Summary
Det här protokollet beskriver en enda genomströmning för kompletterande analytiska och omics tekniker som kulminerade i en fullt inkopplade karakterisering av naturligt organiskt material och mikrobiell proteomik i olika ekosystem. Denna metod tillåter robust jämförelser för att identifiera metaboliska vägar och transformationer som är viktiga för att beskriva växthus gasproduktion och förutsäga Svaren till miljöförändringar.
Abstract
Naturliga organiska ämnen (NOM) består av en mycket komplex blandning av organiska föreningar som historiskt har visat sig svårt att karakterisera tusentals. Men för att förstå de termodynamiska och kinetiska kontrollerna på greenhouse gas (koldioxid [CO2] och metan [CH4]) produktion som härrör från nedbrytning av NOM, tillsammans en molekylär nivå karakterisering med mikrobiell proteomet analyser är nödvändiga. Klimat- och miljöförändringar förväntas dessutom stör naturliga ekosystem, potentiellt upprörande komplexa interaktioner som påverkar både leverans av organiskt substrat och mikroorganismer utför omformningarna. En detaljerad molekylär karakterisering av organiskt material, mikrobiell proteomik, och spridningsvägar och transformationer som organiskt material bryts ner blir nödvändigt att förutsäga riktningen och omfattningen av effekterna av miljöförändringar. Denna artikel beskriver en metodologisk genomströmning för omfattande metabolit karakterisering i ett enda prov av direktinsprutning Fourier transform ion cyclotron resonance masspektrometri (FTICR-MS), gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, vätskekromatografi masspektrometri (LC-MS) och proteomik analys. Detta synsätt resulterar i en helt inkopplade datamängd som förbättrar statistiska förtroende för inferring vägar av organiskt material nedbrytning, den resulterande CO2 och CH4 produktion priser och deras svar på miljömässiga störning. Här presenterar vi resultatet av tillämpningen av denna metod att NOM prover som tagits från torvmarker; protokollet är dock tillämpliga på varje NOM prov (t.ex. torv, skogsklädda jordar, Marina sediment, etc.).
Introduction
Globalt, beräknas våtmarker innehålla 529 Pg av kol (C), mestadels som ekologisk C begravd i torv insättningar1. För närvarande fungerar sådana torvmarker som C nettosänka, komplexbildare 29 Tg C y-1 i Nordamerika ensam1. Dock miljöstörningar såsom dränering, bränder, torka och varmare temperaturer kan kompensera denna C sjunka genom att öka organiskt nedbrytning vilket resulterar i ökad C förluster via växthusgaser (koldioxid [CO2] och metan [CH4]) produktion1,2. Klimatförändringar kan bidra till C förlust om varmare temperaturer eller torktumlare villkor stimulerar snabbare C nedbrytning av mikroorganismer. Alternativt, högre temperaturer och luften CO2 koncentrationer kan stimulera primära produktionen för att binda mer CO2 som organiskt kol (OC). I vilken utsträckning och hur snabbt det OC bryts sedan in CO2 och CH4 beror på de komplexa interaktioner mellan de elektron donator substratesna, tillgången på Elektronacceptorer och de mikroorganismer som medla den omvandling. I många fall mekanismerna är inte välkarakteriserad, således deras svar på miljömässiga störningar är inte väl begränsade och det är fortfarande oklart hur resultatet av klimatförändringarna kommer att påverka kolbalans i torvmark ekosystem.
Den komplicerade karaktären av naturligt organiskt material (NOM) har gjort att även identifiera de organiska föreningarna som finns i NOM blandningarna historiskt svårt. Senaste framsteg har kraftigt förbättrat vår förmåga att karakterisera föreningar som traditionellt och, i viss utsträckning fortsätta att betraktas som motsträviga humus eller fulvic föreningar3,4,5. Nu förstår vi att många av dessa föreningar är faktiskt mikrobiellt tillgänglig och kan brytas om en lämplig terminal Elektronacceptor (TEA) görs tillgänglig6,7. Beräkna det nominella oxidationstillståndet av kol (NOSC) förening ger ett mätvärde för att förutsäga risken för nedbrytning och av te krävs energiutbyte. Det kräver dock en molekylnivå karakterisering av organiskt material7. NOSC beräknas från molekylformel via följande ekvation7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, där z är nettoladdningen. NOSC är korrelerad med den termodynamiska drivande kraft8, vari föreningar med högre NOSC är lättare att bryta ned, medan föreningar med lägre NOSC kräver allt mer energisk teer för att minskas. Föreningar med NOSC mindre än −2 kräver en hög energi ger teer såsom O2, nitrat eller MnIV, och kan inte brytas ned av vanligt förekommande lägre energi ger teer såsom FeIII eller sulfat7. Detta är en viktig faktor i vattendränkt syrefria förhållanden i våtmarker där O2 och andra hög energi ger teer är knappa9 och nedbrytningen av lägre NOSC föreningar under dessa förhållanden är därför thermodynamically begränsad. Miljömässiga störning kan påverka ekosystemet genom hydrologiska förändringar som påverkar O2 (den mest energiska Elektronacceptor), förändringar i organiskt substrat och Elektronacceptorer tillgängliga termodynamiska tillstånd av primär produktion, och i mindre utsträckning av temperatur. Ett viktigt exempel temperatur effekter i våtmark system uppstår när det gäller avvägningen som uppstår mellan homoacetogenesis (dvs, acetat produktion från CO2 och H2) och hydrogenotrophic () methanogenesis dvs, CH4 produktion från CO2 och H2). Vid låga temperaturer verkar det homoacetogenesis något gynnas, medan varmare temperaturer gynnar CH4 produktion10. Denna temperatur effekt kan få viktiga konsekvenser för svar av ekosystem till förändrade klimat, som CH4 är en mycket starkare växthusgas än CO211 och därmed ökande produktion av CH4 på bekostnad av CO2 vid varmare temperaturer kan bidra till en positiv feedback med klimatuppvärmningen.
