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Chemistry

व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन की मांग पर आधारित Radioimmunotherapy Diels-Alder प्रतिक्रिया

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है संश्लेषण और एक ट्रांस-cyclooctene (TCO)-संशोधित एंटीबॉडी और एक १७७Lu-लेबल tetrazine (Tz) radioligand के लिए लक्षित radioimmunotherapy (PRIT) की विशेषता । इसके अलावा, यह इन दोनों के लिए निर्माण के उपयोग का ब्यौरा vivo में एक murine मॉडल में और अनुदैर्ध्य चिकित्सा अध्ययन में एक कोलोरेक्टल कैंसर ।

Abstract

जबकि radioimmunotherapy (RIT) कैंसर के उपचार के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है, radiolabeled एंटीबॉडी के लंबे pharmacokinetic आधा जीवन स्वस्थ ऊतकों को उच्च विकिरण खुराक में परिणाम कर सकते हैं । शायद आश्चर्य नहीं, कई अलग रणनीतियों के लिए इस परेशान सीमा दरकिनार विकसित किया गया है । इन दृष्टिकोणों का सबसे होनहार में से एक है radioimmunotherapy (PRIT) । PRIT immunoglobulin से रेडियोन्यूक्लाइड युग्मन पर predicated है, उन्हें अलग से इंजेक्शन, और फिर उन्हें लक्ष्य ऊतक पर vivo में गठबंधन करने के लिए अनुमति देता है. यह दृष्टिकोण एंटीबॉडी के असाधारण ट्यूमर लक्ष्यीकरण गुणों का दोहन करते हुए उनके pharmacokinetic कमियां स्कर्ट, जिससे गैर-लक्षित ऊतकों को विकिरण खुराक कम करने और आधे जीवन के साथ radionuclides के उपयोग की सुविधा पारंपरिक radioimmunoconjugates में उपयोग के लिए बहुत कम माना जाता है । पिछले पांच वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और अंय लोगों ने ट्रांस-cyclooctene (TCO) और tetrazine (Tz) के बीच व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन-डिमांड Diels-Alder (IEDDA) प्रतिक्रिया के आधार पर vivo को टार्गेट करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया है । इस रणनीति को सफलतापूर्वक लागू किया गया है पूर्व निर्धारित पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) और एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) इमेजिंग एंटीबॉडी-प्रतिजन प्रणालियों की एक किस्म के साथ । हाल के प्रकाशनों की एक जोड़ी में, हम अग्नाशय वाहिनीीय ग्रंथिकर्कटता और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा के murine मॉडल में IEDDA आधारित PRIT की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक १७७lu-DOTA-लेबल tetrazine radioligand ([१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz) और कोलोरेक्टल कैंसर लक्ष्यीकरण TCO huA33 (एंटीबॉडी-huA33) का एक TCO-संशोधित संस्करण का उपयोग कर PRIT के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । अधिक विशेष रूप से, हम huA33 के निर्माण का वर्णन करेंगे-TCO, संश्लेषण और radiolabeling के [१७७lu] Lu-DOTA-खूंटी7-Tz, और vivo में के प्रदर्शन के अनुदैर्ध्य के मॉडल में पुनर्वितरण और murine थेरेपी अध्ययन कोलोरेक्टल कार्सिनोमा.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT)-ट्यूमर के लिए चिकित्सीय radionuclides के वितरण के लिए एंटीबॉडी का उपयोग-लंबे समय1,2कैंसर के उपचार के लिए एक मोहक दृष्टिकोण किया गया है । दरअसल, इस वादे को गैर-Hodgkin का लिंफोमा: ९०Y-ibritumomab tiuxetan और १३१I-tositumomab3 के उपचार के लिए दो radioimmunoconjugates के संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य और औषधि प्रशासन की मंजूरी से रेखांकित किया गया है , 4. अभी तक अपनी प्रारंभिक दिनों से भी, RIT के नैदानिक संभावनाओं को एक महत्वपूर्ण जटिलता से प्रभावित किया गया है: स्वस्थ ऊतकों को उच्च विकिरण खुराक दर5,6. आम तौर पर बोल रहा हूं, RIT के लिए radioimmunoconjugates लंबे रहते radionuclides के साथ लेबल (जैसे, १३१मैं [टी½ = ८.० दिन] और ९०Y [t½ = २.७ दिन]) शारीरिक आधा जीवन के साथ कि सामंजस्य स्थापित के साथ अच्छी तरह से लंबी pharmacokinetic आधी इम्युनोग्लोबुलिन की जान. यह आवश्यक है, के रूप में यह सुनिश्चित करता है कि पर्याप्त रेडियोधर्मिता एक बार एंटीबॉडी संचलन के कई दिनों के बाद अपने इष्टतम वितरण तक पहुंच गया है रहता है । हालांकि, रक्त और लंबे समय से शारीरिक आधा जीवन में लंबे समय निवास के इस संयोजन अनिवार्य रूप से स्वस्थ ऊतकों के विकिरण में परिणाम है, जिससे चिकित्सीय अनुपात को कम करने और चिकित्सा की प्रभावकारिता सीमित7। कई रणनीतियों इस समस्या को दरकिनार, फैब, फैब ', एफ (' अटल बिहारी ')2, minibodies, और nanobodies8,9,10के रूप में छोटा एंटीबॉडी टुकड़े के उपयोग सहित, पता लगाया गया है । सबसे होनहार और आकर्षक, अभी तक कोई शक नहीं जटिल, वैकल्पिक दृष्टिकोण में से एक vivo11को निशाना बनाने में है ।

