samfunnet, kan vi bygge metabolske nettverk som beskriver veier og transformasjonen av organisk materiale nedbryting. Dette tillater oss å teste spesifikke hypoteser om hvordan forstyrrelser systemet vil påvirke ultimate CO2 og CH4 produksjon gjennom endring tilgjengelig organisk substrater, elektron acceptors og de mikrobielle samfunnene formidling av reaksjoner via aktiviteten av enzymet katalysatorer.
Det overordnede målet med denne metoden er å gi en enkelt gjennomstrømming protokoll for å analysere metabolitter, lipider og mikrobiell proteiner fra en enkelt prøve og dermed skape fullt sammenkoblede dataset for å bygge metabolske nettverk mens begrensende analytisk feil .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. følge utvinning av organisk materiale fra jord sedimenter og torv
- Samle jord sedimenter og torv via prøvetaking og dele kjerner i henhold til hypotesen testet (f.eks, dybde). Butikken prøver polytetrafluoroethylene belagt beholdere og fryse-80 ° c for lagring før analyse.
Merk: Ca 25 mg C er nødvendig for denne protokollen. Torv (vanligvis 45% C) kreves 50 mg tørket torv. Større mengder eksempler kan være nødvendig for lav økologisk prøver som mineral eller skogkledde høylandet jord avhengig av C innhold (opp til 5 g). Fordi ekstraksjon med organiske løsemidler vil trekke noen polyetylenglykol (PEG) inn ekstrakter, som vil negativt påvirke ionisering under trinn 2.4, er det viktig å unngå slik at prøver å kontakte plast når som helst under innsamling, lagring eller utvinning. - Når du er klar til å analysere prøvene, fryse tørr å konstant vekt, deretter slipe prøvene i en høyhastighets ballen mill bruke rustfritt stål sliping baller å homogenize og bryte opp noen aggregater.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og materialet lagret på-80 ° C. - Bruke en etanol-vasket rustfritt stål redskap, aliquot 50 mg hver av tørket prøvene i individuelle 2 mL hetteglass. Disse prøvene vil trekkes sekvensielt ved hjelp av en rekke løsemidler fortløpende trekke ut stadig ikke-polar metabolitter fra hvert utvalg. Legge 1 mL destillert, degassed vann (H2O) til hver prøve, cap hetteglass og shake 2 h i en shaker-tabell.
- Etter risting tillater løsninger å stå ved romtemperatur (RT) for 20 min, så sentrifuge 15.000 x g i 30 min, Dekanter og lagre nedbryting fra hver.
Merk: Disse løsningene vil bli satt inn FTICR-MS ved direkte injeksjon. - Oppførsel Folch utvinning21 (også kjent som omfattende20) på nå vann utdraget rester ved å gjenta trinn 1.3 og 1.4 erstatte 1 mL av en 20 ° C 4:3 kloroform: metanol blanding for vann i trinn 1.3.
Advarsel: Kloroform og metanol er både svært brannfarlige og giftige. Bruke riktig personlig verneutstyr (PVU) å unngå hudkontakt og unngå åpen flamme. - Forsiktig skille de to resulterer løsemiddel lag, som vil være visuelt skilles, for egen analyse av FTICR-MULTIPLE Sclerosis ved hjelp av en separasjon trakt eller bare fjerne det øverste laget av forsiktig pipettering.
Merk: Kloroform inneholder brøken blir nederst mens metanol inneholder brøken er mindre tett og vil være på toppen. - Fortynne kloroform ekstrakt (trinn 1.6) 1:1 i metanol og vann ekstrakt (trinn 1.4) 2:1 i metanol å effektivisere electrospray ionization (ESI) i FTICR-MS ved direkte injeksjon.
Merk: Metanol inneholder brøken fra trinn 1.7 trenger ikke å bli utvannet i metanol. Metanol laget kjøres fra direkte injeksjon på FTICR-MS.
2.FTICR-MS analyse
- Kalibrere FTICR spectrometer ved å injisere direkte 100 µL av en tuning løsning (se Tabell for materiale) spenner over en masse rekke ca 100-1300 Da i FTICR-MS.