Torvmarker producera globalt betydande mängder CO2 och CH46via mikrobiell respiration av naturligt förekommande organiska materia. NOSC av de organiskt kol substratesna bestämmer den relativa andelen CO2: CH4 produceras som är en kritisk parameter på grund av den högre strålnings tvinga CH4 jämfört med CO211, men också eftersom modellering ansträngningar har identifierat detta förhållande som en kritisk parameter för att uppskatta C flux i torvmarker12. I avsaknad av terminal Elektronacceptorer än CO2, det kan visas av elektron balans att organiska C substrat med NOSC > 0 kommer producera CO2: CH4 > 1, ekologisk C med NOSC = 0 producerar CO2 och CH4 i equimolar ratio och organiska C med NOSC < 1 kommer att producera CO2: CH4 < 113. Nedbrytning av OC i naturliga ekosystem medieras av mikroorganismer, så att även när nedbrytning av en särskild förening är thermodynamically genomförbart, det är kinetiskt begränsas av aktiviteten av mikrobiella enzymer och under syrefria förhållanden, genom den termodynamiska drivkraft (dvsNOSC)7. Tills nu har det varit en utmaning att fullt karakterisera organiskt material eftersom mångfalden av föreningar som finns kräver olika kompletterande tekniker för deras karakterisering. Senaste framstegen har minskat gapet; med hjälp av en uppsättning analytiska tekniker kan vi analysera ett stort utbud av organiska föreningar som tillhandahåller molekylnivå karakterisering och, i vissa fall kvantifiering, från små primära metaboliter som glukos upp till 800 Da poly-föreningar. Tidigare skulle sådana stora komplexa molekyler ha präglats helt enkelt som lignin-liknande eller tannin-liknande och antas ha varit motsträviga. Molekylär nivå karakterisering, tillåter dock beräkningen av NOSC för även dessa stora komplexa molekyler. Dessa NOSC värden är linjärt korrelerade med de termodynamiska drivkraft som möjliggör en bedömning av kvaliteten på organiskt material tillgängligt för nedbrytning, som i många fall avslöjar att dessa komplexa molekyler kan faktiskt vara mikrobiellt nedbrytbara även under syrefria förhållanden som råder i våtmarker.
Eftersom införandet av O2 tillåter organiskt material av nästan alla naturligt observerade NOSC värden att brytas, fokuserar häri vi på förändringar i organiskt material och mikrobiell proteomik som sannolikt är de främsta drivkrafterna i våtmark (dvs. begränsade O2) system. Alla de tekniker som vi kommer att diskutera kan dock tillämpas på organiskt material från alla ekosystem. Vanligen, bulk mätningar baserat på optisk och fluorescens analyser har använts för att bedöma organiskt material kvalitet3,14. När du använder bulk mätningar som dessa, men går fina detaljer förlorade som ett stort antal molekyler kategoriseras tillsammans under generiska termer som humics eller fulvics. Definitionerna av dessa kategorier är inte väl begränsade och, i själva verket kan variera från studie till studie gör jämförelser omöjligt. Ytterligare, bulk mätningar inte ger de molekylära uppgifter som är nödvändiga för beräkning av termodynamiken styr systemet och därför inte når att verkligen bedöma organiskt material kvalitet15.
Enskilda tekniker såsom Fourier transform ion cyclotron resonance masspektrometri (FTICR-MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, gaskromatografi massa masspektrometri (GC-MS) och vätskekromatografi masspektrometri (LC-MS) gör tillhandahålla sådan molekylär nivå detalj. Medan var och en av dessa tekniker presenterar sina egna begränsningar, föra de också sina egna styrkor som kan utnyttjas i en integrerad strategi att uppnå på molekylär detaljnivå som krävs för att kvantifiera organiskt material kvalitet i en rigorös termodynamisk mening . GC-MS är användbara för att identifiera kritiska små metaboliter som sannolikt kommer att påverka proximala CO2 och CH4 produktion (t.ex., glukos, acetat, etc.); dock GC-MS kräver verifiering mot en standard och är därför begränsad till redan kända föreningar som finns i databasen att förhindra identifiering av nya föreningar. GC-MS är dessutom en semi kvalitativa teknik tillåter inferens om förändringar i relativa koncentrationer, men som inte tillhandahåller den faktiska koncentration informationen som behövs för att beräkna Gibbs fria energi till exempel. Slutligen, GC-MS kräver derivatisering av molekyler före analys som begränsar upplösning för föreningar som är mindre än ~ 400 Da och flyktiga alkoholer förloras under torkning steg.
