Summary
Этот протокол описывает один пропускной способности для дополнительных аналитических и омику методов, кульминацией которых полностью паре характеристика природных органических веществ и микроорганизмов протеомики в различных экосистемах. Этот подход позволяет надежного сравнения для выявления метаболических и преобразований важно для описания парниковых газов производства и прогнозирования реакции на изменения окружающей среды.
Abstract
Природные органические вещества (NOM) состоит из очень сложной смеси тысяч органических соединений, которые, исторически, трудно характеризовать. Однако чтобы понять термодинамические и кинетические элементы управления производства парниковых газов (диоксид углерода [CO2] и метана [CH4]) в результате разложения NOM, характеристика молекулярном уровне в сочетании с микробной необходим анализ протеома. Кроме того ожидается, что климатических и экологических изменений, возмущают природных экосистем, потенциально нарушить сложных взаимодействий, которые влияют на поставку субстраты органического вещества и микроорганизмы, выполнение преобразований. Необходимо предсказать направление и масштабы последствий экологических изменений будет подробный молекулярная характеристика органических веществ, микробной протеомики, пути и преобразований, которые разлагаются органического вещества. Эта статья описывает методологических пропускную способность для характеризации всеобъемлющей метаболит в одном образце путем прямого впрыска Фурье преобразование Ион циклотронный резонанс масс-спектрометрия (FTICR-MS), газовой хроматографии с масс-спектрометрии (ГХ-МС), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия (LC-MS) и анализ протеомики. Этот подход приводит к полностью в паре dataset, которая улучшает статистические уверенность для выведения тропы разложения органического вещества, результате CO2 и CH4 темпы производства, и их ответы на экологические возмущений. Здесь мы представляем результаты применения этого метода для NOM пробах из торфяников; Однако протокол применяется к любой NOM выборки (например, торф, лесных почвах, морских отложений и т.д.).
Introduction
Глобально водно-болотных угодий оценкам содержат 529 Pg углерода (C), главным образом органического углерода, похоронен в торфяных месторождений1. В настоящее время такие торфяники действовать как чистая раковина C, улавливание 29 Tg C y-1 в Северной Америке только1. Однако экологические нарушения таких слив, пожары, засухи и повышение температуры может компенсировать это раковина C путем увеличения разложение органических веществ, что приводит к увеличению потерь через C парниковых газов (диоксид углерода [CO2] и 1,производство метана [CH4])2. Изменение климата может способствовать потере C Если повышение температуры или сушка условий стимулирования быстрее C разложение микроорганизмами. Кроме того более высокие температуры и концентрации в воздухе CO2 может стимулировать первичного производства улавливания больше CO2 в качестве органического углерода (ОУ). В какой степени и как быстро что OC затем разложить на CO2 и CH4 зависит от сложного взаимодействия между субстратов доноров электронов, доступность акцепторов электронов и микроорганизмы, которые посредником преобразование. Во многих случаях механизмы не являются хорошо изученных, таким образом их реакции на экологические потрясения не хорошо ограниченного и остается неясным, что в результате изменения климата будет на баланс углерода в экосистемы болота.
Сложный характер природных органических веществ (NOM) сделал даже идентификации органических соединений, присутствующих в исторически трудных NOM-смеси. Последние достижения значительно улучшили нашу способность, традиционно характеризуют соединений и, в определенной степени по-прежнему рассматриваться как непокорных гуминовых фульвовых соединений3,,4или5. Теперь мы понимаем, что многие из этих соединений фактически микробиологически доступен и может быть разложено, если подходящий терминал электрон акцептора (чай) производится доступны6,7. Расчет номинального окисления углерода (NOSC) для соединения предоставляет метрики для прогнозирования потенциал для разложения и выход энергии требуется чая. Однако это требует молекулярном уровне характеристика органических веществ7. NOSC рассчитывается от Молекулярная формула через следующее уравнение7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, где z — Чистая бесплатно. NOSC коррелирует с термодинамических движущей силой8, которой соединений с более высокой NOSC легче деградируют, хотя соединений с Нижняя NOSC требуют более энергичных чаи для того, чтобы быть сокращены. Соединения с NOSC менее чем −2 требуют высокой энергии, уступая чаи как O2, нитрат или MnIVи не должно ухудшаться часто встречающихся меньше энергии, уступая чаи, такие как FeIII или сернокислый7. Это является важным фактором в заболоченных анаэробных условиях в водно-болотных угодий, где O2 и других высоких энергий, уступая чаи являются скудными9 и, следовательно, ухудшение состояния нижней NOSC соединений в этих условиях термодинамически ограничены. Экологические возмущений могут влиять термодинамического состояния экосистемы через гидрологических изменений, которые влияют O2 (наиболее энергичных акцептора электронов), изменения в органических субстратов и акцепторов электронов, доступны на начальной производство и в меньшей степени температуры. Важным примером температурных эффектов в водно-болотных угодий системах происходит в отношении компромисса, который происходит между homoacetogenesis (то есть, ацетат производство с CO2 и Ч.2) и hydrogenotrophic (при этом освобождается метан то есть, CH4 производства с CO2 и Ч.2). При низких температурах он кажется что homoacetogenesis слегка выступает, в то время как потепление пользу CH4 производства10. Этот эффект температуры могут иметь важные последствия для реакции экосистем к изменению климата, как CH4 является парниковым газом гораздо сильнее, чем CO211 и, следовательно, увеличения производства CH4 на счет по CO2 при повышенной температуре может способствовать положительной обратной связи с потеплением климата.