- Forberede Suwannee elva Fulvic Acid standarden (se Tabell for materiale) ved å gjøre en 1 mg mL-1 løsning i ultrapure filtrert vann og deretter fortynning det resulterende løsningen å 20 µg mL-1 i metanol.
- Direkte injisere 23 µL av denne siste løsningen til ESI kilden koplet til FTICR spectrometer gjennom en sprøytepumpe som er satt til en strømningshastighet på 3,0 μL min-1. Satt nålen spenning til +4.4 kV, Q1 til 150 m/z og glass kapillær på 180 ° C. Inspisere resulterende spectra bruker analyseprogramvare (se Tabellen of Materials) til å fastslå kvaliteten på dataene.
- Bruke HPLC klasse metanol før prøver og hele prøvetaking for å overvåke carryover. Introdusere 23 μL av hver pakke via direkte injeksjon til ESI kilden koplet til FTICR spectrometer gjennom en sprøytepumpe som er satt til en strømningshastighet på 3,0 μL min-1. Satt nålen spenning til +4.4 kV, Q1 til 150 m/z og glass kapillær på 180 ° C.
- Juster ion akkumulering tid (IAT) for hver prøve eller prøver å gjøre rede for variasjoner i C konsentrasjon. Vanlige verdier er mellom 0,1 og 0,3 s. samle 144 skanner for hver prøve, gjennomsnittlig skanner og deretter utføre en intern kalibrering bruker homologe CH2 (dvs. 14 Da separasjon) serien.
Merk: Etter FTICR-MS analyse, vedtaket gjøres enten kombinere vannet og metanol utdraget brøker å effektivisere trinnene eller fraksjoner kan holdes separat gjennom fremgangsmåten. Fordeler og ulemper av hver tilnærming er beskrevet i lengden i diskusjonen. Hvis dermed kombinere vann og metanol-utpakkede fraksjoner. - Tørr ekstrakter bruker en konsentrator og lagre resten av ekstrakter (~ 1 mL) for påfølgende GC-MS (vann, metanol eller vann + metanol), LC-MS (kloroform) og NMR (vann + metanol) analyse.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og materialet lagret på 20 ° C.
3. FTICR-MS databehandling
- Co justere alle eksempel peak lister for hele datasettet å redusere masse Skift og standardisere peak oppdrag med Formularity programvare22 foran formelen tildeling.
- Bruk det Formularity programvare22 tilordne molekylære formel ved hjelp av et signal til støyforhold er større enn 7, masse måling feil < 1 ppm, og slik at C, T, O, N, S og P mens utenom alle andre elementer.
- Hvis flere kandidat formler er returnert for en gitt vevsmasse (hyppig over 500 Da) pålegge begrensninger samsvar med materialet blir samplet. For eksempel i torv, typiske begrensningene omfatter: laveste masse feil, laveste antall heteroatoms (N, S, P), og når det er tilstede P må være i oksidert form (dvs.det må være minst 4 O atomer for hver P atom i formelen).
4. kjemisk Derivatization for GC-MS
- Forberede tomt kontroll prøver av HPLC-grade Heksan i GC-MS autosampler ampuller23. Oppløse 100 mg fatty acid methyl estere (FAMEs: C8 - C28) blanding tiden i 200 µL av Heksan.
- For å beskytte karbonyl grupper, legger du til 20 μL 30 mg mL-1 methoxyamine hydroklorid i pyridine til hver av metanol ekstrakter og vann ekstrakter (eller kombinert metanol/vann ekstrakter hvis bruker) fra trinn 2.6, mellomrom og BERØMMELSE kalibrering prøver23. Forsegle ampuller med caps.
FORSIKTIG: Pyridine er både svært giftige og brennbare. Bruk passende PPE å forhindre hud eller øyekontakt og unngå åpen flamme. I tillegg volatilizes pyridine på RT forårsaker skadelige luftforurensningen. Fungere bare i godt ventilerte områder under avtrekksvifte. - Vortex utdrag for 20 s. Sonicate ekstrakter for 60 s. Deretter ruge ekstrakter i en centrifuge på 37 ° C for 90 min 100 x g.