Endimensionell (1D) 1H flytande tillstånd NMR tillåter mycket kvantitativa karakterisering av små metaboliter (inklusive primära små molekylvikt metaboliter och flyktiga ämnen som alkoholer, acetat, aceton, formate, pyruvat, succinat, kortkedjade fettsyror, liksom en rad kolhydrater notoriskt frånvarande eller komprometterad från MS-baserade metoder) och deras koncentrationer är särskilt användbara för beräkning av termodynamiska parametrar. Men som GC-MS, 1D NMR av komplexa blandningar kräver standardisering i förhållande till en databas och därför ensam tillåter inte enkel identifiering av nya föreningar som kan förväntas vara rikligt i komplexa naturliga och föränderliga ekosystem. Dessutom NMR är mindre känsligt än de MS-baserade teknikerna och därför kvantitativa metabolit profilering uppnås endast över 1 µM med hjälp av NMR system utrustade med helium-cooled kalla-sonder. Inte uppskattad, vissa NMR kalla-prober är salt-toleranta och möjliggöra miljömässiga blandning analys i närvaro av millimolar salt koncentrationerna när den används i mindre diameter (< 3 mm ytterdiameter) prov rör16. Ytterligare en komplikation av NMR är dock att stora mängder paramagnetiska metaller och mineraler (t.ex., Fe och Mn över 1-3 wt %), som kan vara rikligt i höglänta jordar, kan bredda spektrala funktioner och komplicerar tolkningen av NMR spectrana . Med fasta fasen extraktion (SPE) kan medhjälpare i tolkningen av både NMR- och MS-baserad metabolomik metoder genom att minska mineralsalter och ökande spektrala kvalitet.
FTICR-MS genom direkt injektion är en mycket känslig teknik som kan detektera tiotusentals av metaboliter från ett enda prov, men det har inte fånga de kritiska små metaboliterna som acetat, pyruvat och succinat och är notoriskt svårt att för socker och andra kolhydrater17, inte heller ger kvantitativ information. Men till skillnad från andra tekniker, FTICR-MS utmärker på att identifiera och tilldela nya föreningar molekylformel och därför identifierar det största antalet föreningar som ger mer molekylär information än någon av de andra beskrivna teknikerna. Detta är användbart eftersom molekylär uppgifter från FTICR-MS (och andra tekniker) kan användas för att beräkna NOSC som är relaterad till den termodynamiska drivkraften som styr sannolikheten för vissa reaktioner8 och deras priser under vissa villkor7. Dessutom av koppling FTICR-MS med separation tekniker, såsom LC tillsammans med tandem MS, kan kvantitativa strukturella uppgifter uppnås, kvittning några av nackdelarna med denna teknik. LC-MS är användbart för att identifiera lipid-liknande föreningar och andra metaboliter som inte är väl kännetecknas av någon av de andra metoderna. Koppling LC FTICR-MS eller LC-MS med en bråkdel samlare och samla fraktioner av specifika okända sevärdheter för strukturella klarläggande av tvådimensionella (2D) flytande tillstånd NMR är den idealiska situationen för att identifiera och kvantifiera okänd föreningar18 ,19. Detta är dock ett mycket tidskrävande steg som kan användas om och när det behövs. Tagit individuellt, var och en av dessa tekniker ger en olika ögonblicksbild av organiskt material och genom att integrera dem, vi kan uppnå en mer fullständig förståelse än att använda någon av teknikerna i isolering.
Medan de termodynamiska övervägandena anges de ultimata begränsningarna på vilka förändringar är möjliga i ett system, medieras organiskt nedbrytning av mikroorganismer vars Enzymaktiviteter styra reaktion priser. Således helt förstå kontrollerna på nedbrytning av organiskt material och slutligen växthus gas (CO2 och CH4) produktion från våtmarker kräver ett integrerat omics förhållningssätt till karaktärisera de mikrobiella Enzymaktiviteter samt metaboliterna. I den här artikeln beskriver vi en metod för att uppnå en sådan omfattande analys från ett prov med en sekventiell metod som resulterar i en helt ihopkopplade analys. Detta synsätt expanderar på metabolit, protein och lipid utvinning (MPLex) protokoll där proteomik var förenat med GC-MS och LC-MS20 för att identifiera små metaboliter, proteiner och lipider genom att införliva kvantitativa metaboliten via NMR och identifiering av större sekundära metaboliter via FTICR-MS. något olika till MPLex, vi börjar i protokollet med en vatten extraktion och sedan använda sekventiell extraktion med allt icke-polära lösningsmedel. Alla extraktioner görs på ett enda prov som sparar prov när volymerna är begränsad eller svårt att få och minskar experimentella fel infördes genom variation bland alikvoter från heterogena provmatriser (t.ex., jord och torv) eller skillnader i villkor för förvaring och varaktighet.
Slutligen, genom koppling OM analyserna med proteomik analys av mikrobiell gemenskapen, kan vi bygga metaboliska nätverk som beskriver vägar och omvandling av organiskt material nedbrytning. Detta tillåter oss att testa specifika hypoteser om hur störningar i systemet kommer att påverka ultimate CO2 och CH4 produktion genom ändring av de tillgängliga organiska substratesna, Elektronacceptorer och de mikrobiella samhällena medla den reaktioner via aktiviteten av enzymet katalysatorer.
Det övergripande målet med denna metod är att ge ett enda genomströmning protokoll för att analysera metaboliter, lipider och mikrobiell proteiner från ett enda prov som därmed skapar en helt ihopkopplade datamängd för att bygga metaboliska nätverk medan begränsande analytiska fel .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sekventiell utvinning av organiskt material från jord, sediment eller torv
- Samla in jord, sediment eller torv via coring och dela upp kärnor enligt hypotesen testas (t.ex., djup). Store prover i polytetrafluoreten belagda behållare och frysa vid-80 ° C för lagring före analys.