Болот производят глобально значительное количество CO2 и CH46через микробной дыхание естественным органическим вопрос. NOSC субстраты органического углерода определяет относительную долю CO2: CH4 производства, который является критическим параметром из-за более высоких радиационное CH4 по сравнению с CO211, но и потому, что Моделирование усилия определили это соотношение как критический параметр для оценки потока C в торфяниках12. В отсутствие акцепторов электронов терминала помимо CO2, он может быть отображено электрона баланс органических субстратов C с NOSC > 0 будет производить CO2: CH4 > 1, органического углерода с NOSC = 0 производит CO2 и CH4 в эквимолярных соотношение и органического углерода с NOSC < 1 будет производить CO2: CH4 < 113. Разложение OC в природных экосистемах опосредовано микроорганизмов, так что даже когда деградация конкретного соединения термодинамически возможна, она кинетически ограничивается деятельность микробных ферментов и в анаэробных условиях, по термодинамические движущей силы (т.е., NOSC)7. До сих пор сложно полностью характеризуют органического вещества, потому что разнообразие составляющих требует различных дополнительных методов для их описания. Последние достижения закрыли этот разрыв; с помощью набора аналитических методов мы можем анализировать большой ассортимент органических соединений, обеспечивая молекулярном уровне квалификации и, в некоторых случаях количественной оценки, от небольших первичных метаболитов как глюкозы до 800 да поли гетероциклов. Ранее такие большие сложные молекулы бы характеризуются просто как лигнин как или танин как и предполагаемой были непокорных. Характеристика молекулярно уровня, однако, позволяет расчета NOSC даже этих больших сложных молекул. Эти значения NOSC линейно коррелируют с термодинамическим движущей силой, позволяя для оценки качества органических веществ для разложения, которые во многих случаях показывает, что эти сложные молекулы фактически может быть микробиологически разложению даже в анаэробных условиях, которые преобладают в водно-болотных угодий.
Поскольку введение O2 позволяет органического вещества почти все естественно наблюдаемых значений NOSC чтобы разложить, здесь мы сосредоточиться на изменения в органических веществ и микроорганизмов протеомики, которые, скорее всего быть основными причинами в водно-болотных угодий (т.е., ограниченное O2) систем. Однако все методы, которые мы будем обсуждать может применяться для органического вещества из любой экосистемы. Обычно массовых измерений на основе оптических и флуоресценции анализы были использованы для оценки качества органического вещества3,14. При использовании массовых измерений такие, однако мелкие детали теряются как большое количество молекул классифицируются вместе под общие термины как гуматы или fulvics. Определения этих категорий не являются хорошо ограничением и в самом деле, могут отличаться от исследования для изучения сравнение невозможно. Кроме того массовых измерений не обеспечивают молекулярных деталях, необходимых для расчета термодинамики, регулирующие системы и поэтому оправдывают поистине оценки качества органических веществ15.
Отдельные методы, такие как Фурье преобразование ионного циклотронного резонанса масс-спектрометрии (FTICR-MS), спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), газовая хроматография массовые спектрометрии (ГХ-МС) и делать жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия (LC-MS) предоставления такого молекулярного уровня детализации. Хотя каждый из этих методов представляет свои собственные ограничения, они также приносят свои сильные стороны, которые могут быть использованы в рамках комплексного подхода для достижения тонкой молекулярных деталях, необходимых для количественной оценки качества органического вещества в строгий термодинамических смысле . GC-MS полезен для выявления критических малых метаболитов, которые, вероятно, проксимальной влияние на CO2 и CH4 производства (например, глюкоза, ацетат и т.д.); Однако GC-MS требует проверки против стандарта и поэтому ограничивается уже известных соединений, присутствующих в базе предотвращения идентификации новых соединений. Кроме того GC-MS — полу качественная техника позволяя вывод об изменениях в относительной концентрации, но не предоставляет фактической концентрацией необходимую информацию для вычисления Гиббса свободной энергии, например. Наконец GC-MS требует деривации молекул до анализа, который ограничивает резолюции соединений меньше ~ 400 да и летучих спирты теряются во время сушки шага.
Одномерный (1D) 1H ЯМР жидкое состояние позволяет высоко количественных характеристик мелких метаболитов (включая первичный небольшой молекулярной массой метаболитов и летучих веществ как спирты, ацетат, ацетон, формате, пируват, сукцинат, короткоцепные жирных кислот, а также широкий спектр углеводов заведомо отсутствует или нарушенной из методов на основе MS) и особенно полезны для вычисления термодинамических параметров их концентрации. Тем не менее как и GC-MS, ЯМР 1D сложных смесей требует стандартизации по отношению к базе данных и поэтому самостоятельно не позволяют легко идентифицировать новых соединений, которые могут быть обильные в сложных природных и изменение экосистем. Кроме того, менее чувствительны, чем MS-методы на основе ЯМР и таким образом, количественные метаболит профилирование достигается только выше 1 мкм с помощью ЯМР систем, оснащенных гелий охлаждаются холодной зондов. Оценил не широко, некоторые холодной ЯМР-зонды солеустойчивое и позволяют проводить анализ экологической смеси в присутствии millimolar концентрация соли при использовании меньшего диаметра (< 3 мм Наружный диаметр) образец трубы16. Однако, дальнейшее осложнение ЯМР является то, что большое количество парамагнитных металлов и минералов (например, Fe и Mn выше 1-3 wt %), которые могут быть обильные в горных почв, можно расширить спектральные характеристики и усложнить толкование спектров ЯМР . С помощью твердой фазы экстракции (SPE) могут помочь в интерпретации ЯМР и на основе MS метаболомики методы уменьшая минеральных солей и увеличивая спектрального качества.