vivo में टार्गेटिंग नाभिकीय इमेजिंग और चिकित्सा के लिए एक दृष्टिकोण है जो कि उनके pharmacokinetic कमियां11,12,13स्कर्टिंग करते हुए एंटीबॉडी के अति सुंदर संबध और selectivity का दोहन करना चाहता है । यह अंत करने के लिए, पारंपरिक radioimmunotherapy में इस्तेमाल radiolabeled एंटीबॉडी दो घटकों में निर्मित है: एक छोटा सा अणु radioligand और एक immunoconjugate कि दोनों एक ट्यूमर प्रतिजन और aforementioned radioligand बांध कर सकते हैं । immunoconjugate पहले इंजेक्शन और एक ' सिर शुरू ' दिया है, अक्सर कई दिनों, जिसके दौरान यह लक्ष्य ऊतक में जमा और खून से साफ करता है । इसके बाद, छोटे अणु radioligand प्रशासित और या तो ट्यूमर पर immunoconjugate के साथ जोड़ती है या तेजी से शरीर से स्पष्ट करता है । संक्षेप में, vivo में निशाना शरीर के भीतर ही radiochemistry प्रदर्शन पर निर्भर करता है । रेडियोधर्मिता के संचलन को कम करके, इस दृष्टिकोण एक साथ स्वस्थ ऊतकों को विकिरण खुराक कम कर देता है और radionuclides के उपयोग की सुविधा (जैसे, ६८Ga, t½ = ६८ मिनट२११; के रूप में, टी½ = ७.२ ज) आधे जीवन है कि आम तौर पर एंटीबॉडी आधारित वैक्टर के साथ असंगत माना जाता है के साथ ।

देर से 1980 के दशक में शुरू, अलग दृष्टिकोण के एक मुट्ठी भर में vivo को निशाना बनाया गया है, bispecific एंटीबॉडी के आधार पर रणनीतियों सहित विकसित किया गया है, streptavidin और बायोटिन के बीच बातचीत, और पूरक की संकरण oligonucleotides१४,१५,१६,१७,१८. फिर भी प्रत्येक के लिए जटिलताओं से डिग्री अलग वापस आयोजित किया गया है, सबसे प्रसिद्ध streptavidin के प्रबल immunogenicity-संशोधित एंटीबॉडी19,20। पिछले पांच वर्षों में, हमारे समूह और दूसरों के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया है vivo में तेजी से और bioorthogonal व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन की मांग पर आधारित Diels- ट्रांसcyclooctene (TCO) और tetrazine के बीच Alder बंधाव (Tz) 21,22,23,24. इन रणनीतियों का सबसे सफल एक TCO संशोधित एंटीबॉडी और एक tz-असर radioligand कार्यरत है, के रूप में TCO आम तौर पर अपने टीज़ेड साथी से vivo में अधिक स्थिर है (चित्रा 1)25,26। के रूप में अंय लक्षित करने के तरीके में, मॉब-TCO immunoconjugate पहले और दिया समय परिसंचरण से स्पष्ट और ट्यूमर ऊतक में संचित करने के लिए प्रशासित है । बाद में, छोटे अणु Tz radioligand इंजेक्शन है, जिसके बाद यह या तो लक्ष्य ऊतक के भीतर immunoconjugate के साथ क्लिक करता है या शरीर से तेजी से साफ करता है. vivo में यह लक्ष्य रणनीति कई अलग एंटीबॉडी के साथ पीईटी और SPECT इमेजिंग के लिए अत्यधिक प्रभावी साबित कर दिया है/antigen सिस्टम, लगातार उच्च कंट्रास्ट के साथ छवियों का निर्माण और कम रहने वाले radionuclides के उपयोग को सक्षम करने जैसे 18 F (t½ = १०९ min) और ६४घन (t1/2 = १२.७ h)21,22,24। अभी हाल ही में, क्लिक-आधारित टार्गेटेड radioimmunotherapy (PRIT) की प्रभावकारिता अग्नाशय वाहिनीीय ग्रंथिकर्कटता (PDAC) और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा27,28के murine मॉडलों में प्रदर्शित किया गया है । इस अंत करने के लिए, चिकित्सीय रेडियोन्यूक्लाइड १७७लू (βअधिकतम = ४९८ कीव, टी1/2 = ६.७ दिन) दो अलग एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में कार्यरत था: 5B1, जो कार्बोहाइड्रेट antigen १९.९ लक्ष्य (ca 19.9) बैरे में व्यक्त PDAC , और huA33, जो लक्ष्य A33, एक transmembrane कोलोरेक्टल कैंसर के 95% > में व्यक्त ग्लाइकोप्रोटीन । दोनों ही मामलों में, १७७Lu-PRIT के लिए इस दृष्टिकोण ट्यूमर ऊतक में उच्च गतिविधि सांद्रता उपज, एक खुराक पर निर्भर उपचारात्मक प्रभाव बनाया, और एक साथ पारंपरिक की तुलना में स्वस्थ ऊतकों में गतिविधि सांद्रता कम धे-त्यसपछि radioimmunoconjugates ।