Obs: Cirka 25 mg C behövs för detta protokoll. För torv (vanligen 45% C) krävs 50 mg torkade torven. Större mängder prov kan behövas för låg organiska prover som mineraliska eller skogsklädda höglandet jordar beroende på C innehåll (upp till 5 g). Eftersom extraktion med organiska lösningsmedel kommer att dra någon polyetylenglykol (PEG) i extrakten, som negativt påverkar jonisering under steg 2,4, är det viktigt att undvika att prover kontakta plast när som helst under insamling, lagring eller utvinning. - När du vill analysera proverna, frysa torr till konstant vikt och sedan slipa proverna i en höghastighetståg bollen kvarn som använder rostfria slipning bollar att homogenisera och bryta upp alla aggregat.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt och materialet lagras vid-80 ° C. - Använda en etanol-tvättade rostfritt stål köksredskap, alikvotens 50 mg av varje av de torkade proverna till enskilda 2 mL injektionsflaskor av glas. Dessa prover kommer att sekventiellt extraheras med hjälp av en serie av lösningsmedel i följd extrahera allt icke-polära metaboliter från varje prov. Tillsätt 1 mL destillerat, avgasade vatten (H2O) till varje prov, cap injektionsflaskorna och skaka för 2 h på ett skakbord.
- Efter skakar Tillåt lösningar att stå i rumstemperatur (RT) för 20 min, sedan Centrifugera vid 15000 x g i 30 min, Dekantera och spara supernatanten från varje.
Obs: Dessa lösningar kommer att injiceras i FTICR-MS genom direkt injektion. - Beteende en Folch utvinning21 (även känd som MPLEx20) på nu vatten extraherade rester genom att upprepa steg 1.3 och 1.4 som ersätter en-20 ° C 1 mL 4:3 kloroform: metanol blandning för vattnet i steg 1.3.
Varning: Kloroform och metanol är både mycket brandfarligt och giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) att undvika hudkontakt och Undvik öppen låga. - Försiktigt separera de två resulterar lösningsmedel lager, som kommer att vara visuellt urskiljbara, för separat analys av FTICR-MS med hjälp av en separation tratt eller helt enkelt ta bort det översta lagret av försiktig pipettering.
Obs: Den kloroform-innehållande fraktionen kommer att längst medan andelen som innehåller metanol är mindre tät och kommer att vara på topp. - Späd kloroform extraktet (steg 1,6) 1:1 i metanol och vatten extraktet (steg 1.4) 2:1 i metanol att effektivisera elektrospray jonisering (ESI) för FTICR-MS genom direkt injektion.
Obs: Den metanol som innehåller fraktionen från steg 1,7 behöver inte spädas ytterligare i metanol. Lagrets metanol kommer att köras genom direkt injektion på FTICR-MS.
2.FTICR-MS analys
- Kalibrera FTICR spektrometern genom direkt injicering 100 µL av en trimma lösning (se Tabell för material) som spänner över en massa utbud av ungefärligt 100-1.300 Da till FTICR-MS.
- Förbereda den Suwannee River fulvosyra standarden (se Tabell för material) genom att göra en 1 mg mL-1 lösning i ultrarena filtrerat vatten och sedan späda den resulterande lösningen till 20 µg mL-1 i metanol.
- Direkt injicera 23 µL av slutliga lösningen till ESI källan kopplad till FTICR spektrometern genom en sprutpump inställd på en flödeshastighet 3.0 μL min-1. Inställt +4.4 nål spänning kV, Q1 till 150 m/z och glas kapillär på 180 ° C. Inspektera resulterande spectra med programvaran analys (se Tabell för material) för att bekräfta kvaliteten på data.
- Använd HPLC metanol innan du kör prover och under hela provtagningen för att övervaka överföring. Införa 23 μL av varje utdrag via direktinsprutning till ESI källa kopplad till FTICR spektrometern genom en sprutpump inställd på en flödeshastighet 3.0 μL min-1. Inställt +4.4 nål spänning kV, Q1 till 150 m/z och glas kapillär på 180 ° C.
- Justera ion ackumulering tid (IAT) för varje prov eller grupp av prover att ta hänsyn till variationen i C koncentration. Typiska värden är mellan 0,1 till 0,3 s. samla 144 skanningar för varje prov, genomsnittliga skanningar och sedan genomföra en intern kalibrering med hjälp av homolog CH2 (dvs. 14 Da separation) serien.
Obs: Efter FTICR-MS analys, beslut kan göras antingen kombinera vatten och metanol utdraget bråk för att effektivisera de återstående stegen eller fraktioner kan hållas åtskilda under efterföljande steg. Fördelar och nackdelar av varje tillvägagångssätt beskrivs utförligt i diskussionen. Om därigenom kombinera vatten och metanol-extraherade fraktioner. - Torrt extrakt med en koncentrator och spara resten av extrakt (~ 1 mL) för efterföljande GC-MS (vatten, metanol eller vatten + metanol), LC-MS (kloroform) och NMR (vatten + metanol) analys.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt och materialet lagras vid-20 ° C.
3. FTICR-MS databehandling
- Co justera alla prov topp listor för hela datamängden att minska massa förskjutningar och standardisera peak uppdrag använder Formularity programvara22 inför formel tilldelning.
- Använd den Formularity programvara22 för att tilldela molekylformel använder en signal-brus-förhållande som är större än 7, massa mätning felet < 1 ppm, och låta C, H, O, N, S och P medan exklusive alla andra element.
- Om flera kandidat formler returneras för en given massa (frekventera över 500 Da) medför begränsningar överensstämmer med det material som ingick i urvalet. Till exempel i torv, typiska begränsningar inkluderar: lägsta massa fel, lägsta antal heteroatomer (N, S, P), och i förekommande fall, P måste vara i oxiderad form (dvs.det måste finnas minst 4 O atomer för varje P-atom i formeln).
