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Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Abstract

Materia orgánica natural (NOM) se compone de una mezcla muy compleja de miles de compuestos orgánicos que, históricamente, resultó difíciles de caracterizar. Sin embargo, para entender los controles de termodinámicos y cinéticos de producción de gas (dióxido de carbono [CO2] y metano [CH4]) de efecto invernadero resultantes de la descomposición de la NOM, una caracterización del nivel molecular junto con microbiana Análisis del proteoma es necesario. Además, clima y cambios ambientales se espera que perturban los ecosistemas naturales, trastornar potencialmente complejas interacciones que influyen en el suministro de sustratos de materia orgánica y los microorganismos realizar las transformaciones. Una detallada caracterización molecular de la materia orgánica, microbios proteómica, vías y transformaciones por la que se descompone la materia orgánica será necesaria predecir la dirección y magnitud de los efectos de los cambios ambientales. Este artículo describe una capacidad metodológica para la caracterización de metabolitos completa en una sola muestra por inyección directa de Fourier transform ion ciclotrón resonancia espectrometría de masas (FTICR-MS), cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS), Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas cromatografía líquida (LC-MS) y el análisis de proteómica. Este enfoque genera un conjunto de datos totalmente emparejado que mejora la confianza estadística para inferir rutas de descomposición de materia orgánica, la resultante de CO2 y tasas de producción de CH4 y sus respuestas a las perturbaciones ambientales. En este documento presentamos los resultados de aplicar este método a la NOM las muestras recogidas de las turberas; sin embargo, el protocolo es aplicable a cualquier muestra NOM (por ejemplo, turba, suelos forestales, sedimentos marinos, etc.).

Introduction

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A nivel mundial, los humedales se estiman contienen 529 Pg de carbono (C), sobre todo como C orgánico enterrado en turba depósitos1. Actualmente, tales las turberas actúan como sumidero neto de C, secuestrar 29 Tg C y-1 en América del norte sólo1. Sin embargo, perturbaciones ambientales tales como drenaje, incendios, sequías y temperaturas más cálidas pueden compensar este fregadero C aumentando la descomposición de materia orgánica, resultando en mayor C las pérdidas por gases de efecto invernadero (dióxido de carbono [CO2] y producción de metano [CH4]) de1,2. Cambio climático puede contribuir a la pérdida de C si temperaturas o condiciones secador estimulan más rápido C descomposición por microorganismos. Por otra parte, temperaturas más altas y concentraciones de CO2 del aire pueden estimular la producción primaria para secuestrar más de CO2 como carbono orgánico (OC). En qué medida y qué tan rápido que OC se descompone luego en CO2 y CH4 depende de las complejas interacciones entre los substratos donantes de electrones, la disponibilidad de aceptores de electrones y los microorganismos que median la transformación. En muchos casos, los mecanismos no están bien caracterizados, así su respuesta a las perturbaciones ambientales no es bien limitada y no está claro cuál será el resultado del cambio climático en el balance de carbono en ecosistemas de turberas.

La compleja naturaleza de la materia orgánica natural (NOM) ha hecho incluso identificar los compuestos orgánicos presentes en las mezclas NOM históricamente difíciles. Recientes avances han mejorado nuestra capacidad de caracterizar compuestos que tradicionalmente y, en cierta medida, considerarse como recalcitrante húmicos o fúlvicos compuestos3,4,5. Ahora entendemos que muchos de estos compuestos son realmente microbios disponibles y pueden ser descompuestos si un aceptor de electrones terminal adecuado (TEA) es hecho disponible6,7. Calcular el estado de oxidación nominal del carbono (NOSC) de un compuesto proporciona una métrica para predecir el potencial de descomposición y la producción de energía del té requerida. Sin embargo, requiere una caracterización del nivel molecular de la materia orgánica7. NOSC se calcula de la fórmula molecular mediante la siguiente ecuación7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, donde z es la carga neta. NOSC está relacionada con la termodinámica conducción fuerza8, en donde son más fáciles de degradar, mientras que compuestos con menor NOSC requieren infusiones cada vez más enérgicos para reducir compuestos con mayor NOSC. Compuestos con menor que −2 NOSC requieren una energía alto rendimiento tés como O2, nitrato o MnIVy no pueden ser degradados por que ocurren comúnmente bajar energía produciendo tés como el FeIII o sulfato7. Esta es una consideración importante en las condiciones anóxicas empapadas en humedales donde O2 y otros alta energía produciendo tés son escasos9 y por lo tanto la degradación de compuestos NOSC inferiores en estas condiciones termodinámico limitada. Perturbación ambiental puede influir en el estado termodinámico del ecosistema a través de cambios hidrológicos que influyen O2 (el más energético aceptador del electrón), cambios en los sustratos orgánicos y aceptadores del electrón disponibles por primario producción y en menor medida por la temperatura. Un ejemplo importante de los efectos de temperatura en sistemas de humedales se produce con respecto a la compensación que se produce entre homoacetogenesis (es decir, la producción de acetato de CO2 y H2) y (metanogénesis) hydrogenotrophic es decir, producción de CH4 CO2 y H2). A bajas temperaturas parece que homoacetogenesis es un poco favorecido, mientras que las temperaturas más cálidas favorecen CH4 producción10. Este efecto de la temperatura puede tener implicaciones importantes para la respuesta de los ecosistemas al cambio climático, como el CH4 es un gas invernadero mucho más fuerte que el CO211 y así aumentar la producción de CH4 a expensas de CO2 en las temperaturas más cálidas pueden contribuir a una regeneración positiva con el calentamiento climático.