इस आलेख में, हम १७७lu-DOTA-लेबल tetrazine radioligand ([१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz) और TCO huA33 (एंटीबॉडी-huA33) का एक TCO-संशोधित संस्करण का उपयोग करते हुए PRIT के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करें । अधिक विशेष रूप से, हम huA33 के निर्माण का वर्णन-TCO (चित्रा 2), संश्लेषण और radiolabeling के [१७७lu] Lu-DOTA-खूंटी7-Tz (चित्रा 3 और चित्रा 4), और vivo में के प्रदर्शन कोलोरेक्टल कार्सिनोमा के murine मॉडल में पुनर्वितरण और अनुदैर्ध्य थेरेपी की पढ़ाई । इसके अलावा, प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा में, हम एक नमूना डेटा सेट प्रस्तुत करते हैं, इस दृष्टिकोण के अनुकूलन के लिए संभावित रणनीतियों का पता है, और vivo में के व्यापक संदर्भ में इस रणनीति पर विचार कर रहे है और PRIT । अंत में, यह ध्यान दें कि जब हम huA33-TCO और [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz का उपयोग कर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना है महत्वपूर्ण है इस प्रोटोकॉल में, इस रणनीति अत्यधिक मॉड्यूलर है और एंटीबॉडी की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है और Radionuclides.

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Protocol

vivo में सभी पशु प्रयोगों इस काम में वर्णित अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया और स्मारक Sloan Kettering कैंसर केंद्र, Weill कॉर्नेल चिकित्सा केंद्र, और हंटर कॉलेज के नैतिक दिशानिर्देशों के तहत निष्पादित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) ।

1. huA33-TCO की तैयारी

नोट: huA33 के संश्लेषण-TCO पहले29की सूचना दी गई है । हालांकि, पाठक की आसानी के लिए, यह इष्टतम स्थितियों के लिए समायोजन के साथ यहां दोहराया है ।