4. kemisk derivatisering för GC-MS
- Förbereda tomt kontrollprov av HPLC-grad hexan i GC-MS autosampler injektionsflaskor23. Lös 100 mg fettsyrametylestrar (FAMEs: C8 - C28) blandning retentionstiden standard i 200 µL hexan.
- För att skydda karbonylgrupper, tillsätt 20 μL av 30 mg mL-1 methoxyamine hydrochloride i pyridin till varje metanol extrakt och vatten extrakt (eller kombinerad metanol/vatten extrakt om använder) från steg 2,6, tomma och FAME kalibreringen prov23. Försegla injektionsflaskor med lock.
Varning: Pyridin är både mycket giftig och brandfarlig. Bära lämplig personlig skyddsutrustning för att förhindra hud- eller ögonkontakt och Undvik öppen låga. Dessutom volatilizes pyridin på RT orsakar skadliga luft förorening. Fungera endast i välventilerade utrymmen under ett dragskåp. - Vortex extrakt för 20 s. Sonicate extrakt för 60 s. Sedan, inkubera extrakt i en centrifug vid 37 ° C i 90 min vid 100 x g.
Obs: En överdriven mängd kolhydrater eller salter kan orsaka att crystalize efter som torkas ner metaboliter. Sonicating prover hjälper till att rekonstruera de kristalliserad metaboliterna i de derivatizing reagensen. - Efter inkubation, tillsätt 80 μl av N-metyl - N-(trimetylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorosilane till varje prov, vortex extrakt för 20 s. Sonicate extrakt för 60 s och inkubera extrakt igen i en Centrifugera vid 37 ° C under 30 minuter vid 100 x g.
- Cool extrakt RT (20-24 ° C), sedan överföra till GC-MS autosampler injektionsflaskor.
5. GC-MS analys
- Finjustera och kalibrera MS enligt leverantörens rekommendationer (se Tabell för material) innan analys för att kontrollera maskinen läser MS data korrekt. Kontrollera att helium gastrycket är inom angiven tolerans.
- Separat polära metaboliter i en GC-kolonn (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Ställ i ugn temperatur protokollet enligt följande: (1) inledande temperatur av 60 ° C i 1 min, (2) ramp till 325 ° C med en hastighet av 10 ° C min-1, och (3) Håll på 325 ° C i 5 min.
- Analysera extrakt med en GC som kopplas till en enda quadrupole MS. Set injektion port temperatur till en konstant 250 ° C. Injicera 1 μl av varje derivatized extrakt i splitless läge.
6. GC-MS databehandling
- Inspektera alla datafiler för att säkerställa att de korrekt fångades. Uppmärksamma potentiella förskjutningar när det gäller intern standard retentionstider och stödnivåer för att bekräfta att data infångande konsekvent i hela analysen.
- Konvertera formatet leverantör särskilda MS-data till ett allmänt MS-format om det behövs. Bearbeta rådata filer använder MetaboliteDetector24 kalibrera retention index baserat på FAME interna standarder. Efter att anpassa retentionstiderna för alla datafiler, fortsätta med deconvolution och slutligen metabolit identifiering genom att matcha retention index och GC-MS spectra mot de FiehnLib polar metabolit bibliotek25.
- Dubbelkontrollera återstående oidentifierade metaboliter mot NIST14 GC-MS biblioteket använder spektrala matchande. Validera identifieringar individuellt för att eliminera falska identifieringar och minska deconvolution fel.
7. vätska staten NMR analys
- Späd återstoden av vatten extrakt (~ 300 µL) med 10% (vol/vol) med en 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 intern standard. Du kan också kombinera vatten och metanol extrakt från steg 1 sedan resubstitute i vatten. Genom att göra det men kan några av de flyktiga föreningarna förloras under frystorkning steg. Typiska slutligt provvolymer är i intervallet 180-300 µL.
- Över blandningen till en hög kvalitet 3 mm ytterdiameter (OD) borosilikatglas NMR tube.
- Samla spectra använder ett NMR spectrometeren (helst minst 600 MHz) utrustad med en 5 mm trippel resonans salt-tolerant kalla sond och en kall koldioxidutsläpp förförstärkare.
- Samla 1D 1H spectra använder ett 1 D nukleära Overhauser verkställer spektroskopi (NOESY) presaturation experiment vid 298 K med en 4 s förvärv tid, 1,5 s återvinna dröjsmål, 65 536 komplexa punkter och 512 skanningar.
- Samla in 2D 1H -13C heteronuclear singel-quantum korrelation (HSQC) och 1H -1H totalt korrelation (TOCSY) spectra att hjälpa i tilldela metaboliter och validering.
- Bearbeta, tilldela och analysera alla spektra med hjälp av NMR analys programvara (se Tabell för material) för att kvantifiera stödnivåer i förhållande till den interna standarden. Identifiera metaboliter av matchande kemiska Skift, J-koppling och intensitet information i proven mot biblioteket.
Obs: Biblioteket förstärks ytterligare av anpassade riktade metabolit standarder och metaboliten tillägg som gjorts på en regelbunden basis. Protokollet kan pausas vid denna punkt och materialet lagras vid-20 ° C.
8. LC-MS gammaldags analys
- Rewet torkade kloroform extraktet genereras under steg 2.5 med 200 μL av metanol.