Las turberas producen a nivel mundial grandes cantidades de CO2 y CH46a través de la respiración microbiana de origen natural orgánico materia. NOSC de los substratos de carbono orgánico determina la proporción relativa de CO2: CH4 producido que es un parámetro crítico debido a la mayor forzamiento radiativo de CH4 en comparación con CO211, sino también porque esfuerzos de modelado han identificado esta relación como un parámetro crítico para estimar el flujo de C en las turberas12. En la ausencia de aceptadores del electrón terminal diferente a CO2, puede ser demostrado por el equilibrio de electrones que los sustratos orgánicos de C con la voluntad de > 0 NOSC producen CO2: CH4 > 1, C orgánico con NOSC = 0 produce CO2 y CH4 en relación equimolar y el C orgánico con NOSC < 1 producen CO2: CH4 < 113. Descomposición de OC en los ecosistemas naturales está mediatizada por microorganismos, por lo que aun cuando la degradación de un compuesto específico es termodinámicamente factible, es cinéticamente limitado por la actividad de enzimas microbianas y, bajo condiciones anóxicas, por el fuerza impulsora termodinámica (es decir, NOSC)7. Hasta ahora ha sido difícil para caracterizar completamente la materia orgánica debido a la diversidad de compuestos presentes requiere diferentes técnicas complementarias para su caracterización. Los avances recientes han cerrado la brecha; con una serie de técnicas analíticas podemos analizar una amplia gama de compuestos orgánicos proporcionando caracterización nivel molecular y, en la cuantificación de algunos casos, de pequeños metabolitos primarios como glucosa hasta 800 Da poli-heterociclos. Previamente tales moléculas complejas grandes habría caracterizadas simplemente como lignina-como o como tanino y asumido para haber sido recalcitrantes. Caracterización del nivel molecular, sin embargo, permite el cálculo de NOSC para estas grandes moléculas complejas. Estos valores NOSC se correlacionan linealmente con la fuerza impulsora termodinámica que permite una evaluación de la calidad de la materia orgánica disponible para la descomposición, que en muchos casos revela que estas moléculas complejas pueden ser microbios degradable incluso bajo las condiciones anóxicas que prevalecen en los humedales.

Introducción de O2 permite la materia orgánica de casi todos los valores NOSC naturalmente observadas a descomponer, en este documento nos centramos en cambios en la materia orgánica y microbiana proteómica que es probable ser los conductores primarios en humedales (es decir, sistemas LIMITADA O2). Sin embargo, todas las técnicas que vamos a discutir pueden aplicarse a materia orgánica de cualquier ecosistema. Comúnmente, mediciones masivas basan en óptica y análisis de la fluorescencia se han utilizado para evaluar la calidad de materia orgánica3,14. Cuando se utiliza a granel medidas como éstas, sin embargo, detalles finos se pierden como grandes números de moléculas se clasifican juntos bajo términos genéricos como substancias húmicas o fulvics. Las definiciones de estas categorías no son bien limitadas y, de hecho, pueden variar las comparaciones de un estudio a otro haciendo imposible. Además, mediciones masivas no proporcionan el detalle molecular necesario para el cálculo de la termodinámica que rigen el sistema y por lo tanto, distando realmente evaluar la calidad de materia orgánica15.

Técnicas individuales tales como Fourier transforman ciclotrón resonancia spectrometry total de ion (FTICR-EM), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía de gases masa espectrometría total (GC-MS) y espectrometría de masas cromatografía líquida (LC-MS) hacer proporcionar tales detalles a nivel molecular. Mientras que cada una de estas técnicas presenta sus propias limitaciones, que también traen sus propias fortalezas que pueden aprovecharse en un enfoque integrado para lograr el fino detalle molecular necesario para cuantificar la calidad de la materia orgánica en un sentido termodinámico riguroso . GC-MS es útil para identificar metabolitos pequeños críticos que puedan tener influencia proximal en CO2 y CH4 producción (p. ej., glucosa, acetato, etc.); sin embargo, GC-MS requiere verificación contra un estándar y por lo tanto se limita a compuestos ya conocidos presentes en la base de datos prevención de identificación de nuevos compuestos. Además, GC-MS es una técnica semi-cualitativa que permite la inferencia sobre los cambios en concentraciones relativas, pero no proporciona la información real de la concentración necesaria para el cálculo de las energías libres de Gibb por ejemplo. Por último, GC-MS requiere derivatización de moléculas antes del análisis, que limita la resolución a compuestos más pequeños que Da ~ 400 y alcoholes volátiles se pierden durante la etapa de secado.

Unidimensional (1D) 1H NMR de estado líquido permite altamente cuantitativa caracterización de metabolitos pequeños (incluyendo metabolitos primarios pequeño peso molecular y volátiles como alcoholes, acetato, acetona, formiato, piruvato, succinato, ácidos grasos de cadena corta, así como una variedad de carbohidratos notoriamente ausentes o comprometidas de métodos basados en MS) y sus concentraciones son particularmente útiles para el cálculo de parámetros termodinámicos. Sin embargo, como GC-MS, 1D NMR de mezclas complejas requiere estandarización con respecto a una base de datos y por lo tanto no solo permite fácil identificación de nuevos compuestos que pueden ser abundantes en los ecosistemas naturales y cambiantes complejo. Además, NMR es menos sensible que las técnicas basadas en MS y por lo tanto, metabolito cuantitativo de perfiles se logra sólo por encima de 1 μm utilizando NMR sistemas equipados con sondas de frío refrigerado por helio. No muy apreciado, algunas sondas de frío NMR son tolerantes a la sal y permiten análisis ambiental de la mezcla en presencia de concentraciones de sal milimolar en menor diámetro (< 3 mm de diámetro exterior) muestra tubos16. Sin embargo, otra complicación de la RMN es que altas cantidades de metales paramagnéticos y minerales (p. ej., Fe y Mn por encima de 1-3% en), que puede ser abundante en suelos de secano, puede ampliar características espectrales y complicar la interpretación de los espectros de RMN . Usando extracción en fase sólida (SPE) pueden ayudar en la interpretación de la RMN y MS base metabolómica métodos de reducción de las sales minerales y aumentando la calidad espectral.