  1. एक १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, (ई) के १२५ μL समाधान तैयार-cyclooct-4-enyl 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl कार्बोनेट (TCO-एन एच एस) शुष्क dimethyl formamide (DMF) में ४० मिलीग्राम/एमएल (०.१५ एम) की एकाग्रता पर । इस समाधान aliquoted और जमे हुए कर सकते है पर-८० ° c भविष्य के प्रयोगों में उपयोग के लिए ।
  2. एक अलग १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक 5 मिलीग्राम/एमएल फॉस्फेट (पंजाबियों; २.७ mm पोटेशियम क्लोराइड, १३७ मिमी सोडियम क्लोराइड, और ११.९ मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच ७.४) के 1 मिलीलीटर में huA33 का समाधान तैयार करते हैं ।
  3. ०.१ मीटर ना2CO3के छोटे aliquots (< 5 μL) का उपयोग करके, चरण १.२ से 8.8-9.0 के एंटीबॉडी समाधान के पीएच को समायोजित करें । या तो पीएच कागज या एक microelectrode के साथ पीएच मीटर की निगरानी के लिए पीएच और व्यायाम की देखभाल कि पीएच ९.० से अधिक नहीं है का उपयोग करें ।
  4. चरण १.३ में वर्णित एंटीबॉडी समाधान करने के लिए, धीरे एंटीबॉडी की मात्रा के सापेक्ष TCO-एन एच एस के ४० दाढ़ समकक्ष के लिए एक खंड जोड़ें । उदाहरण के लिए, यदि 5 मिलीग्राम (30 nmol) huA33 समाधान में है, जोड़ें ९.० μL (१.२० μmol) के ४० मिलीग्राम/एमएल (०.१५ M) TCO-एन एच एस का समाधान ।
    नोट: TCO-एन एच एस hydrophobic है । जब यह एंटीबॉडी के समाधान के लिए जोड़ रहा है, यह धीरे से जोड़ने और वर्षण को रोकने के लिए आंदोलन के साथ । अंतिम प्रतिक्रिया समाधान में मात्रा के अनुसार 10% DMF से अधिक न करें ।
  5. एक thermomixer पर हल्के आंदोलन (५०० rpm) के साथ 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
  6. 1 घंटे के बाद, huA33-TCO immunoconjugate शुद्ध एक पूर्व पैक डिस्पोजेबल आकार अपवर्जन लवण कॉलम का उपयोग कर ।
    1. Equilibrate भंडारण के दौरान स्तंभ में मौजूद किसी भी रक्षकों को हटाने के लिए आपूर्तिकर्ता द्वारा वर्णित के रूप में आकार अपवर्जन स्तंभ का वर्णन करता है । एक ठेठ प्रक्रिया पंजाब के एक खंड है कि कॉलम की मात्रा से मेल खाती है के साथ कॉलम 5x धुलाई शामिल है: 5 पंजाब के x २.५ मिलीलीटर ।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा टिप्पण आकार अपवर्जन कॉलम में प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें ।
    3. के बाद प्रतिक्रिया मिश्रण कॉलम में प्रवेश किया है, पंजाब के एक उचित राशि जोड़ने के लिए समाधान की कुल मात्रा लाने के लिए कॉलम में जोड़ा २.५ मिलीलीटर । उदाहरण के लिए, यदि विकार प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप १.३ मिलीलीटर की कुल मात्रा में, स्तंभ के लिए अतिरिक्त पंजाब के १.२ मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. eluent के रूप में पंजाब के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर उत्पाद ले लीजिए ।
      नोट: यह कदम पंजाब के 2 मिलीलीटर, पीएच ७.४ में अंतिम निर्माण huA33-TCO उपज होगा ।
  7. २८० एनएम तरंग दैर्ध्य की निगरानी एक यूवी विज़ spectrophotometer का उपयोग कर huA33-TCO की एकाग्रता को मापने । सबसे IgGs के लिए दाढ़ विलुप्त गुणांक (ε२८०) २१०,००० एम-1सेमी-1है ।
  8. immunoconjugate के एक उच्च एकाग्रता के साथ एक समाधान वांछित है, तो एक ५०,००० आणविक वजन कट के साथ एक केंद्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर huA33-TCO समाधान ध्यान केंद्रित निर्माता निर्देशों का पालन ।
    नोट: कई एंटीबॉडी समग्र या एकाग्रता के दौरान हाला करने के लिए जाना जाता है । जब एक नए एंटीबॉडी के साथ इस प्रक्रिया का प्रयास, शोधकर्ताओं साहित्य या अपने स्वयं के प्रश्न में एंटीबॉडी हैंडलिंग अनुभव को ठुकराने चाहिए ।
  9. अगर यह तुरंत जरूरत है अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा huA33-TCO immunoconjugate स्टोर । यह भविष्य में 4 दिन से अधिक इस्तेमाल किया जा करने के लिए है, तो अंधेरे में-८० ° c पर यह दुकान.
    नोट: यह प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु है । पूर्ण huA33-TCO immunoconjugate अंधेरे में-८० ° c पर कम से 6 महीने के भंडारण के लिए स्थिर होना चाहिए ।