- Injicera 10 μL av varje utdrag i en ultra-prestanda Vätskekromatograf kopplad till en Orbitrap masspektrometer använder en omvänd fas laddade ytan hybrid kolumn (3,0 mm × 150 mm × 1,7 μm partikelstorlek). Ange en 34-min lutning (mobil fas A: acetonitril/H2O (40: 60) innehållande 10 mM ammoniumacetat; mobil fas B: acetonitril/isopropanol (10:90) innehållande ammoniumacetat 10 mM) med en flödeshastighet av 250 µL/min. användning både negativa och positiva jonisering lägen med högre energi kollision dissociation och kollision inducerad dissociation.
Varning: Acetonitril är ett öga, hud och respiratoriska irriterande. Bära lämplig personlig skyddsutrustning. Acetonitril är dessutom brännbart. Tillåter inte för att kontakta oxiderande ämnen, giftiga ångor kan vara producerad under bränning. - Överföra råfiler LC-MS/MS data till vätska tillsammans med målfilen (dvs, förteckning över > 25.000 lipid arter) för respektive jonisering läge (positiv eller negativ). Bearbeta raw-filen. Validera manuellt identifiering av resulterande genom att undersöka MS/MS spektra för förekomst av diagnostiska jonerna, om tillämpligt, matchande fragment joner (t.ex. fet acyl kedjor), isotopseparation, massa ppm fel av prekursorer och retentionstiden. Exportera listan tryggt identifierade lipider som en .tsv fil.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt och lagra materialet vid-20 ° C.
9. proteomik analys
- Extrahera proteiner enligt MPLEx protokoll20 från resten av metanol fas följd steg 2,4, tvätta extraktet med 20 gånger extrakt volymen ytterligare kyla (-20 ° C) metanol.
- Använd en 1 mL/50 mg kiseldioxid-baserade sorbent (se Tabell för material) till skick C18 SPE kolumner med 3 mL metanol, 2 mL 0,1% trifluorättiksyra (TFA) i vatten, följt av tillägg av extrakt från steg 9,1 med en hastighet som är större än 1 mL/min.
- Efter tillägg av provet, Tvätta kolonnen med 4 mL 95:4.9:0.1 vatten: acetonitrile:TFA och låt torka. Placera en 1,5 mL samling röret under kolumnen SPE och eluera provet med 1 mL 80:19.9:0.1 metanol: vatten: TFA.
- Koncentrat som extrakten till 100 µL under vakuum-assisted frysa torktumlare, mät sedan protein koncentrationen av bicinchoninic syra (BCA) kolorimetriska analys26 vid en våglängd på 562 nm.
- Centrifugera extrakt vid 10 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna resulterande supernatanten och torka den återstående pelleten under vakuum för 5 min. återsuspendera pelleten i vatten till en slutlig koncentration av 0,1 µg peptid per µL protein.
- Tillsätt Ditiotreitol till en slutkoncentration på 5 mM och inkubera vid 60 ° C i 30 min. Dilute 10-faldig med 100 mM NH4HCO38 M urealösning och inkubera vid 37 ° C för 3 h 1 mM CaCl2 och svin trypsin närvaro vid 1:50 enzym till protein förhållandet.
Obs: Protokoll kan pausas vid denna punkt och lagra material vid-20 ° C. - Separat utdrag via vätskekromatografi med en exponentiell lutningen av en 0,1% myrsyra i vatten mobil fas (A) och en 0,1% myrsyra i acetonitril mobil fas b på 10 kpsi och 500 nL min-1.
- Införa resulterande eluent i en ESI-kopplade masspektrometer samla spectra från 400-2,000 m/z med 100.000 upplösning vid m/z 400 i en linjär ion trap (LTQ) Orbitrap masspektrometer.
- Konvertera RAW spectra filer i mzML format i msConvert eller ProteoWizard att acceptera alla standardparametrar. Använda sökverktyget universell databas MSGFPlus för att söka resulterande proteom mot en riktade protein databas av proteinsekvenser som förutspådde från relevanta metagenome monterade genomen.
- Lägg till vanliga föroreningar (t.ex., trypsin, keratin, albumin) och ta bort alla exakt duplicerat proteinsekvenser för att förbättra peptid-till-vikt-spektrum matchstatistik. Utvärdera de resulterande MSGF spektrala sannolikhet poängen för att avgöra vilka peptid-till-vikt-spektrum match är bäst. Använd Q-värdet från MSGFPlus för att filtrera hela högen till 1% falsk upptäckten hastighet (FDR).
10. metabolomik analys och metabola nätverksbygge
- Sammanställa alla metabolit molekylformel som identifierats i steg 3, 6, 7 och 8 i en enda databas av metaboliter i proverna. Kombinera dessa metaboliter med enzym kommissionen (EG) eller KEGG ortologiprediktion (KO) numrerar av enzymer som identifierades i steg 9. Sök denna kombinerade dataset mot KEGG27 databasen, metaboliska vägar avsnitt.
- Manuellt utvärdera resultaten för att identifiera den sannolika spridningsvägar och integrera i en metabolisk modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde protokollet beskrivs kompletterande analys och jämfört torv med djup i S1 mossen i Gran- och torvmarker svar Under ändra miljöer (Gran) webbplats i Minnesota, USA. Dessa resultat är jämfört med de från en permafrost bog och fen från norra Sverige att visa hur platser kan variera inom metabolit och enzym. Vi identifierat 3.312 enzymer i proteomik analys. En analys av enzymer verksamhet med djup visar att antalet enzymer avtar kraftigt mellan 15 cm och 45 cm i SPRUCE mossen (figur 1).