Merk: En overdreven mengde karbohydrater eller salter kan forårsake metabolitter til krystallklar etter blir tørket ned. Sonicating prøvene vil bidra til å gjeninnføre krystallisert metabolitter i derivatizing reagensen. - Etter inkubasjon legge 80 μL N-metyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorosilane til hver prøve, vortex utdrag for 20 s. Sonicate ekstrakter for 60 s og Inkuber ekstrakter igjen i en sentrifuge på 37 ° C i 30 min 100 x g.
- Kul ekstrakter RT (20-24 ° C), deretter overføres til GC-MS autosampler ampuller.
5. GC-MS analyse
- Stille og kalibrere MS etter leverandør anbefalinger (se Tabell for materiale) før analyse å sikre at maskinen lese MS data riktig. Kontroller at helium gasstrykket er innenfor angitte toleranse.
- Separate polar metabolitter i en GC kolonne (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Sette ovn temperatur protokollen som følger: (1) første temperaturen på 60 ° C i 1 min, (2) rampen 325 ° c med en hastighet på 10 ° C min-1, og (3) vent på 325 ° C i 5 minutter.
- Analysere ekstrakter bruker en GC kombinert til en enkelt quadrupole MS. sett injeksjon port temperaturen til en konstant 250 ° C. Injisere 1 μL av hver derivatized ekstrakt i splitless modus.
6. GC-MS databehandling
- Inspisere alle datafilene for å sikre at de var riktig fanget. Ta hensyn til potensielle Skift interne standard tid og intensiteter å bekrefte som dataene ble tatt konsekvent gjennom hele analysen.
- Konvertere dataformatet for leverandør bestemt MS til en generell MS hvis nødvendig. Behandle rådata filer bruker MetaboliteDetector24 kalibrere oppbevaring indekser basert på BERØMMELSE interne standarder. Når du har justert tid alle datafiler, kan du fortsette med deconvolution og endelig metabolitten identifikasjon ved oppbevaring indekser og GC-MS spectra mot FiehnLib polar metabolitten biblioteket25.
- Kryssjekke gjenværende uidentifisert metabolitter mot NIST14 GC-MS biblioteket med spektral matchende. Validere identifikasjoner individuelt for å eliminere falske IDer og redusere deconvolution feil.
7. væske statlige NMR analyse
- Tynn ut resten av vannet ekstrakter (~ 300 µL) med 10% (vol/vol) med 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 interne standard. Eventuelt kombinere vann og metanol ekstrakter fra trinn 1 deretter resubstitute i vann. Dermed imidlertid kan noen av de flyktige forbindelsene gå tapt under det fryse-tørking steget. Typisk siste eksempel volumer er i området 180-300 µL.
- Overføre blandingen i en høy kvalitet 3 mm ytre diameter (OD) Borosilikatglass NMR rør.
- Samle spectra bruker en NMR spectrometer (ideelt minst 600 MHz) utstyrt med en 5 mm trippel resonans salt-tolerant kaldt sonde og en kald-karbon pre forsterker.
- Samle 1D 1H spectra med en 1 D kjernefysiske Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) presaturation eksperiment på 298 K med en 4 s oppkjøpet tid, 1,5 s gjenvinne forsinkelse, 65 536 komplekse poeng og 512 skanninger.
- Samle 2D 1H -13C heteronuclear single-quantum sammenheng (HSQC) og 1H -1H totale sammenhengen (TOCSY) spectra å hjelpe i tilordne metabolitter og validering.
- Behandle, tilordne og analysere alle spektra bruker NMR analyseprogramvare (se Tabell for materiale) å kvantifisere intensiteter i forhold til den interne standarden. Identifisere metabolitter tilsvarende kjemiske SKIFT, J-kopling og intensitet informasjon i prøvene mot biblioteket.
Merk: Biblioteket forsterkes ytterligere av egendefinerte målrettet metabolitten standarder og metabolitten tillegg utført regelmessig. Protokollen kan pauses på dette punktet og materialet lagret på 20 ° C.
8. LC-MS Lipidomics analyse
- Rewet tørket kloroform ekstrakt genereres under trinn 2.5 med 200 μL av metanol.