FTICR MS por inyección directa es una técnica muy sensible capaz de detectar miles de metabolitos de una sola muestra, pero no captura los metabolitos pequeños críticos como acetato, piruvato, succinato y es muy difícil de uso de azúcares y otros hidratos de carbono17, ni aporta información cuantitativa. Sin embargo, a diferencia de las otras técnicas, FTICR-MS se destaca en la identificación y asignación de fórmula molecular a compuestos novedosos y por lo tanto identifica el mayor número de compuestos moleculares más información que cualquiera de las otras técnicas descritas. Esto es útil, porque las informaciones moleculares FTICR-MS (y otras técnicas) se pueden utilizar para calcular NOSC que se relaciona con la fuerza impulsora termodinámica que gobiernan la probabilidad de que sus tarifas bajo ciertas y determinadas reacciones8 condiciones7. Además, por acoplamiento FTICR-MS con técnicas de separación, como LC junto con tandem MS, información estructural cuantitativa se puede lograr, compensando algunas de las desventajas de esta técnica. LC-MS es útil para identificar compuestos lípido-como y otros metabolitos que no están bien caracterizadas por cualquiera de los otros métodos. Acoplador LC FTICR-MS o LC-MS con un colector de fracciones y recoger fracciones de incógnitas específicas de interés para la elucidación estructural por el estado líquido de dos dimensiones (2D) NMR es la situación ideal para la identificación y cuantificación de compuestos desconocidos18 ,19. Sin embargo, este es un paso muy desperdiciador de tiempo que podría utilizarse si es necesario. Tomados individualmente, cada una de estas técnicas proporcionan una instantánea diferente de la materia orgánica, y por integrar a los mismos, podemos lograr una comprensión más completa que cualquiera de las técnicas de aislamiento.

Mientras que las consideraciones termodinámicas las restricciones ultimate qué transformaciones son posibles en un sistema, descomposición de materia orgánica es mediada por microorganismos cuya actividad enzimática controla las tasas de reacción. Por lo tanto, comprender plenamente los controles en la descomposición de materia orgánica y producción de gas (CO2 y CH4) de efecto invernadero de los humedales requiere un enfoque integrado ómicas para caracterizar la actividad enzimática microbiana así como los metabolitos. En este artículo, se describe un método para lograr un completo análisis de una muestra mediante un enfoque secuencial que se traduce en un análisis totalmente sincronizado. Este enfoque amplía el metabolito, la proteína y el protocolo de extracción (MPLex) de lípidos en la cual proteómica fue juntado con GC-MS y LC-MS20 para identificar pequeños metabolitos, proteínas y lípidos mediante la incorporación de información metabolito cuantitativo a través de RMN e identificación de los mayores metabolitos secundarios vía FTICR-Sra. ligeramente diferente a MPLex, iniciamos el protocolo con una extracción de agua y luego uso extracción sucesiva con solventes no polares cada vez más. Todas las extracciones se realizan en una sola muestra que conserva la muestra cuando los volúmenes son limitados o difíciles de conseguir y disminuye el error experimental introducido a través de la variación entre alícuotas de matrices de muestras heterogéneas (p. ej., el suelo y la turba) o diferencias en las condiciones de almacenamiento y duración.

Por último, por los análisis de OM con análisis de Proteómica de la comunidad microbiana de acoplamiento, podemos construir redes metabólicas que describen los caminos y la transformación de la descomposición de materia orgánica. Esto nos permite poner a prueba hipótesis específicas acerca de cómo influirá en las perturbaciones al sistema ultimate CO2 y CH4 producción mediante la alteración de los sustratos orgánicos disponibles, aceptadores del electrón y las comunidades microbianas mediar las reacciones a través de la actividad de enzima catalizadores.

El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo de rendimiento individual para el análisis de metabolitos, lípidos y proteínas microbianas de una sola muestra, creando un conjunto de datos totalmente emparejado para la construcción de redes metabólicas y restricción de errores analíticos .

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Protocol

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1. secuencial extracción de la materia orgánica del suelo, sedimentos o turba