FTICR-MS путем прямого впрыска чувствительный техника способны обнаруживать десятки тысяч метаболитов от одного образца, но он не захватить критических небольшой метаболитов например ацетат, пируват и сукцината и сложно использовать для сахара и других углеводов17, и она не обеспечивает количественной информации. Однако в отличие от других методов, FTICR-MS выделяется на определение и назначение Молекулярная формула Роман соединений и таким образом определяет наибольшее количество соединений, обеспечивая более молекулярных информации, чем любой из описанных методов. Это полезно, потому что молекулярные, представленная FTICR-мс (и другие методы) может использоваться для вычисления NOSC, которое связано с термодинамическим движущей силой, управляющих вероятность определенных реакций8 и их ставки при определенных 7условия. Кроме того путем соединения FTICR-MS с разделение методов, таких как LC вместе с тандем МС, количественные структурная информация может быть достигнуто, компенсировать некоторые из недостатков этого метода. LC-MS полезен для выявления соединений липидов как и другие метаболиты, которые не являются хорошо изученных любым из других методов. Муфта FTICR LC-MS или LC-MS с коллектор фракций и сбора фракций конкретных неизвестных интерес для структурных разяснения двухмерный (2D) жидкого состояния, которую ЯМР-это идеальная ситуация для идентификации и количественного определения неизвестных соединений18 ,19. Однако это очень много времени шаг, который может использоваться при необходимости. Взятые по отдельности, каждый из этих методов предоставляют различные снимок органического вещества, и путем их интеграции, мы можем достичь более полного понимания, чем с помощью любого из методов в изоляции.
В то время как термодинамические вопросы задать конечной ограничения на какие преобразования возможны в системе, разложения органических веществ при посредничестве микроорганизмов, чья деятельность фермента контролировать скорость реакции. Таким образом, полного понимания элементов управления на разложение органического вещества и в конечном итоге парниковых газов (CO2 и CH4) производства от водно-болотных угодий требует комплексной омику подхода к характеристике микробной ферментативной активности, а также метаболиты. В этой статье мы описываем метод для достижения такого всеобъемлющего анализа от одного образца, используя последовательный подход, который приводит к полностью парных анализа. Такой подход расширяет метаболит, белков и липидов протокол извлечения (MPLex) в котором протеомики был увязан с GC-MS и LC-MS20 для выявления мелких метаболитов, белки и липиды путем включения количественных метаболит информации через ЯМР и идентификации крупных вторичных метаболитов через FTICR-г-жа слегка отличается от MPLex, мы начинаем протокол с водной вытяжке и затем использование последовательного извлечения с все более неполярных растворителей. Все экстракции производится на один образец, который экономит пример, когда объемы являются ограниченными или трудно получить и уменьшается экспериментальной ошибки представил через различия между аликвоты из гетерогенных образец матрицы (например, почвы и торф) или различия в условиях хранения и продолжительности.
Наконец путем соединения ом анализов с протеомики анализов микробных, мы можем построить метаболических сетей, которые описывают пути и преобразование разложения органического вещества. Это позволяет нам проверить определенных гипотез о влияние возмущений в систему конечной CO2 и CH4 производства путем изменения имеющихся органических субстратов, акцепторов электронов и микробных сообществ посредничество по реакции через активность фермента катализаторов.
Общая цель этого метода является предоставить единый пропускной способности протокол для анализа метаболитов, липиды и микробных белков от одного образца, создавая тем самым полностью парных dataset для создания метаболических сетей хотя ограничение анализа ошибок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. последовательное извлечение органического вещества из почвы, отложений или торфа
- Собирать почвы, отложений или торфа через керна и деление ядер согласно гипотезе проходит проверку (например, глубина). Хранить образцы в политетрафторэтилена покрытием контейнеров и заморозить при температуре-80 ° C для хранения до анализа.
Примечание: Примерно 25 мг C необходима для этого протокола. Торф (как правило, 45% C) 50 мг торфа сушеный не требуется. Большие объемы выборки могут быть необходимы для низкой органических образцов, как минеральные или лесом возвышенностей почвы в зависимости от C содержание (до 5 g). Потому что экстракции органических растворителей будет тянуть любой полиэтиленгликоля (PEG) экстракты, которые отрицательно скажутся на ионизации во время шага 2.4, важно избежать образцы связаться пластика в любой момент во время сбора, хранения или Извлечение. - Когда будете готовы анализировать образцы, заморозить сухой до постоянного веса, а затем шлифуют образцы в высокоскоростной шаровой мельнице с использованием нержавеющей стали мелющие шары для гомогенизации и разрушить любые агрегатов.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и материал хранится при температуре-80 ° C. - Использование этанола мыть посуду из нержавеющей стали, аликвота 50 мг каждого из высушенных образцов в индивидуальных 2 мл стеклянных флаконах. Эти образцы будут последовательно извлечены с помощью ряда растворителей последовательно извлечь все полярных метаболитов из каждого образца. Добавить 1 мл дистиллированной, дегазации воды (H2O) для каждого образца, Крышка флакона и встряхнуть для 2 h на таблицу шейкер.