- Injisere 10 μL av hver ekstrakt i en ultra ytelse flytende chromatograph koblet til en Orbitrap masse spectrometer bruker en tilbakeført fase belastet overflaten hybrid kolonne (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm partikkelstørrelse). Angi en 34-min gradient (mobil fase A: acetonitrile/T2O (40:60) som inneholder 10 mM ammonium acetate, mobile fase B: acetonitrile/isopropanol (10:90) som inneholder 10 mM ammonium acetate) på en strømningshastighet på 250 µL/min. Bruk både negative og positive ionisering modusene med høyere energi kollisjon dissosiasjon og kollisjon indusert dissosiasjon.
FORSIKTIG: Acetonitrile er en øye, hud og luftveier irriterende. Bruk passende PPE. I tillegg er acetonitrile brennbart. Tillater ikke kontakte Oksiderende stoffer, giftige gasser kan produseres under brenningen. - Sende rå LC--MS-/ MS datafilene til VÆSKE med målfilen (dvs., liste over > 25,000 lipid arter) for respektive ionisering modus (positiv eller negativ). Behandle raw-filen. Manuelt godkjenne resulterende identifikasjonene ved å undersøke til MS-/ MS spectra tilstedeværelsen av diagnostiske ioner, hvis aktuelt, matchende fragment ioner (f.eks fet acyl kjeder), isotopanrikning separasjon, masse ppm feil forløpere, og oppbevaring. Eksportere listen over trygt identifiserte lipider som filtypen TSV.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og lagre materialet 20 ° C.
9. Proteomikk analyse
- Ekstra proteiner etter omfattende protokollen20 fra resten av metanol fasen skyldes trinn 2.4, ved å vaske ekstrakt med 20 ganger ekstrakt volumet av ekstra kaldt (-20 ° C) metanol.
- Bruk en 1 mL/50 mg silisium-baserte absorberende (se Tabell of Materials) til tilstand C18 SPE kolonner med 3 mL metanol, 2 mL 0,1% trifluoroacetic syre (TFA) i vann, etterfulgt av tillegg av utdrag fra trinn 9.1 frekvensen ikke større enn 1 mL/min.
- Etter tillegg av prøven, vaske kolonnen med 4 mL 95:4.9:0.1 vann: acetonitrile:TFA, og la det tørke. Plasser en 1,5 mL samling rør under SPE-kolonnen, og elute prøven med 1 mL av 80:19.9:0.1 metanol: vann: TFA.
- Konsentrat ekstrakter til 100 µL under vakuum-assistert fryse tørketrommel, deretter måle protein konsentrasjonen av bicinchoninic syre (BCA) kolorimetrisk analysen26 ved en bølgelengde på 562 nm.
- Sentrifuger ekstrakter 10.000 x g i 10 min på 4 ° C. Forkaste resulterende nedbryting og tørk det gjenværende pellet under vakuum for 5 min. Resuspend protein pellet i vann til en siste konsentrasjon av 0,1 µg peptid per µL.
- Legg til dithiothreitol en siste konsentrasjon av 5 mM og ruge ved 60 ° C i 30 min. Dilute 10-fold med 100 mM NH4HCO38 M urea løsning og Inkuber på 37 ° C for 3t i nærvær av 1 mM CaCl2 og svin trypsin på en 1:50 enzym protein forholdet.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og lagre ved 20 ° C. - Separat ekstrakter via flytende kromatografi med en eksponentiell gradient en 0,1% maursyre i vann mobile fase (A) og en 0,1% maursyre i acetonitrile mobile fase (B) på 10 kpsi og 500 nL min-1.
- Innføre resulterende eluent i en ESI-kombinert masse spectrometer samle spectra fra 400-2000 m/z 100.000 oppløsning med m/z 400 i en lineær ion trap (LTQ) Orbitrap masse spectrometer.
- Konvertere RAW spectra filer til det mzML formatet msConvert eller ProteoWizard aksepterer alle standardparametere. Bruk søkeverktøyet universell database MSGFPlus for å søke resulterende proteomes mot en målrettet protein database med protein sekvenser spådd fra relevant metagenome samlet genomer.
- Tilføy vanlige forurensninger (f.ekstrypsin keratin, albumin) og fjerne alle nøyaktig duplisert protein sekvenser for å forbedre peptid til mass spekteret kampen statistikk. Vurdere den resulterende MSGF spectral sannsynlighet score for å fastslå hvilken peptid til mass spekteret kamp er best. Bruke Q-verdien fra MSGFPlus for å filtrere hele data haugen til 1% false oppdagelsen rate (FDR).