2. का संश्लेषण Tz-खूंटी7-NHBoc

  1. एक १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, tetrazine एनके 5 मिलीग्राम भंग-hydroxysuccinimidyl एस्टर (Tz-एन एच एस; १२.६ μmol) में ०.१५ मिलीलीटर की निर्जल dimethyl sulfoxide (DMSO) ।
  2. एक अलग १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, भंग 8 बीओसी के मिलीग्राम-संरक्षित एमिनो खूंटी बहुलक, ओ-(2-Aminoethyl)-o ′-[2-(बीओसी-अमीनो) एथिल] hexaethylene ग्लाइकोल (NHBoc-PEG7-NH2; १७.१ μmol) में ०.१५ मिलीलीटर की निर्जल DMSO ।
  3. Tz-एन एच एस के समाधान के लिए, triethylamine (चाय) के 3 μL (२१.३ μmol, १.७ दाढ़ समकक्ष) जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. NHBoc-खूंटी7के लिए गुलाबी tetrazine समाधान जोड़ें-२.२ कदम से एनएच2 समाधान और हल्के आंदोलन के साथ कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी ।
  5. 30 मिनट के बाद, एच2ओ में प्रतिक्रिया 1:1 पतला और रिवर्स चरण सी18 उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर प्रतिक्रिया शुद्ध tz-खूंटी7-NHBoc से किसी भी unreacted tz-एन एच एस अलग करने के लिए । एसिड के बिना सॉल्वैंट्स का उपयोग बीओसी रक्षा समूह के समयपूर्व हटाने को रोकने के लिए । दोनों tz-खूंटी7-NHBoc और tz-५२५ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर एन एच एस मॉनिटर ।
    नोट: प्रतिधारण बार स्पष्ट रूप से उच्च प्रत्येक प्रयोगशाला के HPLC उपकरण पर निर्भर कर रहे है (पंप, कॉलम, टयूबिंग, आदि), और उचित नियंत्रण शुद्धि से पहले चलाया जाना चाहिए । हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए, यदि एक ढाल के 5:95 MeCN/एच 2 ओ (दोनों किसी भी additive के बिना ) 95:5 MeCN/एच2ओ पर 30 मिनट, एक प्रवाह की दर 1 मिलीलीटर/मिनट, और एक विश्लेषणात्मक ४.६ mm x २५० mm C18स्तंभ का उपयोग किया जाता है , tz-एन एच एस और tz-खूंटी7-NHBoc के प्रतिधारण समय क्रमशः 16 मिनट और 18 मिनट के आसपास हैं ।
  6. जमा तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर HPLC eluent फ्रीज और एल्यूमीनियम पंनी में अब जमे हुए संग्रह ट्यूब लपेटो । HPLC मोबाइल चरण को हटाने के लिए एक रात भर lyophilizer पर जमे हुए संग्रह ट्यूब रखें । उत्पाद एक विशेषता उज्ज्वल गुलाबी ठोस हो जाएगा ।
    नोट: यदि तरल नाइट्रोजन उपलब्ध नहीं है, एक-८० डिग्री फ्रीजर में सूखी बर्फ या रात भर में एकत्र HPLC eluent फ्रीज ।

3. ट्ज़ का संश्लेषण-खूंटी7-NH2

  1. चरण २.६, Tz-खूंटी7-NHBoc से उत्पाद के लिए, dichloromethane (डीसीएम) के १.५ मिलीलीटर जोड़ें और एक छोटे से गोल नीचे कुप्पी के लिए इस समाधान हस्तांतरण ।
  2. जोड़ें trifluoroacetic एसिड (TFA) dropwise के गुलाबी समाधान के लिए कदम ३.१ से ०.२५ मिलीलीटर ।
  3. प्रतिक्रिया हल्के आंदोलन के साथ आर टी पर 30 मिनट के लिए मशीन की अनुमति दें ।
  4. 30 मिनट के बाद, रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से विलायक लुप्त हो जाना । ३७ डिग्री सेल्सियस के एक पानी के स्नान के तापमान से अधिक नहीं है ।
  5. ०.५ मिलीलीटर पानी में गुलाबी चिपचिपा उत्पाद का पुनर्गठन ।
  6. बीओसी-संरक्षित अग्रदूत से अलग Tz-खूंटी7-एनएच2 के लिए उलट-चरण C18 HPLC का उपयोग कर उत्पाद शुद्ध । मॉनिटर दोनों tz-खूंटी7-NHBoc और Tz-खूंटी7-एनएच2 ५२५ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर ।
    नोट: प्रतिधारण बार स्पष्ट रूप से उच्च प्रत्येक प्रयोगशाला के HPLC उपकरण पर निर्भर कर रहे है (पंप, कॉलम, टयूबिंग, आदि), और उचित नियंत्रण शुद्धि से पहले चलाया जाना चाहिए । हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए, यदि 5:95 MeCN/एच2ओ (दोनों के साथ ०.१% TFA) के लिए 95:5 MeCN/एच2ओ पर 30 मिनट, एक प्रवाह की दर 1 मिलीलीटर/मिनट, और एक विश्लेषणात्मक ४.६ mm x २५० mm C18स्तंभ का उपयोग किया जाता है , tz-खूंटी7-NHBoc और tz-खूंटी7-NH2 के अवधारण समय क्रमशः 18 मिनट और 13 मिनट के आसपास हैं ।
  7. जमा तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर HPLC eluent फ्रीज और एल्यूमीनियम पंनी में अब जमे हुए संग्रह ट्यूब लपेटो । HPLC मोबाइल चरण को हटाने के लिए एक रात भर lyophilizer पर जमे हुए संग्रह ट्यूब रखें । उत्पाद उज्ज्वल गुलाबी ठोस होगा ।
  8. चरण ३.७, Tz-खूंटी7-NH2, १५० μL के साथ DMSO और एक १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण से उत्पाद का पुनर्गठन ।
  9. Tz की एकाग्रता को मापने-खूंटी7-एनएच2 ५२५ एनएम तरंग दैर्ध्य की निगरानी एक यूवी विज़ spectrophotometer का उपयोग कर । Tz-खूंटी7-NH2 (ε५२५) के लिए दाढ़ विलुप्त गुणांक ५३५ एम-1सेमी-1है ।