- После встряхивания позволяют решения постоять 20 минут, а затем центрифуги на 15000 x g 30 мин при комнатной температуре (RT), декантируют и сохранить супернатант от каждого.
Примечание: Эти решения будут вводиться в FTICR-MS путем прямого впрыска. - Поведения Folch извлечения21 (также известный как MPLEx20) теперь воды извлеченных остатков, повторив шаги 1.3 и 1.4, подставляя 1 мл-20 ° c 4:3 смесь хлороформ: метанол для воды в шаге 1.3.
Предупреждение: Хлороформе и метаноле высоко горючих и токсичных. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы избежать контакта с кожей и избежать открытого пламени. - Осторожно отделить два результате растворителя слои, которые будут визуально различимы, для отдельного анализа с помощью разделение по FTICR-MS воронки или просто удалить верхний слой, тщательно закупорить.
Примечание: Хлороформ содержащих фракция будет внизу, а метанола содержащих фракция менее плотной и будет на вершине. - Разбавьте экстракт хлороформ (шаг 1.6) 1:1 в метаноле и водный экстракт (шаг 1.4) 2:1 в метаноле улучшить эффективность ионизации (ESI) электроспрей для FTICR-MS путем прямого впрыска.
Примечание: Метанол содержащие фракции от шага 1.7 не нужно разбавлять далее в метаноле. Метанол слой будет выполняться путем прямого впрыска на FTICR-MS.
Анализ 2.FTICR-MS
- Калибровки спектрометра FTICR непосредственно вводя 100 мкл раствора настройки (см. Таблицу материалы) охватывающих массовые спектр приблизительно 100-1300 Да в FTICR-MS.
- Подготовку Суванни реки фульво кислоты стандарт (см. Таблицу материалы), сделав 1 мг-1 мл раствора в сверхчистого фильтрованной воды и затем разбавления полученный раствор-20 мкг мл-1 в метаноле.
- Напрямую впрыскивают 23 мкл этого окончательного решения к источнику ESI, в сочетании с FTICR спектрометр через шприцевый насос, установите скорость потока 3.0 мкл мин-1. Установите напряжение иглы для +4.4 кв, Q1 до 150 м/z и стеклянный капилляр при 180 ° C. Проверить полученный спектры с использованием программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы), для подтверждения качества данных.
- Перед запуском образцов и всей выборки используйте ВЭЖХ класс метанола для отслеживания уноса. Ввести 23 мкл каждого экстракт через прямого впрыска к источнику ESI, в сочетании с FTICR спектрометр через шприцевый насос, установите скорость потока 3.0 мкл мин-1. Установите напряжение иглы для +4.4 кв, Q1 до 150 м/z и стеклянный капилляр при 180 ° C.
- Регулировка времени накопления иона (IAT) для каждого образца или группы образцов для учета изменения концентрации C. Типичные значения составляет от 0,1 до 0,3 s. собирать 144 сканирование для каждого образца, средняя сканирует и затем проводить Внутренняя калибровка с помощью гомологичных CH2 (т.е. 14 разделения Da) серии.
Примечание: После анализа FTICR-MS, может быть принято решение либо объединить воду и метанола получены фракций для того чтобы упорядочить оставшиеся шаги или фракций могут храниться отдельно на последующих этапах. В ходе обсужденияподробно описаны преимущества и недостатки каждого подхода. Если таким образом, комбинат воды и метанола извлечены фракций. - Сухие экстракты, используя концентратор и сохраните оставшуюся часть экстрактов (~ 1 мл) для последующего ГХ-МС (вода, метанол или воды + метанола), LC-MS (хлороформ) и ЯМР (вода + метанола) анализа.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и материал хранится при температуре-20 ° C.
3. FTICR-MS обработка данных
- Совместно выровняйте все списки выборки пик для всего набора данных для уменьшения массы сдвигов и стандартизировать пик назначений с использованием Formularity программное обеспечение22 впереди формула назначения.
- С помощью программного обеспечения Formularity22 назначить молекулярную формулу с помощью сигнал шум больше 7, массовые измерения ошибки < 1 ppm и позволяя C, H, O, N, S и P, исключая все другие элементы.
- Если несколько кандидатом формул возвращаются для заданной массы (частые выше 500 Da) ограничения в соответствии с материалом, исследуемом методом выборки. Например, в торфе, типичные ограничения включают: низкие массовые ошибки, наименьшее количество гетероатомами (N, S, P), и когда присутствуют, P должны быть в окисленной формы (то есть, должен существовать по крайней мере 4 O атома для каждого атома P в формуле).
4. Химическая деривации для GC-MS
- Подготовка образцов пустой элемент управления гексана ВЭЖХ класс GC-MS Автоматический пробоотборник флаконов23. Растворите 100 мг метиловые эфиры жирных кислот (Фиелд: C8 - C28) стандарта в 200 мкл гексана времени удержания смесь.
- Чтобы защитить карбонильных групп, добавьте 20 мкл 30 мг-1 мл methoxyamine гидрохлорида пиридина в каждой из метанола экстрактов и воды экстрактов (или экстракты комбинированных метанола и воды при использовании) из шага 2.6, заготовок и славы калибровочных образцов23. Герметизации флаконов с крышками.