10. Metabolomics analyse og metabolske nettverksbygging
- Kompiler alle metabolitten molekylære formel identifisert i trinn 3, 6, 7 og 8 i en enkelt database av metabolitter i prøvene. Kombinere disse metabolitter med enzym provisjon (EF) eller KEGG Orthology (KO) antall enzymer identifisert i trinn 9. Søk kombinert dataset mot KEGG27 databasen, metabolske veier delen.
- Manuelt evaluere resultatene mest sannsynlige veier og integrere i en metabolsk modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte beskrevet supplerende analyse protokollen og sammenlignet torv med dybde i S1 myra i området Gran og permafrostområder svar Under endre miljøer (Gran) i Minnesota, USA. Disse resultatene er sammenlignet dem fra en permafrost myr og fen fra Nord-Sverige å vise hvordan områder kan variere metabolitten og enzym. Vi identifisert 3,312 enzymer i Proteomikk analysen. En analyse av enzymer aktiviteter med dybde avslører at antall enzymer avtar kraftig mellom 15 cm og 45 cm i Gran myra (figur 1).
Mens Proteomikk resultatene indikerer hvilke proteiner er uttrykt, viser metabolske dataene hvilke reaksjoner faktisk oppstår. Samlet vi identifisert 67,040 metabolitter (inkludert lipider) i alle torv prøvene fra kombinasjonen av FTICR-MS, NMR, GC-MS, og LC-MS analyser. Av disse kunne vi molekylære formel tilordnes 15,385 forbindelser (figur 2). Kombinert metabolsk dataene spenner over en rekke oksidasjon stater, massene og sammensatte klasser.
Dette er vanligvis visualisert gjennom bruk av et van Krevelen diagram der atomic T/C prosenter av identifiserte formel plottes mot sin atomic o/c prosenter28. Vi har inkludert en ekstra dimensjon til typiske 2D-format, som viser NOSC med fargekoding symboler som representerer personlige formel (Figur 3 og Figur 4). Med økende dybde i Gran myra, det er en økning i antall store sekundære metabolitter identifisert av FTICR-MULTIPLE Sclerosis, spesielt i svært fortettet (nede til venstre til van Krevelen handlingen) og hydrogenert formler (toppen av tomten) (Figur 4 ). Over samme dypet er det en nedgang i antall små svært energiske forbindelser identifisert av GC-MS og lipider (figur 5). Dette kan foreslå at lipider og små metabolitter forbrukes i overflaten torv før dypere dypet eller at nedbryting priser i dyp torv er raskere enn i overflaten slik at nedover advecting forbindelser er raskt fortært. Skille mellom disse to konkurrerende hypoteser krever en prosessnivå forståelse av C sykling på stedet. Slike en prosessnivå forståelse kan bare oppnås ved å koble metabolomics og Proteomikk datasett. Vi oppnår dette ved kryss-validere kombinert FTICR-MS, GC-MS, LC-MS, og NMR identifisert metabolitter mot KEGG databasen. Dermed finner vi at forbindelsene vi identifisert er involvert i felles metabolske veier som tricarboxylic syre (TCA) syklus, Glykolysen og sukker metabolisme. Siden enkelte metabolitter kan være involvert i øker flere veier bekreftelse med enzymer vår tillit til tilordne veier (figur 6).
Gjennom denne tilordningen finner vi bevis av sukrose og stivelse stoffskiftet i overflaten torv, mens i dypere dypet pyruvate og andre gjæring produkter bygge opp (figur 6). Disse resultatene er konsistente med første hypotesen at sukker og andre energiske metabolitter er degradert i overflaten torv og ikke kommer dypere torv dypet. Som kan ses i figur 5, sukker (NOSC = 0) og aminosyrer (0 < NOSC < 1) forbrukes i overflaten torv, mens lipider (-2 < NOSC < -1) synes å akkumulere med dybde. Dette er i tråd med forventningene basert på NOSC at høyere NOSC forbindelser er lettere degradert mens lavere NOSC forbindelser finnes i den svært anaerob (dvs., te-begrenset) forholdene i undergrunnen torv. Denne tilnærmingen skiller også lykkes mellom jord fra ulike miljøer. For eksempel synes jord organisk materiale fra boreal nedbrytning av torvlandskaper slipper å være compositionally forskjellig enn permafrost nedbrytning av torvlandskaper slipper, samt innenfor fen og myr i permafrosten regionen. Disse resultatene er konsistente med en tidligere studie som viste forskjeller i området Geokjemi mellom disse habitater29, tyder på at området Geokjemi har en stor effekt på mikrobiell degradering av C under bakken.