4. का संश्लेषण Tz-खूंटी7-DOTA

  1. भंग Tz-खूंटी7-NH2 (४.५ मिलीग्राम, ६.९ μmol) DMSO के ०.१५ मिलीलीटर में (या बस कदम ३.८ में बनाया समाधान के साथ आगे बढ़ना) ।
  2. चाय के 22 दाढ़ समकक्ष जोड़ें (21 μL, ०.१५ mmol) चरण ४.१ से tetrazine-युक्त समाधान के लिए ।
  3. जोड़ें 10 मिलीग्राम (१४.२ μmol) के पी-SCN-बीएन-DOTA के रूप में एक ठोस और भंवर के लिए समाधान के बारे में 2 मिनट या जब तक सामग्री पूरी तरह से भंग है ।
  4. प्रतिक्रिया हल्के आंदोलन के साथ आर टी पर 30 मिनट के लिए मशीन की अनुमति दें ।
  5. 30 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया 1:1 एच2में कमजोर हे और उत्पाद को शुद्ध का उपयोग कर उलट-चरण सी18 HPLC को दूर करने के लिए unreacted p-SCN-बीएन-DOTA । पी-SCN-बीएन-DOTA २५४ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर नजर रखी जा सकता है, जबकि Tz-खूंटी7-DOTA सबसे अच्छा ५२५ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर नजर रखी है ।
    नोट: प्रतिधारण बार स्पष्ट रूप से उच्च प्रत्येक प्रयोगशाला के HPLC उपकरण पर निर्भर कर रहे है (पंप, कॉलम, टयूबिंग, आदि), और उचित नियंत्रण शुद्धि से पहले चलाया जाना चाहिए । हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए, यदि 5:95 MeCN/एच2ओ का एक ढाल (दोनों ०.१% TFA के साथ) 95:5 MeCN/एच2ओ पर 30 मिनट और एक विश्लेषणात्मक ४.६ x २५० मिमी सी18कॉलम इस्तेमाल कर रहे हैं, Tz-खूंटी7-DOTA और पी-SCN-बीएन-DOTA के प्रतिधारण समय है लगभग १५.६ मिनट और १६.१ मिनट, क्रमशः ।
  6. जमा तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर HPLC eluent फ्रीज और एल्यूमीनियम पंनी में अब जमे हुए संग्रह ट्यूब लपेटो । HPLC मोबाइल चरण को हटाने के लिए एक रात भर lyophilizer पर जमे हुए संग्रह ट्यूब रखें । उत्पाद चमकीला गुलाबी पाउडर होगा ।
  7. DMSO के ०.१५ मिलीलीटर में उत्पाद का पुनर्गठन और एक यूवी विज़ spectrophotometer निगरानी ५२५ एनएम तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर एकाग्रता को मापने । Tz-खूंटी7-DOTA (ε५२५) के लिए दाढ़ विलुप्त गुणांक ५३५ एम-1सेमी-1है ।
  8. संश्लेषण सफल था सत्यापित करने के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRMS) द्वारा अंतिम यौगिक का विश्लेषण करें । इस कार्य में चर्चा किए गए सभी यौगिकों के प्रायोगिक रूप से निर्धारित रासायनिक पारियों और आणविक भार के लिए तालिका 1 देखें ।
  9. -८० ° c पर अंधेरे में शुद्ध Tz-खूंटी7-DOTA समाधान की दुकान ।
    नोट: यह प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु है । पूर्ण Tz-खूंटी7-DOTA के प्रणेता इन शर्तों के तहत कम से 1 वर्ष के लिए स्थिर है ।