  1. Recoger turba mediante perforación, suelo o sedimentos y dividir núcleos según la hipótesis que se está probando (por ejemplo, profundidad). Muestras de la tienda en politetrafluoroetileno cubierto recipientes y congelan a-80 ° C para el almacenamiento antes del análisis.
    Nota: Aproximadamente 25 mg de C es necesario para este protocolo. Turba (típicamente 45% C), 50 mg de la turba seca se requiere. Grandes cantidades de muestra pueden ser necesaria bajo muestras orgánicas como suelos minerales o boscosas tierras altas dependiendo de la C (hasta 5 g) de contenido. Debido a la extracción con solventes orgánicos Tire cualquier polietilenglicol (PEG) en los extractos, lo que afectarán negativamente a ionización durante el paso 2.4, es importante evitar que las muestras en contacto con el plástico en cualquier momento durante la recogida, almacenamiento o extracción.
  2. Cuando esté listo para analizar las muestras, congelar seca hasta peso constante, luego moler las muestras en un molino de bolas de alta velocidad usando bolas de pulido del acero inoxidable para homogeneizar y disolver cualquier agregados.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y el material almacenado a-80 ° C.
  3. Utilizando un utensilio de acero inoxidable lavado con etanol, alícuota 50 mg de cada una de las muestras secadas en frascos de vidrio de 2 mL cada. Estas muestras se extraerán de forma secuencial utilizando una serie de disolventes para extraer consecutivamente cada vez más no polar metabolitos de cada muestra. Añadir 1 mL de agua destilada desgasificada (H2O) a cada muestra, tapa los frascos y agitar durante 2 h en una tabla de la coctelera.
  4. Después de temblor que las soluciones a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos, luego centrifugar a 15.000 x g por 30 min, decantar y guarde el sobrenadante de cada uno.
    Nota: Estas soluciones se inyecta en el MS FTICR por inyección directa.
  5. Conducta un Folch extracción21 (también conocido como MPLEx20) sobre el ahora agua residuos extraídos repitiendo los pasos 1.3 y 1.4 sustituyendo 1 mL de-20 ° C mezcla de cloroformo: metanol de 4:3 para el agua en el paso 1.3.
    PRECAUCIÓN: Cloroformo y metanol son altamente inflamables y tóxicos. Utilice equipo de protección personal (EPP) para evitar contacto con la piel y evitar la llama abierta.
  6. Cuidadosamente separe los dos dando por resultado solvente capas, que estarán visualmente distinguibles, para el análisis separado por FTICR MS usando una separación embudo o simplemente quitar la capa superior mediante pipeteo cuidadoso.
    Nota: La fracción que contiene el cloroformo será en la parte inferior mientras que la fracción que contiene metanol es menos densa y en la parte superior.
  7. Diluir el extracto de cloroformo (criterio 1.6) 1:1 en metanol y el agua (paso 1.4) 2:1 del extracto en metanol para mejorar la eficiencia de electrospray (ESI) de ionización de FTICR MS por inyección directa.
    Nota: La fracción que contiene metanol de paso 1.7 no necesita diluirse más en metanol. La capa de metanol se ejecutará por inyección directa en el MS FTICR.

Análisis 2.FTICR-MS

  1. Calibrar el espectrómetro FTICR inyectando directamente 100 μl de una solución de afinación (véase Tabla de materiales) que abarcan una gama masiva de aproximadamente 100-1.300 Da en FTICR-MS.
  2. Preparar el estándar de ácido fúlvico de Suwannee River (véase Tabla de materiales) haciendo una solución de 1 mg mL-1 de agua ultrapura filtrada y diluyendo luego la solución resultante a 20 μg mL-1 en metanol.
  3. Directo inyecta 23 μl de esta solución final a la fuente ESI juntada al espectrómetro FTICR a través de una bomba para un caudal de 3.0 μL min-1. Ajustar la tensión de la aguja a +4.4 kV, Q1 a 150 m/z y vidrio capilar a 180 ° C. Inspeccione los espectros resultantes utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales) para confirmar la calidad de los datos.
  4. Utilizar metanol de grado HPLC antes de ejecutar las muestras y a lo largo de la toma de muestras para controlar la contaminación por arrastre. Introducir 23 μL de cada extracto a través de inyección directa a la fuente ESI juntada al espectrómetro FTICR a través de una bomba para un caudal de 3.0 μL min-1. Ajustar la tensión de la aguja a +4.4 kV, Q1 a 150 m/z y vidrio capilar a 180 ° C.
  5. Ajustar tiempo de acumulación de iones (UAI) para cada muestra o grupo de muestras para tomar en cuenta la variación en la concentración de C. Valores típicos son entre escaneos de 0.1 a 0.3 s. 144 recoge para cada muestra, promedio los análisis y luego realizar una calibración interna con homólogo CH2 (es decir, 14 Da separación) serie.
    Nota: Después de análisis FTICR-MS, la decisión puede hacer o combinar el agua y metanol extraída fracciones con el fin de agilizar los pasos restantes o las fracciones pueden ser apartadas a lo largo de los pasos posteriores. Las ventajas y desventajas de cada enfoque se describen largamente en la discusión. Si al hacerlo, combinar las fracciones extraídas de metanol y agua.
  6. Utilizando un concentrador de extractos secos y guardar el resto de los extractos (~ 1 mL) para posterior GC-MS (agua, metanol o agua + metanol), LC-MS (cloroformo) y análisis NMR (agua + metanol).
    Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y el material almacenado a-20 ° C.

3. FTICR-MS procesamiento de datos

  1. Co, alinee todas las listas de pico de muestra del conjunto de datos completo reducir cambios de masa y estandarizar tareas de pico con Formularity software22 antes de asignación de la fórmula.
  2. Utilice el software de Formularity22 para asignar fórmula molecular utilizando una señal a ruido mayor que 7, masa medida error < 1 ppm y permitiendo que C, H, O, N, S y P al mismo tiempo excluyendo todos los demás elementos.
  3. Si múltiples fórmulas de candidatos se devuelven para una masa dada (frecuentes por encima de 500 Da) imponen limitaciones compatibles con el material que se muestra. Por ejemplo, en la turba, las limitaciones típicas incluyen: error total menor, menor número de heteroátomos (N, S, P), y cuando se presenta, P debe ser en forma oxidada (es decir, debe haber al menos 4 átomos de O para cada átomo de P en la fórmula).

4. química derivatización para GC-MS.