Medan proteomik resultaten visar vilka proteiner uttrycks, visar metabola uppgifter vilka reaktioner faktiskt inträffar. Sammantaget vi identifierat 67,040 metaboliter (inklusive lipider) i alla torv prover från kombinationen av FTICR-MS, NMR, GC-MS och LC-MS analyser. Av dessa var vi kan tilldela molekylformel till 15,385 föreningar (figur 2). Den kombinerade metabola data spänner över en rad oxidationstal, massorna och sammansatta klasser.
Detta är vanligtvis visualiseras med hjälp av en van Krevelen diagram där de Atom H/C-nyckeltal av identifierade formel är ritade mot deras Atom .3VO/c nyckeltal28. Vi har inkluderat en extra dimension till typiska 2D format, föreställande NOSC genom färgkodning symboler som representerar enskilda formel (figur 3 och figur 4). Med ökande djup i SPRUCE mossen, finns en ökning av det totala antalet stora sekundära metaboliter identifieras genom FTICR-MS, särskilt i mycket komprimerad (nedre vänstra av van Krevelen tomten) och hydrerad formler (överst på tomten) (figur 4 ). Över samma djup finns det en minskning i antalet små mycket energisk föreningar identifierats av GC-MS och i lipider (figur 5). Detta kunde föreslå antingen att den lipider och små metaboliter konsumeras i ytan torven innan den når djupare djup eller att nedbrytning priser i djupa torven är snabbare än i ytan sådana att nedåtgående advecting föreningar förbrukas snabbt. Att skilja mellan dessa två konkurrerande hypoteser kräver en processnivå förståelse av C cykling på platsen. Sådan en processnivå förståelse kan bara vinnas genom koppling metabolomik och proteomik datamängderna. Vi åstadkommer detta genom cross-validera den kombinerade FTICR-MS, GC-MS, LC-MS och NMR identifierade metaboliter mot KEGG databasen. Så finner vi att de föreningar som vi identifierat är inblandade i gemensamma metaboliska vägar som tricarboxylic syra (TCA) cykel, glykolys och socker metabolism. Eftersom enskilda metaboliter kan vara inblandad i ökar flera vägar bekräftelse med enzymer vårt förtroende för tilldela vägar (figur 6).
Genom denna kartläggning finner vi bevis för sackaros och stärkelse metabolism i ytan torven, medan i djupare djup pyruvat och andra jäsning produkter bygga upp (figur 6). Dessa resultat är förenliga med den första hypotesen att sockerarter och andra energisk metaboliter bryts i ytan torven och inte når djupare torv djupet. Som kan ses i figur 5, socker (NOSC = 0) och aminosyror (0 < NOSC < 1) förbrukas i ytan torven, medan lipider (-2 < NOSC < -1) visas att ackumuleras med djup. Detta är förenligt med förväntningar baserat på NOSC värden att högre NOSC föreningar är mer lätt försämrad medan lägre NOSC föreningar kvarstår i mycket anaerob (dvs.te-limited) villkor subsurface torv. Detta synsätt skiljer också framgångsrikt jordtyper från olika miljöer. Till exempel, verkar markens organiska material från boreal torvmark skilja sin sammansättning än permafrost torvmark, samt inom fen och bog inom regionen permafrost. Dessa resultat överensstämmer med en tidigare studie som visade skillnaderna i webbplats geokemi mellan dessa livsmiljöer29, vilket tyder på att webbplatsen geokemi har en stor effekt på mikrobiell nedbrytning av C under marken.
Figur 1 : Proteomik analys indikerar stark djup skiktning av antalet enzymer. Staplarna visar medelvärden och felstaplarna indikerar en standardavvikelse av sammansättning. Detta tyder på att mikroorganismer är mest aktiva i torv ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Antalet föreningar identifierats av varje teknik i ytan torv (< 30 cm) av varje livsmiljö samt den mid (45 cm) och deep (87 cm) torv från SPRUCE mossen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : The van Krevelen diagram (atomic H/C vs. .3VO/c för varje identifierat molekylformel) för ytan (15 cm) SPRUCE mosse djup för att demonstrera täckningen av föreningar som kännetecknas av varje teknik. FTICR-MS tillåter oss att identifiera det största antalet föreningar (små cirklar), medan GC-MS (trianglar) är bra för att differentiera och identifiera sockerarter (H/C = 2 och o/c = 1). NMR (rutor) spektroskopi ger kvantitativ information om energiskt viktiga föreningar såsom socker, aminosyror, pyruvat, etc. LC-MS (diamanter) ger information om lipider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : The van Krevelen diagram (atomic H/C vs. .3VO/c för varje identifierat molekylformel) för djupet (87 cm) SPRUCE mosse djup för att demonstrera täckningen av föreningar som kännetecknas av varje teknik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Den relativa andelen av olika kemiska klasser identifierade via de olika teknikerna i olika djup. Barer ritas som medelvärden för varje djup ± en standardavvikelse. Klasserna som ritade innehåller aminosyror, sfingolipider (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diglyceridolja (GD), triacylglycerols (TG) och socker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Kombinera resultaten för att skapa ett metaboliska nätverk. Djupfördelningen av metaboliter som identifierats av NMR (en) och GC-MS (b), och en förenklad metabola karta (c) visar ett utvalt antal transformationer som identifierats vid SPRUCE bog. Gröna rutor anger metaboliter som minskar med djupet, bruna rutor anger metaboliter som ökar med djupet. Gröna förbindande pilar indikerar enzym som identifierats i vårt dataset som förmedlar den angivna transformeringen (enzym EG nummer anges bredvid pilarna). Grå förbindande pilar indikerar transformeringar som enzymer inte identifierades i vårt dataset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Singel-genomströmning, fullt-kopplade analys ström används för att karakterisera metaboliter och proteomet ger insikter om de vägar genom vilka C cykling sker i ett komplext ekosystem. Jord och torv är heterogena matriser, och därför en av de kritiska steg av denna metod uppstår i de tidigaste steg för att säkerställa att start torv eller jord material är mycket homogent. Det är bättre att slipa provet samt aggregat kan minska utvinning effektivitet. Detta är ett särskilt problem för aggregerade jordar och jordar med låg C och högt mineral innehåll som kan kräva användning av en rostfritt stål ball kvarn till adekvat homogenisera. Eftersom rumslig heterogenitet av jord och torv inom en experimentell webbplats kan vara hög, rekommenderas biologiska replikat.