5. १७७लू Radiolabeling के Tz-खूंटी7-DOTA

चेतावनी: प्रोटोकॉल के इस कदम हैंडलिंग और रेडियोधर्मिता के हेरफेर शामिल है । इन चरणों का प्रदर्शन करने से पहले-या रेडियोधर्मिता के साथ किसी भी अन्य काम प्रदर्शन-शोधकर्ताओं अपने घर संस्था के विकिरण सुरक्षा विभाग के साथ परामर्श करना चाहिए. विकिरण के लिए जोखिम को कम करने के लिए हर संभव कदम उठाएं ।

नोट: radiometals की छोटी मात्रा के साथ काम करते समय यह अनुशंसा की जाती है कि सभी बफ़र्स का पता लगाने धातुओं से मुक्त हो समंवय साइट बाध्यकारी में हस्तक्षेप को रोकने के लिए ।

  1. एक १.७ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में जोड़ें २०० μL के ०.२५ एम अमोनियम एसीटेट बफर के साथ समायोजित 1 एम एचसीएल के aliquots पीएच ५.५ ।
    नोट: लेबलिंग के लिए गतिविधि का कम से ३७० MBq का उपयोग करते हुए, उपयोग बफ़र की मात्रा १०० µ करने के लिए कम किया जाना चाहिए l
  2. बफ़र समाधान के लिए [१७७Lu] LuCl3 की इच्छित मात्रा जोड़ें । जोड़ा गया राशि प्रयोग में विषयों की संख्या पर निर्भर करेगा और रेडियोधर्मी खुराक प्रशासित किया जा रहा है. यह अनुशंसा की जाती है कि रेडियोधर्मिता के 1-2 अतिरिक्त खुराक के लायक एक एहतियात के रूप में शुद्धि चरण के दौरान रेडियोधर्मिता के संभावित नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति के लिए जोड़ा जा.
  3. Tz-खूंटी7-DMSO में DOTA कदम ५.२ में रेडियोधर्मी मिश्रण करने के लिए जोड़ें । Tz-खूंटी7-DOTA की राशि का परीक्षण किया जा रहा विषयों की संख्या पर निर्भर है. इस विषय पर और अधिक विवरण चरण 6.2.2.2 में पाया जा सकता है ।
  4. समाधान के लिए 20 मिनट के लिए ३७ ° c में मशीन की अनुमति दें ।
  5. सत्यापित करें कि radiolabeling ५० mM EDTA, मोबाइल चरण के रूप में पीएच ५.५ के साथ रेडियो इंस्टेंट पतली परत क्रोमैटोग्राफी (रेडियो-iTLC) का उपयोग पूरा हो गया है । लेबल [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz आधारभूत पर रहेगा — Rf = 0 — जबकि नि: शुल्क [१७७lu] Lu3 + EDTA द्वारा समंवित किया जाएगा और विलायक फ्रंट, आरएफ = १.० (चित्रा 3 बी) के साथ यात्रा करेंगे ।
  6. यदि मात्रात्मक लेबलिंग प्राप्त नहीं है, तो निःशुल्क radiometal का समंवय करने के लिए अतिरिक्त ligand जोड़ें । वैकल्पिक रूप से, लेबल शुद्ध [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-एक सी18 कारतूस का उपयोग कर टीज़ । उपयोग के लिए निर्माता निर्देशों का पालन करें । एक नमूना प्रक्रिया नीचे दी गई है ।
    1. प्रधानमंत्री ने कारतूस धीरे से एक बड़ी सिरिंज के साथ कारतूस के माध्यम से इथेनॉल के 5 मिलीलीटर के माध्यम से गुजर रहा है । फिर, acetonitrile के 5 मिलीलीटर से गुजारें और फिर 5 मिलीलीटर (DI) एच2ओ के एमएल ।
    2. एक छोटे सिरिंज में ५.३ कदम से radioligand समाधान ड्रा और इसे धीरे सी18 कारतूस पर सुई. तो, DI एच2के 10 मिलीलीटर के साथ कारतूस धो किसी भी असीम [१७७Lu] LuCl3को दूर करने के लिए हे ।
    3. इथेनॉल के ५०० µ l के साथ Elute. 10-15 मिनट के लिए सूखी नाइट्रोजन या आर्गन की एक कम प्रवाह दर के साथ पोत पर गुजर द्वारा अंतिम उत्पाद से किसी भी इथेनॉल निकालें । बाद में, खारा में radioligand चरण 6.2.2.2 में निर्धारित मात्रा में resuspend ।