Предупреждение: Пиридина высоко токсичными и легковоспламеняющимися. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты для предотвращения кожу или глаза и избегать открытого пламени. Кроме того пиридин volatilizes на RT, вызывая загрязнения воздуха вредными. Работе только в хорошо вентилируемых помещениях под вытяжного шкафа. - Вихревой экстракты для 20 s. Sonicate экстрактов для 60 s. Затем Инкубируйте экстрактов в центрифуге при 37 ° C на 100 x g 90 мин.
Примечание: Чрезмерное количество углеводов или соли может привести к метаболитов crystalize после сушеные вниз. Sonicating образцы поможет воссоздать метаболитов выкристаллизовались в derivatizing реагента. - После инкубации, добавьте 80 мкл N-метил - N-(триметилсилиловые) trifluoroacetamide с 1% Триметилхлорсилан для каждого образца, вихревой экстракты для 20 s. Sonicate экстрактов для 60 s и инкубировать экстракты снова в центрифуге при 37 ° C за 30 мин при 100 x g.
- Прохладный экстрактов для RT (20-24 ° C), затем перевести на GC-MS Автоматический пробоотборник флаконов.
5. GC-MS анализ
- Настройки и калибровки MS согласно рекомендациям производителя (см. Таблицу материалы) перед анализом, чтобы убедиться, правильно читать данных MS машины. Убедитесь, что давление газа гелия в пределах заданного допуска.
- Отдельные полярных метаболитов на столбец GC (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм). Установите протокол температуры духового шкафа следующим: (1) начальная температура 60 ° C в течение 1 мин, (2) Нагрейте до 325 ° C со скоростью от 10 ° C мин-1и (3) провести на 325 ° C за 5 мин.
- Анализировать экстрактов с помощью GC, в сочетании с одного квадрупольного г-жа Set инъекций порт температуру постоянной 250 ° C. Придать 1 мкл каждого derivatized экстракта в splitless режиме.
6. GC-MS обработка данных
- Проверяйте все файлы данных для обеспечения, что они правильно были захвачены. Обратите внимание на потенциальные изменения внутренние стандартные удержания раз и интенсивности, чтобы подтвердить, что которые последовательно были собраны данные по всему анализ.
- Преобразуйте формат поставщика данных MS в общий формат MS, если требуется. Процесс необработанных данных файлов с помощью MetaboliteDetector24 калибровки удержания индексов, основанных на внутренних стандартов славы. После выравнивания времени удержания всех файлов данных, продолжают с деконволюция и, наконец, метаболит идентификации путем сопоставления показателей удержания и ГХ-МС спектры против библиотека полярные метаболиты FiehnLib25.
- Кросс проверить оставшиеся неизвестными метаболитов против библиотека NIST14 GC-MS, с использованием спектральных соответствия. Проверка идентификации отдельно, чтобы устранить ложные опознавательные обозначения и сокращения деконволюция ошибок.
7. жидкость государства ЯМР анализ
- Разбавить оставшуюся часть водных экстрактов (~ 300 мкл) на 10% (vol/vol) 5 мм 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 внутреннего стандарта. Кроме того, комбинат воды и метанола выдержки из шага 1 то resubstitute в воде. При этом, однако, некоторые из летучих соединений могут быть потеряны во время Плаурайта шага. Типичный пример окончательного тома находятся в диапазоне от 180-300 мкл.
- Передача смеси в трубку боросиликатного стекла ЯМР высокого качества 3 мм Наружный диаметр (диаметр).
- Собирайте спектры с помощью ЯМР-спектрометр (в идеале по меньшей мере 600 МГц), с 5 мм тройной резонанс солеустойчивое холодной зонд и холодной углерода предварительный усилитель.
- Сбор 1D 1H спектры с использованием 1 D ядерной Оверхаузера эффект спектроскопии (NOESY) presaturation эксперимент в 298 K с 4 времени приобретения s, 1,5 s корзины задержки, 65.536 сложных очков и 512 сканирования.
- Сбор 2D 1H -13C гетероядерных сингл квантовые корреляции (HSQC) и 1H -1H общая корреляция (TOCSY) спектры для оказания помощи в назначении метаболитов и проверки.
- Процесс, назначить и анализировать все спектры с использованием программного обеспечения для анализа ЯМР (см. Таблицу материалы) для количественного определения интенсивности относительно внутреннего стандарта. Идентифицировать метаболитов путем сопоставления информации о химических shift, J-муфта и интенсивности в образцах против библиотеки.
Примечание: Библиотека подкрепляется пользовательских целевых метаболит стандартов и метаболит дополнениями на регулярной основе. Протокол может быть приостановлена на данный момент и материал хранится при температуре-20 ° C.
8. LC-MS Lipidomics анализ
- Белгосэкспертизы экстракт сушеные хлороформ, созданные во время шага 2,5 с 200 мкл метанола.
- Inject 10 мкл каждого экстракта в ультра производительность жидкостный хроматограф, в сочетании с Орбитрэп масс-спектрометр с использованием обратной фазы взимается поверхности гибридные столбца (размер частиц мкм 3,0 мм × 150 мм × 1.7). Установить градиент 34-мин (мобильный этап A: Ацетонитрил/H2O (широколиственные), содержащие ацетата аммония 10 мм; мобильные этап B: Ацетонитрил/изопропанол (составлявшее) содержащие ацетата аммония 10 мм) со скоростью потока 250 мкл/мин использования отрицательных и положительных ионизации режимов с более высокой энергии столкновения диссоциации и столкновения индуцированной диссоциации.