Den här metoden utnyttjar tre lösningsmedel: vatten, metanol och kloroform, som bias typerna av föreningar är det möjligt att extrahera. I princip bör detta sekventiella extraktionen metod solubilize föreningar som täcker ett brett polaritet spektrum. Dock är dessa lösningsmedel inte optimerade för att extrahera organo-minaral komplex eller starkt stabiliserade komplex. om sådana föreningar är av intresse, hårdare lösningsmedel såsom starka syror och baser är att föredra, men hårdare extraktion processer kunde förändra kemin av proverna. Införliva sådana lösningsmedel i slutet av sekvensen utvinning kan minimera denna effekt. Dessutom kommer kloroform inaktivera kliniskt viktiga jord och torv bakteriella och virala patogener och andra sjukdomsalstrande biologiska patogener genom att lösa upp cellmembranen lipider. Således kommer att innehåller kloroform i protokollet utvinning minska riskerna med systembiologiska studier av prover som potentiellt smittade av patogener från olika regioner i världen. Om det finns farhågor om döda mikrobiella celler, skräp eller partiklar efter utvinning, rekommenderas filtrering extrakten genom ett 0,2 µm glas fiber filter.
För att effektivisera processen, vatten och metanol kombineras extrakt för GC-MS analys under steg 4.1. Dessa utdrag måste dock fortfarande vara separerade för FTICR-MS analys på grund av jonisering effektivitet frågor med ESI-källan. Fördelen med kör kombinerade extraktet på GC-MS är att fler metaboliter (som täcker ett större utbud av polaritet) kommer att identifieras. Nackdelen med att kombinera extrakt på denna punkt är att en av huvudmetaboliterna viktigt i mikrobiell behandling av organiskt material är metanol. Spår av metanol kommer alltid att förbli i kombinerade urvalet, även efter torkning, så om metanol är en metabolit av intresse, vatten extraktet måste köras separat. Att ha bra kontroller med ingen analyter hjälper också att identifiera potentiella föroreningar i proven.
I steg 7,1 beredningen av extrakt för NMR analys, liksom den GC-MS-analysen, antingen vatten extraktet ensam eller det kombinerade vattnet och metanol extrakt kan användas. Nackdelarna med detta är liknande dem som räknas upp i föregående punkt. Fördelen med att kombinera metanol och vatten extrakt är att några av de mindre polära metaboliter som är solubilized i metanol fraktionen kommer att identifieras. Dock på grund av det frystorkning steget förloras många mer volatila föreningar. Detta är särskilt missgynnar om kvantifiera flyktiga fettsyror är en kritisk komponent i experimentet.
I den här proceduren för att identifiera proteomik, bara fullt tryptic peptider är sökte, således endogena peptidase aktivitet och i-source splittringarna kommer att missas. Däremot, kan oxiderade metionin anses som en post-translationella modifieringen för peptid kandidaterna denna ändring inträffar vanligen under provtagning behandling och hantering. Kvantifiering av enzymer med hjälp av peptiden eluering områden kan göras, men är utanför räckvidden för detta projekt.
Många senaste framsteg i analysen av NOM och mikrobiella parametrar ger en mängd tekniker för att förstå organiska C cykling. Genom att kombinera dessa tekniker i ett enda strömlinjeformat protokoll, få vi en roman översikt av de processer som äger rum. Koppling proteomik analys med metabola analyser ger övertygande bekräftande bevis för att en reaktion sker faktiskt. Metabolisk analys ensam är begränsad i att det informerar oss som metaboliter är högre eller lägre i koncentration i jämförelser bland webbplatser eller efter en behandlingseffekt, men kan inte urskilja orsakerna till dessa förändringar. Till exempel vi identifierat minskande socker koncentrationer med djup i mossen, men utan ytterligare information är det oklart huruvida avtar med djupet beror på långsam ingångar eller snabb nedbrytning i den djupa torven. Analys av proteomet och minskande enzym uttrycket med djup tillåter oss att förkasta den andra hypotesen. Snarare är våra resultat förenliga med snabb socker nedbrytning i ytan torv begränsande indata till djupare djup. Dessa särskilda insikter är endast möjligt när alla tekniker anses parallellt som var och en erbjuder en unik, men kritiska del av C cykling pussel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka J.P. Chanton, J.E. Kostka och M.M. Kolton för hjälp med att samla in torv prover. Delar av detta arbete genomfördes vid miljömässiga Molecular Sciences Laboratory, en DOE Office av vetenskap användaren anläggning sponsras av Office av biologiska och miljöforskning. PNNL drivs av Battelle för DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830. Detta arbete fick stöd av US Department of Energy, Office of Science och Office av biologiska och miljömässiga forskning (bidrag: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 och DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