  1. Preparar muestras de control en blanco de hexano grado HPLC en GC-MS automuestreador viales23. Ésteres metílicos del ácido graso 100 mg se disuelven (famas: C8 - C28) tiempo de retención de la mezcla estándar en 200 μL de hexano.
  2. Para proteger a grupos carbonilo, agregar 20 μL de clorhidrato de methoxyamine 30 mg mL-1 en piridina a cada uno del metanol extractos y agua extractos (o extractos de metanol/agua combinada si se utiliza) de paso 2.6, espacios en blanco y la fama de las muestras de calibración23. Selle los frascos con tapas.
    PRECAUCIÓN: La piridina es altamente tóxico e inflamable. Use el PPE apropiado para evitar la piel o contacto con los ojos y evitar la llama abierta. Además, piridina volatiliza a temperatura ambiente, provocando contaminación del aire nocivos. Trabajar sólo en espacios bien ventilados bajo una campana de humos.
  3. Vórtice de extractos para extractos de someter a ultrasonido s. 20 por 60 s. Luego, incubar extractos en una centrifugadora a 37 ° C por 90 min a 100 x g.
    Nota: Una cantidad excesiva de hidratos de carbono o las sales puede causar metabolitos a cristalizar después de que se estén secando hacia abajo. Sonicando las muestras ayudarán a reconstituir los metabolitos cristalizados en el reactivo derivatizing.
  4. Después de la incubación, añadir 80 μL de N-metil - N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano 1% para cada muestra, vórtice extractos de 20 extractos de someter a ultrasonido s. 60 s e incubar los extractos en una centrifugadora a 37 ° C durante 30 min a 100 x g.
  5. Extractos frescos de RT (20-24 ° C), entonces transfiera en GC-MS automuestreador viales.

5. análisis por GC-MS de

  1. Ajustar y calibrar MS según recomendaciones del proveedor (véase Tabla de materiales) antes del análisis para asegurarse de que la máquina lea MS datos correctamente. Verificar presión de gas de helio dentro de la tolerancia especificada.
  2. Metabolitos polares separados en una columna de GC (30 m × 0,25 mm x 0,25 μm). Configurar el protocolo de temperatura de horno como sigue: (1) inicial temperatura de 60 ° C por 1 min, (2) rampa a 325 ° C a una velocidad de 10 ° C min-1y (3) sostenga a 325 ° C durante 5 minutos.
  3. Analizar extractos utilizando un GC acoplado a un simple cuadrupolo MS. Set temperatura de puerto de inyección para un constante 250 ° C. Inyectar 1 μL de cada extracto derivatizado en modo splitless.

6. procesamiento de datos GC-MS

  1. Inspeccionar todos los archivos de datos para asegurarse de que fueron capturados correctamente. Prestar atención a posibles cambios en cuanto a tiempos de retención estándar interno y confirmar que las intensidades de ayuda que los datos se capturan constantemente a lo largo de los análisis.
  2. Convertir el formato de datos de MS específico de proveedor a un formato general de MS si es necesario. Proceso de datos sin procesar archivos usando MetaboliteDetector24 calibración de índices de retención basados en las normas internas de la fama. Después de alinear los tiempos de retención de todos los archivos de datos, continuar con deconvolución y finalmente la identificación de metabolitos comparando índices de retención y espectros de GC-MS contra el FiehnLib metabolito polar biblioteca25.
  3. Verificación restantes metabolitos no identificados contra la biblioteca de NIST14 GC-MS mediante coincidencia espectral. Validar la identificación individual para eliminar identificaciones falsas y reducir los errores de deconvolución.

7. estado líquido análisis de RMN

  1. Diluir el resto de los extractos de agua (~ 300 μL) en un 10% (vol/vol) con un estándar interno 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 de 5 mM. Alternativamente, combinar agua y extractos de metanol desde el paso 1 entonces resubstitute en agua. Haciendo esto sin embargo, algunos de los compuestos volátiles pueden perderse durante la etapa de la liofilización. Volúmenes de muestra final típicos están en el rango de 180-300 μl.
  2. Transferir la mezcla a un tubo de cristal de borosilicate NMR de alta calidad de 3 mm diámetro externo (O.D.).
  3. Recoger espectros utilizando un espectrómetro de RMN (idealmente al menos 600 MHz) equipado con una sonda fría sal tolerante 5 mm triple resonancia y un preamplificador de carbono frío.
  4. Recoger los espectros de 1H de 1D con un D 1 nuclear Overhauser espectroscopia (NOESY) presaturation experimento efecto a 298 K con un tiempo de adquisición s 4, 1,5 s reciclar retardo, 65.536 puntos complejos y exploraciones de 512.
  5. Recoger 2D 1H -13C heteronuclear quantum sola correlación (HSQC) y 1H -1H espectros de correlación total (TOCSY) para ayudar en la asignación de metabolitos y validación.
  6. Proceso, asignar y analizar todos los espectros usando el software de análisis NMR (véase Tabla de materiales) para cuantificar la intensidad en relación con el estándar interno. Identificar metabolitos combinando información química de desplazamiento, acoplamiento J y la intensidad en las muestras contra la biblioteca.
    Nota: La biblioteca es reforzada por normas de metabolitos específicos personalizados y metabolito adiciones hechas sobre una base regular. El protocolo se puede detener en este punto y el material almacenado a-20 ° C.