Figur 1 : Proteomikk analyse viser sterk dybde lagdeling av enzymer. Barer angir gjennomsnitt og feilfelt angir ett standardavvik av antall. Dette tyder på at mikroorganismer er mest aktiv i torv overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Antall forbindelser identifisert av hver teknikk i overflaten torv (< 30 cm) av hver habitat samt mid (45 cm) og dype (87 cm) torv fra myra Gran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : The van Krevelen diagram (Atom T/C vs o/c hver identifisert molekylære formel) for overflaten (15 cm) Gran bog dybde for å demonstrere dekningen av forbindelser preget av hver teknikk. FTICR-MS tillater oss å identifisere det største antallet forbindelser (små sirkler), mens GC-MS (trekanter) er bra for skille og identifisere sukker (H/C = 2 og o/c = 1). NMR (ruter) spektroskopi gir kvantitativ informasjon om energisk viktige forbindelser som sukker, aminosyrer, pyruvate, etc. LC-MS (diamanter) gir informasjon om lipider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : The van Krevelen diagram (Atom T/C vs o/c hver identifisert molekylære formel) for dypet (87 cm) Gran bog dybde for å demonstrere dekningen av forbindelser preget av hver teknikk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Den forhold brøkdelen av ulike kjemiske klasser identifisert via ulike teknikker i forskjellige dypet. Stolper tegnes som gjennomsnitt for hver dybde ± ett standardavvik. Klasser plottet inkluderer aminosyrer, sphingolipider (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (DG), triacylglycerols (TG) og sukker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Kombinere resultater for å opprette en metabolsk nettverk. Dybde distribusjoner av metabolitter identifisert av NMR (en) og GC-MS (b), og en forenklet metabolske kart (c) viser et utvalgt antall transformasjoner identifisert på Gran bog. Grønne bokser viser metabolitter som reduserer med dybde, brun bokser angir metabolitter som øker med dybden. Grønne koble piler indikerer enzym i våre datasett som megle angitte transformeringen (enzym EC tall angitt ved siden av piler). Grå koble piler indikerer transformeringer som enzymer ikke ble identifisert i våre datasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-gjennomstrømning, fullt kombinert analyse strømmen benyttes for å karakterisere metabolitter og proteom gir innsikt i veier av som C sykling er oppstått i et komplekst økosystem. Jord og torv er heterogene matriser, og derfor en av de viktige trinnene i denne metoden oppstår i de tidligste trinnene i å sikre at start torv eller jord materiale er svært homogen. Det anbefales å slipe prøven samt aggregater kan redusere utvinning effektivitet. Dette er spesielt et problem aggregert og jord med lav C og høy mineral innhold som kan kreve bruk av en rustfritt stål ball jeksel til tilstrekkelig homogenize. Fordi romlige heterogenitet av jord og torv innen en eksperimentell område kan være høy, anbefales sterkt biologiske gjentak.
Denne fremgangsmåten bruker tre løsemidler: vann, metanol og kloroform, som skjevhet typer forbindelser er det mulig å trekke. I prinsippet bør denne sekvensielle utvinning metoden solubilize forbindelser som dekker et bredt polaritet utvalg. Men er disse løsemidler ikke optimalisert for utpakking organo-mineral komplekser eller svært stabilisert komplekser. Hvis slike forbindelser rundt, strengere løsemidler som sterke syrer og baser foretrekkes, men strengere utvinning prosesser kan forandre kjemien i prøvene. Omfatter slike løsemidler på slutten av utvinning sekvensen kan redusere denne effekten. I tillegg deaktiveres kloroform klinisk viktige jord og torv bakteriell og viral patogener, og andre sykdomsframkallende sykdomsfremkallende biologiske midler ved å løse opp celle membran lipider. Dermed reduserer innlemmer kloroform i utvinning protokollen risikoen involvert i biologi studier av prøver potensielt infisert av patogener fra forskjellige regioner i verden. Hvis det er bekymringer om død mikrobiell celler, avfall eller partikler etter utvinning, anbefales filtrering ekstrakter gjennom et 0,2 µm glass fiber filter.