ОСТОРОЖНОСТЬ: Ацетонитриле, глаз, кожи и раздражение дыхательных путей. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты. Кроме того Ацетонитрил горючих. Не позволяют связаться с окисляющих агентов, токсичные газы могут быть произведены во время горения. - Загрузите raw файлов данных LC-MS/MS в жидкость вместе с целевого файла (например, список видов > 25,000 липидов) для режима соответствующих ионизации (положительный или отрицательный). Процесс raw файл. Вручную проверяйте результате идентификации путем изучения МС/МС спектры для присутствия диагностических ионов, если применимо, соответствующий фрагмент ионов (например, жирное ацильные цепи), разделения изотопов, массовые ppm ошибка прекурсоров, и время сохранения. Экспортируйте в файл .tsv результирующий список уверенно выявленных липидов.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и хранить материал в-20 ° C.
9. протеомики анализ
- Экстракт белков согласно протоколу MPLEx20 из оставшейся части этапа метанола, обусловленных шаг 2.4, путем промывания экстракт объемом 20 раз экстракт метанола дополнительных холодная (-20 ° C).
- Используйте 1 мл/50 мг на основе силики сорбента (см. Таблицу материалы) для состояния C18 SPE столбцы с 3 мл метанола, 2 мл 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в воде, с последующим добавлением экстракта из шага 9.1 со скоростью не более 1 мл/мин.
- После добавления образца промойте колонку с 4 мл 95:4.9:0.1 воды: acetonitrile:TFA, а затем дайте высохнуть. Место 1,5 мл тюбик коллекции в столбце SPE, а элюировать образца с 1 мл раствора 80:19.9:0.1 метанола: вода: TFA.
- Концентрат экстрактов для 100 мкл под при помощи вакуума замораживания сушки, затем измерить концентрацию белка bicinchoninic кислоты (BCA) колориметрические пробирного26 на длине волны 562 Нм.
- Центрифуга выдержки на 10000 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить полученный супернатант и сухой оставшиеся таблетки под вакуумом для 5 минут Ресуспензируйте Пелле белков в воде до конечной концентрации 0,1 пептиды мкг за мкл.
- Добавить Дитиотреитол в конечной концентрации 5 мм и Инкубируйте на 60 ° C в течение 30 мин развести в 10 раз с 100 мм NH4HCO38 M раствор мочевины и инкубировать при 37 ° C 3 h в присутствии 1 мм CaCl2 и свинину трипсина в 1:50 и фермента белка отношение.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и хранить материал при-20 ° C. - Отдельные выдержки через жидкостной хроматографии с использованием экспоненциальной градиент 0,1% муравьиной кислоты в мобильных в водной фазе (A) и 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле мобильных фазы (B) в 10 kpsi и 500 nL мин-1.
- Ввести полученный элюента в сочетании ESI масс-спектрометр сбор спектров от 400-2000 m/z с 100000 резолюции на m/z 400 в масс-спектрометр линейной ионной ловушки (LTQ)-Орбитрэп.
- Конвертируйте файлы RAW спектры в mzML формате, с использованием msConvert или ProteoWizard, принимать все параметры по умолчанию. Используйте средство поиска универсальной базы данных MSGFPlus для поиска результате протеомов к базе данных целевых белков, белковых последовательностей, предсказал от соответствующих metagenome собрал геномов.
- Добавление общих загрязнителей (например, трипсин, кератин, альбумин) и удалить все точно дублируется белковых последовательностей для улучшения статистики матча пептид масс спектрометрии. Оцените результирующее оценки спектральной вероятности MSGF чтобы определить какие пептид масс спектра матч лучше. Используйте Q-значение от MSGFPlus для фильтрации данных весь ворс к ставке 1% ложных обнаружения (ДРД).
10. метаболомики анализ и метаболических сети здания
- Скомпилируйте все метаболит Молекулярная формула определены в шагах 3, 6, 7 и 8 в одну базу данных метаболитов в образцах. Объединить эти метаболиты с фермента Комиссии (EC) или KEGG Гомология (KO) количество ферментов, идентифицированную на шаге 9. Поиск этот объединенный набор данных против27 базы данных KEGG, метаболические пути секции.
- Вручную оцените результаты, чтобы определить наиболее вероятные пути и интегрироваться в модель метаболизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы выступали описывается дополнительный анализ протокола и сравнении торфа с глубиной в болоте S1 в узле ель и торфяников ответ под изменения среды (ель) в штате Миннесота, США. Эти результаты сравниваются с теми из вечной мерзлоты трясин и низинных болот от Северной Швеции, чтобы показать, как сайты могут отличаться в деятельности метаболита и фермента. Мы определили 3312 ферментов в анализе протеомики. Анализ деятельности ферментов с глубиной показывает, что количество ферментов резко снижается от 15 до 45 см в ЕЛОВЫХ мореный (рис. 1).