8. LC-MS anti-lípidos análisis

  1. Humedecer el extracto cloroformo seco generado durante el paso 2.5 con 200 μL de metanol.
  2. Inyecte 10 μL de cada extracto en un cromatógrafo líquido de ultra performance acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap usando una fase reversa cargado columna superficie híbrida (tamaño de partícula μm de 3,0 mm × 150 mm × 1.7). Establece un gradiente de 34 min (fase móvil A: acetonitrilo/H2O (40: 60) que contiene acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo/isopropanol (10:90) que contiene acetato de amonio 10 mM) con un caudal de 250 μl/min uso negativo y positivo modos de ionización y disociación colisión de energía más alta disociación inducida por colisión.
    PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es un irritante respiratorio, ojos y piel. Usar el EPP adecuado. Además, el acetonitrilo es combustible. No permiten entrar en contacto con agentes oxidantes, pueden producir gases tóxicos durante la quema.
  3. Subir los archivos de datos raws de LC-MS/MS en líquido junto con el archivo de destino (es decir, lista de especies de lípidos > 25.000) para el modo de ionización respectivos (positivo o negativo). Procesar el archivo raw. Validar manualmente las identificaciones resultantes mediante el examen de los espectros MS/MS para la presencia de iones diagnóstico, si iones fragmento correspondiente, aplicable (por ejemplo, cadenas de acilo graso), separación de isótopo, masa error ppm de los precursores y el tiempo de retención. Exportar lista resultante de lípidos con confianza identificados como .tsv.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y almacenar el material a-20 ° C.

9. Análisis de proteómica

  1. Extracto de proteínas según el protocolo de MPLEx20 el resto de la fase metanol resultante del paso 2.4, lavando el extracto con 20 veces el volumen de extracto de metanol más frío (-20 ° C).
  2. Use a 1 mL/50 mg basados en sílice absorbente (ver Tabla de materiales) para columnas de SPE C18 de condición con 3 mL de metanol, 2 mL de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua, seguida por la adición del extracto de paso 9.1 a una velocidad no mayor de 1 mL/min.
  3. La adición de la muestra, lavar la columna con 4 mL de agua: acetonitrile:TFA de 95:4.9:0.1 y, a continuación, deje que se seque. Coloque un tubo de 1,5 mL recogida bajo la columna SPE y eluir la muestra con 1 mL de metanol: agua: TFA de 80:19.9:0.1.
  4. Concentrado de los extractos a 100 μl bajo vacío congelan secador, entonces medir la concentración de proteína por bicinchoninic ácido (BCA) ensayo colorimétrico26 en una longitud de onda de 562 nm.
  5. Extractos de centrifugar a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante resultante y secar el sedimento restante en vacío por 5 minutos Resuspender el precipitado de proteína en agua a una concentración final de 0.1 μg péptido por μl.
  6. Añadir Ditiotreitol a una concentración final de 5 mM e incubar a 60 ° C durante 30 minutos diluir 10 veces con solución de urea de 8 M 100 mM NH4HCO3e incubar a 37 ° C por 3 h en presencia de 1 mM de CaCl2 y tripsina porcina en un 1:50 enzima proteína relación.
    Nota: Protocolo puede hacer una pausa en este punto y almacenar material a-20 ° C.
  7. Extractos separados por cromatografía líquida utilizando un gradiente exponencial de un 0.1% de ácido fórmico en fase móvil de agua (A) y un 0.1% de ácido fórmico en fase móvil acetonitrilo (B) en 10 kpsi y 500 nL min-1.
  8. Introducir el eluyente resultante en un espectrómetro de masas ESI-juntado recogida de espectros de 400-2.000 m/z con resolución de 100.000 m/z 400 en un espectrómetro de masas de trampa iónica lineal (LTQ) Orbitrap.
  9. Convertir archivos RAW espectros al formato mzML usando msConvert o ProteoWizard aceptando todos los parámetros por defecto. Utilice la herramienta de búsqueda de base de datos universal MSGFPlus para buscar proteomas resultante contra una base de datos de la proteína específica de secuencias de proteína predicha de genomas correspondientes metagenoma montado.
  10. Agregar contaminantes comunes (por ejemplo, tripsina, queratina, albúmina) y eliminar todas las secuencias de proteínas exactamente duplicado para mejorar estadísticas partido péptido a espectro de masa. Evaluar las calificaciones de probabilidad espectral MSGF resultantes para determinar qué partido péptido a espectro de masa es mejor. Utilice el valor de Q de MSGFPlus para filtrar la pila de datos todo a tasa de 1% falso descubrimiento (FDR).

10. metabolómica análisis y construcción de redes metabólicas

  1. Compilar todo fórmula molecular de metabolitos identificados en los pasos 3, 6, 7 y 8 en una única base de datos de metabolitos presentes en las muestras. Estos metabolitos se combinan con los números de Comisión de enzima (EC) o KEGG ortología (KO) de las enzimas identificadas en el paso 9. Buscar en este conjunto combinado de datos KEGG27 base de datos, sección de vías metabólicas.
  2. Evaluar manualmente los resultados para identificar las vías más probables e integrar en un modelo metabólico.

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Representative Results

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Se realizó el protocolo de análisis complementario descrito y en comparación con turba con profundidad en el pantano de S1 en el sitio de abeto y las turberas respuesta bajo cambio de ambientes (SPRUCE) en Minnesota, Estados Unidos. Estos resultados se comparan con las de un pantano de permafrost y fen del norte de Suecia para mostrar qué sitios pueden variar en metabolitos y las actividades enzimáticas. Se identificaron las 3.312 enzimas en el análisis de proteómica. Un análisis de las actividades de las enzimas con profundidad revela que el número de enzimas disminuye agudamente entre 15 y 45 cm en el pantano SPRUCE (figura 1).

Mientras que la proteómica los resultados indican que las proteínas se expresan, los datos metabólicos muestran las reacciones que están ocurriendo realmente. En general, se identificaron 67.040 metabolitos (incluyendo lípidos) en todas las muestras de turba de la combinación de FTICR-MS, RMN, GC-MS y LC / MS análisis. De estos, hemos sido capaces de asignar fórmula molecular a 15.385 compuestos (figura 2). Los datos combinados de metabólicos abarca una gama de Estados de oxidación, masas y clases de compuestos.