For å strømlinjeforme prosessen, vann og metanol kan ekstrakter kombineres for GC-MS analyse under trinn 4.1. Men må disse utdragene være atskilt for FTICR-MS analyse på grunn av ionisering effektivitet problemer med ESI kilden. Fordelen med kjører kombinert ekstraktet på GC-MS er at flere metabolitter (dekker et større spekter av polaritet) vil bli identifisert. Ulempen med å kombinere ekstrakter på dette punktet er at en av de store metabolitter viktig for mikrobiell behandling av organisk materiale er metanol. Spor av metanol vil alltid være i kombinert utvalget, selv etter tørking, så hvis metanol er en metabolitten av interesse, vann ekstrakt må kjøres separat. Har god kontroller med ingen analytter hjelper også identifisere potensielle forurensning i prøvene.
I trinn 7.1 forbereder ekstrakter NMR analyse, som GC-MS analyse, enten vann ekstrakt alene eller kombinert vannet og metanol ekstrakter kan brukes. Ulempen med dette er lik de oppregnet i forrige avsnitt. Fordelen med å kombinere metanol og vann ekstrakter er at noen av de mindre polar metabolitter som er solubilized i metanol fraksjonen blir identifisert. Men på grunn av fryse-tørking trinnet, vil mange mer flyktige forbindelser gå tapt. Dette er en særlig ulempe hvis kvantifisere flyktige fettsyrer er en kritisk komponent i eksperimentet.
I denne fremgangsmåten for å identifisere Proteomikk eneste fullt tryptic peptider er søkte, dermed endogene peptidase aktivitet og i kildekode fragmentations vil bli savnet. På den annen side, kan oksidert metionin betraktes som en post-translasjonell modifikasjon på peptid kandidater som denne endringen skjer ofte under prøvetaking behandling og håndtering. Kvantifisering av enzymer bruker peptid elueringsrør områder kan gjøres, men er utenfor omfanget av dette prosjektet.
Mange nylige fremskritt innen analyse av NOM og mikrobiell parametere gir et vell av teknikker for å forstå organisk C sykling. Ved å kombinere disse teknikkene i en enkelt strømlinjeformet protokoll, får vi en ny visning av prosessene som foregår. Kopling Proteomikk analysen med metabolsk analysene gir overbevisende corroborative bevis som en reaksjon er faktisk forekommende. Metabolsk analyse alene er begrenset fordi det forteller oss hvilke metabolitter er høyere eller lavere i konsentrasjon i sammenligninger blant nettsteder eller etter en behandlingseffekt, men kan ikke skjelne mellom årsakene til endringene. For eksempel vi identifisert fallende sukker konsentrasjoner med dybde i myra, men uten ytterligere informasjon det er uklart om nedgangen med dybde skyldes treg innganger eller rask degradering av dyp torv. Analyse av proteom og fallende enzym uttrykket med dybde tillater oss å avvise andre hypotesen. Heller er våre resultater samsvar med rask sukker fornedrelse overflaten torv begrense inndata til dypere dypet. Disse spesielle innsikt er bare mulig når alle teknikker regnes sammen som hver inneholder en unik, men avgjørende del av C sykling puslespillet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke JP Chanton og J.E. Horadric mm Kolton for hjelp med å samle torv prøver. Deler av dette arbeidet ble utført ved miljømessige molekylær Sciences Laboratory, en DOE kontoret av vitenskap bruker anlegget sponset av Office av biologiske og miljøforskning. PNNL drives av Battelle for DOE under kontrakten DE-AC05-76RL01830. Dette arbeidet ble støttet av US Department of Energy, Office of Science og Office av biologiske og Environmental research (gir: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 og DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