В то время как протеомики результаты указывают, какие белки выражаются, метаболические данные показывают, какие реакции происходят на самом деле. В целом, мы определили 67,040 метаболитов (включая липиды) во всех образцов торфа от комбинации FTICR-MS, ЯМР, GC-MS и анализ LC-MS. Из них мы смогли назначить Молекулярная формула для 15,385 соединений (рис. 2). Комбинированных метаболизма данных охватывает диапазон окисления, масс, и составные классы.
Обычно это визуализируется с помощью Ван Krevelen схема, в которой атомной соотношение H/C выявленных Формулы строятся против их атомные соотношения O/C28. Мы включили дополнительный аспект в типичном 2D формат, изображающий NOSC с помощью цветового кодирования символов, представляющих отдельные формулы (рис. 3 и рис. 4). С увеличением глубины в ЕЛОВЫХ болото, является увеличение общего числа крупных вторичные метаболиты определены FTICR-MS, особенно в весьма сжатой (нижний левый угол Ван Krevelen участка) и гидрогенизированные формул (в верхней части участка) (рис. 4 ). Над же глубины понижается в ряд небольших высокоэнергетических соединений, выявленных GC-MS и липиды (рис. 5). Это можно предположить, что липиды и небольших метаболитов потребляются в поверхности торфа до достижения больших глубинах или что разложение цены в глубокой торфа быстрее, чем на поверхности таким образом, что быстро потребляются вниз advecting соединений. Различия между этими двумя конкурирующих гипотез требует понимания уровня процесса C Велоспорт на сайте. Такое понимание уровня процесса могут быть получены только путем соединения наборов данных протеомики и метаболомики. Мы добиваемся этого проверяя кросс-комбинированные FTICR-MS, GC-MS, LC-MS, и ЯМР определены метаболитов в базе данных KEGG. Поступая таким образом, мы находим, что соединения, которые мы определили участвует в общем метаболических цикл трикарбоновой кислоты (TCA), гликолиза и метаболизм сахара. Поскольку отдельные метаболиты могут быть вовлечены в нескольких путей подтверждения с энзимами повышает нашу уверенность в назначении пути (рис. 6).
Через это сопоставление мы находим свидетельства метаболизма сахарозы и крахмала в поверхности торфа, в то время как в больших глубинах пируват и другие продукты ферментации построить вверх (рис. 6). Эти результаты согласуются с первой гипотезы, что сахара и других энергичных метаболитов деградации в поверхности торфа и не достигают больших глубинах торфа. Как видно на рисунке 5, сахаров (NOSC = 0) и аминокислоты (0 < NOSC < 1) потребляются в поверхности торф, а липиды (-2 < NOSC < -1) появляются накопить с глубиной. Это согласуется с ожиданиями, основанными на NOSC значений, что выше NOSC соединения являются более легко деградировавших в то время как нижняя NOSC соединений сохраняются в высоко анаэробные (т.е., чай ограниченной) условий подземных торфа. Этот подход также успешно проводится различие между типами почвы из различных сред. К примеру органического вещества почвы от бореальных болота, как представляется, композиционно различных, чем мерзлоты болота, а также в низинных и болота в регионе вечной мерзлоты. Эти результаты согласуются с предыдущего исследования, которое показало, что различия в сайте геохимии этих местообитаний29, предполагая, что сайт геохимии имеют большое влияние на микробной деградации C под землей.
Рисунок 1 : Протеомики анализ показывает сильный глубина стратификации в количество ферментов. Бары указывают средние и погрешностей указывают одно стандартное отклонение обилия. Это предполагает, что микроорганизмы являются наиболее активными в поверхность торфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Количество соединений, определенных каждой техники на поверхности торфа (< 30 см) из каждого Хабитат, а также середины (45 см) и глубокий (87 см) торф из ЕЛОВЫХ мореный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Ван Krevelen диаграмма (атомной H/C против O/C каждого определены Молекулярная формула) для поверхности (15 см) ели болоте глубиной продемонстрировать освещение соединений, характеризуется каждый метод. FTICR-MS позволяет нам определить наибольшее количество соединений (малые круги), в то время как GC-MS (треугольники) хорошо для дифференциации и выявления сахара (H/C = 2 и O/C = 1). Спектроскопия ЯМР (квадраты) обеспечивает количественную информацию о энергично важных соединений, таких как сахар, аминокислоты, пируват, и т.д. LC-MS (алмазы) предоставляет информацию на липиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Ван Krevelen диаграмма (атомной H/C против O/C каждого определены Молекулярная формула) для глубокой (87 см) ели болоте глубиной продемонстрировать освещение соединений, характеризуется каждый метод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Относительную долю различных химических классов определены через различных методов в различных глубин. Бары строятся как средние значения для каждой глубины ± одно стандартное отклонение. Занятия построены включают в себя аминокислоты, Сфинголипиды (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), диацилглицерол (ГД), триглицериды (ТГ) и сахара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Объединив результаты для создания сети метаболических. Распределений глубины метаболитов, определенных ЯМР () и ГХ-МС (b) и упрощенный метаболических карта (c) выберите количество преобразований, определенных на ель болото. Зеленые прямоугольники указывают, метаболитов, которые уменьшают с глубины, коричневый коробок указывают метаболитов, которые увеличивают с глубиной. Зеленые соединения стрелки указывают фермента, выявленных в нашей dataset, что посредником указано преобразование (фермент EC номера указано рядом со стрелками). Серый соединения стрелки указывают преобразований, для которых ферменты не были определены в нашем наборе данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сингл-пропускная способность, полностью сочетании анализ поток, используемый для характеристики метаболитов и протеом обеспечивает понимание путей, на которых C Велоспорт происходит в сложных экосистем. Почвы и торфа гетерогенной матрицы, и таким образом, одним из важнейших шагов данного метода происходит в первых шагов в обеспечении, что начальный торф или почвы материала является весьма однородной. Желательно измельчить образец хорошо, как агрегатов может снизить эффективность добычи. Это является особой проблемой для агрегированных почв и грунтов с низким C и высокое содержание минеральных, которые могут потребовать использования точильщика шар из нержавеющей стали для адекватно гомогенизировать. Потому что пространственная неоднородность почвы и торфа в рамках экспериментальной площадки может быть высокой, биологических реплицирует настоятельно рекомендуются.