Esto normalmente se visualiza mediante el uso de un diagrama de van Krevelen en que las proporciones de H/C atómicas de fórmula identificada se trazan contra sus atómica O/C ratios28. Hemos incluido una nueva dimensión al típico formato de 2D, que NOSC mediante los símbolos que representan cada fórmula (figura 3 y figura 4) de la codificación policromática. Con el aumento de profundidad en el pantano SPRUCE, hay un aumento en el número total de metabolitos secundarios grandes identificadas por FTICR-MS, especialmente en altamente condensada (abajo a la izquierda del diagrama de van Krevelen) e hidrogenados fórmulas (parte superior de la parcela) (figura 4 ). Sobre el fondo mismo hay una disminución en el número de pequeños compuestos altamente energéticos identificados por GC-MS y en los lípidos (figura 5). Esto podría sugerir que los lípidos y metabolitos pequeños se consumen en la turba superficial antes de llegar a las profundidades más profundas o que las tasas de descomposición en la turba profunda son más rápidas que en la superficie tal que rápidamente se consumen compuestos advectados hacia abajo. Diferenciar entre estas dos hipótesis de competencia requiere una comprensión de nivel de proceso del C ciclismo en el sitio. Tal comprensión de nivel de proceso sólo puede obtenerse por acoplamiento de los datasets de metabolómica y proteómica. Logramos esto mediante la validación de cruz el combinado FTICR-MS, GC-MS, LC-MS y NMR identificado metabolitos contra la base de datos KEGG. De esta manera, encontramos que los compuestos que se identificaron son caminos en común metabólicos implicados como ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), la glicólisis y el metabolismo del azúcar. Puesto que los metabolitos pueden estar implicados en confirmación de itinerarios múltiples con las enzimas aumenta nuestra confianza en la asignación de rutas (figura 6).

A través de esta asignación se encuentra evidencia del metabolismo de la sacarosa y el almidón en la turba superficial, mientras que en las profundidades más profundas piruvato y otros productos de la fermentación se acumulan (figura 6). Estos resultados son consistentes con la hipótesis primera que azúcares y otros metabolitos energéticos son degradados en la turba superficial y no alcanzan las profundidades más profundas de la turba. Como puede verse en la figura 5, azúcares (NOSC = 0) y aminoácidos (0 < NOSC < 1) se consumen en la turba superficial, mientras que los lípidos (-2 < NOSC < -1) parece que se acumulan con la profundidad. Esto es consistente con expectativas basadas en valores NOSC que mayor NOSC compuestos son degradados más fácilmente mientras que inferior NOSC compuestos persisten en la altamente anaeróbico (es decir, té-limited) condiciones de la turba del subsuelo. Este enfoque también distingue entre tipos de suelos de diferentes ambientes. Por ejemplo, la materia orgánica de las turberas boreales parece ser compositivamente distintos de permafrost turberas, así como en pantano y pantano dentro de la región de permafrost. Estos resultados son consistentes con un estudio previo que demostró diferencias en geoquímica de sitio entre estos hábitats29, sugiriendo eso geoquímica del sitio tienen un gran efecto en la degradación microbiana de C por debajo del suelo.

Figure 1
Figura 1 : Análisis de proteómica indica estratificación fuerte profundidad en el número de enzimas. Las barras indican promedios y barras de error indican una desviación estándar de abundancia. Esto sugiere que los microorganismos son más activos en la superficie de la turba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : El número de compuestos identificados por cada técnica en la turba superficial (< 30 cm) de cada hábitat, así como la media (45 cm) y profunda (87 cm) turba de pantano SPRUCE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Diagrama de van Krevelen el (atómico H/C vs O/C de cada uno identificados fórmula molecular) para la superficie (15 cm) SPRUCE bog profundidad para demostrar la cobertura de compuestos caracterizados por cada técnica. FTICR MS nos permite identificar el mayor número de compuestos (pequeños círculos), mientras que el GC-MS (triángulos) es bueno para la diferenciación y la identificación de azúcares (H/C = 2 y O/C = 1). Espectroscopía de RMN (cuadrados) proporciona información cuantitativa sobre energéticamente importantes compuestos como azúcares, aminoácidos, piruvato, etcetera. LC-MS (diamantes) proporciona información sobre los lípidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Diagrama de van Krevelen el (atómico H/C vs O/C de cada uno identificados fórmula molecular) profunda (87 cm) SPRUCE bog profundidad para demostrar la cobertura de compuestos caracterizados por cada técnica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : La fracción relativa de diferentes clases de químicos identificados a través de las diferentes técnicas en las diferentes profundidades. Barras se trazan como promedios para cada profundidad ± una desviación estándar. Clases de trazado incluyen aminoácidos, esfingolípidos (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacilglicerol (DG), triglicéridos (TG) y azúcares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Combinación de resultados para crear una red metabólica. Distribuciones de metabolitos identificados por RMN (una) y GC-MS (b) y un mapa metabólico simplificado (c) con un número selecto de transformaciones identificadas en SPRUCE bog en profundidad. Cajas verdes indican metabolitos que disminuyen con cajas de profundidad, marrón indican metabolitos que aumentan con la profundidad. Flechas de conexión verdes indican enzima identificada en nuestro conjunto de datos que median la transformación indicada (número de enzima EC indicado al lado de las flechas). Flechas de conexión gris indican transformaciones para que las enzimas no se identificaron en nuestro conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El solo rendimiento, corriente de análisis completamente acoplado usado para caracterizar los metabolitos y el proteoma proporciona penetraciones en los caminos por que C ciclismo ocurre en un ecosistema complejo. Suelo y la turba son matrices heterogéneas, y por lo tanto, uno de los pasos críticos de este método se produce en los primeros pasos para asegurar que la partida de la turba o material del suelo es muy homogéneo. Es preferible triturar como agregados pueden reducir la eficiencia de la extracción. Se trata de un problema particular de agregados suelos y los suelos con bajo C y alto contenido mineral que puede requerir el uso de un molino de bolas de acero inoxidable para homogeneizar adecuadamente. Debido a la heterogeneidad espacial de los suelos y turba dentro de un sitio experimental puede ser alta, réplicas biológicas son muy recomendables.