Этот метод использует три растворители: вода, метанол и хлороформе, которые смещения типы соединений, можно извлечь. В принципе этот метод последовательного извлечения следует солюбилизировать последнего соединения, охватывающих диапазон широкий полярности. Однако эти растворители не оптимизированы для получения органо минеральных комплексов или очень стабилизированное комплексов. Если интерес представляют такие соединения, жестче растворители, такие как сильных кислот и щелочей являются предпочтительными, но жестче процессов экстракции могут изменить на химический состав проб. Включение таких растворителей в конце последовательности добыча может свести к минимуму этот эффект. Кроме того хлороформ будут деактивируют клинически важные почвы и торфа бактериальных и вирусных патогенов и других патогенных болезнетворных биологических агентов, растворяя липиды клеточных мембран. Таким образом включение хлороформ в протоколе извлечения снизит риски в биологии исследований образцов, потенциально инфицированных патогенов из различных регионов мира. Если есть опасения по поводу мертвых микробной клетки, мусор или частиц, после извлечения, фильтрации экстракты через 0,2 мкм стекла волокна фильтра рекомендуется.
Для упрощения процесса, воды и метанола экстракты могут быть объединены для анализа ГХ-МС во время шага 4.1. Однако эти экстракты должны оставаться раздельный для анализа FTICR-MS вследствие ионизации эффективности вопросы с источником ESI. Преимуществом работы приточно на GC-MS является, что больше метаболитов (с охватом более широкого круга полярности) будут определены. Недостатком сочетания экстрактов на данный момент является одним из основных метаболитов, важную роль в микробной обработки органического вещества метанола. Следы метанола всегда будет оставаться в образце комбинированные, даже после высыхания, так что если метанола является метаболитом интерес, водный экстракт должна выполняться отдельно. Имея хороший контроль с не аналитов также поможет в определении потенциального загрязнения в образцах.
В шаге 7.1 Подготовка экстрактов для ЯМР анализа, как анализ GC-MS, либо только водный экстракт или комбинированных воды и метанола экстракты могут быть использованы. Недостатки этого похожи на те, которые перечислены в предыдущем пункте. Преимуществом сочетания метанола и воды выдержки является, что некоторые из менее полярных метаболитов, которые солюбилизирован в метаноле фракции будут определены. Однако из-за Плаурайта шаг, многие более летучие соединения будут потеряны. Это особенно невыгодное положение, если количественное определение летучих жирных кислот является важнейшим компонентом эксперимента.
В этой процедуре для выявления протеомики только полностью tryptic пептиды являются поиск, таким образом эндогенного пептидаза деятельности и будет не хватать образовавшиеся в источник. С другой стороны окисленного метионина могут рассматриваться как столб-поступательные изменения для кандидатов, пептид как эта модификация обычно происходит во время выборки переработки и обработки. Количественная оценка ферментов, использование пептида элюции областей может быть сделано, но выходит за рамки данного проекта.
Многие последние достижения в анализе NOM и микробиологических параметров предоставляют множество методов для понимания органических C Велоспорт. Объединив эти методы в единый упрощенный протокол, мы получаем представление новых процессов, которые происходят. Муфта протеомики анализ с метаболический анализ обеспечивает убедительных подтверждающих доказательств, что реакция на самом деле происходит. Метаболический Анализ только ограничен в том, что он сообщает нам, какие метаболитов выше или ниже в концентрации в сопоставлениях между сайтами или после эффект лечения, но не может выявить причины этих изменений. К примеру мы определили снижение концентрации сахара с глубиной в болото, но без дополнительной информации он мутноват ли снижение с глубиной вследствие медленного входы или быстрой деградации в глубоких торфа. Анализ протеома и снижения фермента выражение с глубиной позволяет отклонить второй гипотезе. А наши результаты согласуются с быстрого сахара деградации поверхности торфа ограничивающие входы на больших глубинах. Эти конкретной идеи являются только когда все методы рассматриваются в тандеме, как каждый из них обеспечивает уникальный, но важнейшей частью C Велоспорт головоломки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Chanton Ю.П., ю.е. Костки и м.м. Kolton за помощь в сборе образцов торфа. Часть этой работы были проведены на экологические лаборатории молекулярной наук, Доу из науки пользователя офис под эгидой Бюро биологических и экологических исследований. PNNL эксплуатируется Battelle для Доу под контракт де-AC05-76RL01830. Эта работа была поддержана министерства энергетики США, Отделение науки и управления биологических и экологических исследований (гранты: DE-AC05-00OR22725, де-SC0004632, DESC0010580, де-SC0012088 и де-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