Este método utiliza tres disolventes: agua, metanol y cloroformo, que los tipos de compuestos es posible extraer la polarización. En principio, este método de extracción secuencial debe solubilizar compuestos que cubren una gama amplia de polaridad. Sin embargo, estos solventes no están optimizados para la extracción de complejos organo-minerales o complejos altamente estabilizados. Si estos compuestos son de interés, se prefieren los más solventes como ácidos fuertes y bases, pero más por procesos de extracción pueden alterar la química de las muestras. La incorporación de estos solventes en el final de la secuencia de extracción puede minimizar este efecto. Además, cloroformo Inactive clínicamente importante del suelo, patógenos virales y bacteriana de turba y otros agentes biológicos patógenos que causan enfermedades mediante la disolución de los lípidos de la membrana de la célula. Así, la incorporación de cloroformo en el protocolo de extracción reducirá los riesgos en estudios de Biología de muestras potencialmente infectados por patógenos procedentes de diferentes regiones del mundo. Si hay preocupaciones acerca de las células microbianas muertos, residuos o partículas después de la extracción, se recomienda filtrar los extractos a través de un filtro de fibra de vidrio μm 0.2.

Para agilizar el proceso, el agua y el metanol extractos podrían combinarse para análisis por GC-MS en el paso 4.1. Sin embargo, estos extractos deben permanecer separados para análisis de MS FTICR debido a problemas de eficiencia de ionización con la fuente ESI. La ventaja de correr el extracto combinado en la GC-MS es que se identificará más metabolitos (que abarca una gama más grande de la polaridad). La desventaja de combinar los extractos en este punto es que uno de los principales metabolitos importantes en la transformación microbiana de la materia orgánica es el metanol. Rastros de metanol permanecerá siempre en la muestra combinada, incluso después del secado, si el metanol es un metabolito de interés, el extracto de agua se debe ejecutar por separado. Tener buenos controles con no analitos también ayudará en la identificación de potencial de contaminación en las muestras.

En el paso 7.1 de preparar extractos para el análisis de NMR, como en el análisis por GC-MS, ya sea el extracto de agua sola o agua combinada y extractos de metanol pueden ser utilizados. Las desventajas de hacer esto son similares a los enumerados en el párrafo anterior. La ventaja de combinar los extractos de metanol y agua es que algunos de los metabolitos menos polares que son solubilizados en la fracción de metanol se identificarán. Sin embargo, debido a la etapa de la liofilización, muchos compuestos más volátiles se pierden. Esto es una desventaja particular si cuantificación de ácidos grasos volátiles es un componente crítico del experimento.

En este procedimiento para la identificación de proteómica, péptidos trípticos completamente única actividad peptidasa buscado, por lo tanto endógeno y echaremos de fragmentaciones en la fuente. Por otro lado, metionina oxidado puede considerarse como una modificación poste-de translación de los candidatos de péptido que esta modificación ocurre comúnmente durante el tratamiento y manipulación de muestreo. Cuantificación de enzimas utilizando áreas de elución de péptido se puede hacer, pero está fuera del alcance de este proyecto.

Muchos avances recientes en el análisis de la NOM y los parámetros microbianos ofrecen una amplia variedad de técnicas para la comprensión de C orgánico ciclismo. Mediante la combinación de estas técnicas en un solo protocolo optimizado, obtenemos una visión inédita de los procesos que están teniendo lugar. El análisis de Proteómica con el análisis metabólicos de acoplamiento ofrece convincentes pruebas contundentes que realmente está ocurriendo una reacción. Análisis metabólico solo se limita en que nos informa que metabolitos son mayor o menor concentración en las comparaciones entre sitios o después de un efecto del tratamiento, pero no pueden discernir las causas de esos cambios. Por ejemplo, se identificaron concentraciones de azúcar decreciente con la profundidad en el pantano, pero sin más información no está claro si la disminución con la profundidad es debido a entradas de lentas o rápida degradación en la turba profunda. Análisis del proteoma y la baja expresión de enzima con profundidad nos permiten rechazar la hipótesis segunda. Más bien nuestros resultados son consistentes con la degradación del azúcar rápido en las entradas de turba superficial limitante a las profundidades más profundas. Estas ideas particulares son sólo posible cuando todas las técnicas se consideran en conjunto como cada uno ofrece una experiencia única, pero pieza fundamental de la C ciclismo rompecabezas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Chanton J.P., J.E. Kostka y M.M. Kolton por asistencia para recoger muestras de turba. Porciones de este trabajo se realizaron en el laboratorio ambiental de Ciencias moleculares, una DOE de ciencia usuario oficina patrocinada por la oficina de biológico y ambiental. PNNL es operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC05-76RL01830. Este trabajo fue financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia e investigación oficina de biológico y ambiental (otorga: DE-AC05-00OR22725, DE SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 y DE SC0014416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

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References

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Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).More

Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

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