6. वीवो स्टडीज में

चेतावनी: 5 धारा के रूप में, प्रोटोकॉल के इस कदम हैंडलिंग और रेडियोधर्मिता के हेरफेर शामिल है । इन कदमों को करने से पहले शोधकर्ताओं को अपने गृह संस्थान के विकिरण सुरक्षा विभाग से परामर्श करना चाहिए । विकिरण के लिए जोखिम को कम करने के लिए हर संभव कदम उठाएं ।

  1. पशुओं की तैयारी
    1. महिला athymic में नग्न चूहों, चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण 5 x 106 SW1222 कोलोरेक्टल कैंसर सेल मीडिया और मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) का एक 1:1 मिश्रण के १५० μL में निलंबित कोशिकाओं और इन एक 100-150 मिमी3 xenograft (14-18 दिनों में विकसित करने की अनुमति टीका के बाद) ।
    2. एक वितरण प्रयोग के लिए पशुओं की छंटाई
      1. एक बार ट्यूमर कैलिपर माप द्वारा निर्धारित के रूप में पर्याप्त आकार के हैं, जानवरों प्रत्येक पलटन लगभग एक ही औसत ट्यूमर मात्रा सुनिश्चित करने के लिए क्रमबद्ध करें । जानवरों की अमिट स्याही (एक बैंड, दो बैंड, आदि) के साथ पूंछ पर चिह्नों के द्वारा प्रत्येक पिंजरे में प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
    3. एक अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन के लिए जानवरों की छंटाई
      1. ट्यूमर कैलिपर माप द्वारा निर्धारित के रूप में पर्याप्त आकार के होते हैं, प्रयोग भर में सही ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए जानवरों में से प्रत्येक के लिए कान टैग देते हैं ।
        नोट: प्रयोग के दौरान संख्यात्मक कान टैग गिर सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, यह एक व्यवस्थित तरीके से कान पायदानों के साथ इन शारीरिक टैग के साथ सिफारिश की है (यानी, ठीक है, छोड़ दिया, द्विपक्षीय, सही एक्स 2, एक्स 2 छोड़ दिया) ।
      2. जानवरों की तरह है कि प्रत्येक पलटन में औसत ट्यूमर मात्रा मोटे तौर पर बराबर है । पशु छंटाई के लिए निंनलिखित विधि एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम का उपयोग किया जा सकता है ।
        1. तीन अलग कॉलम में पशु पहचान संख्या, कान पायदान पैटर्न, और ट्यूमर की मात्रा की सूची ।
        2. सबसे बड़ा ट्यूमर मात्रा के लिए छोटी से डेटा सॉर्ट.
        3. एक चौथे कॉलम में, एक snakelike पैटर्न में पिंजरों के माध्यम से प्रत्येक जानवर एक पिंजरे संख्या और चक्र आवंटित । उदाहरण के लिए, अगर वहां 5 पिंजरों रहे हैं, इस कॉलम भरा जाएगा "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." जब तक सभी जानवरों को एक पिंजरा सौंपा है ।
        4. पिंजरों आवंटित कर रहे हैं एक बार, पिंजरे संख्या से डेटा सॉर्ट. कान पायदानों इस्तेमाल किया जा रहा है, तो यह सुनिश्चित करें कि एक दिया पिंजरे में प्रत्येक जानवर एक अद्वितीय कान पायदान पैटर्न है । यदि डुप्लिकेट (दो या एक ही पैटर्न के अधिक) एक दिया पिंजरे में हैं, एक माउस के साथ एक और पिंजरे से लापता पैटर्न के साथ स्वैप जब तक हर पिंजरे अद्वितीय कान पायदान पैटर्न के साथ जानवरों की है ।
  2. योगों और इंजेक्शन
    नोट: दोनों के लिए इंजेक्शन के अनुक्रम वितरण और चिकित्सा अध्ययन आय निम्नानुसार: huA33-TCO पहले इंजेक्ट किया जाता है, के बाद [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-एक पूर्व निर्धारित अंतराल के बाद Tz ।
    1. Immunoconjugate
      1. huA33-TCO समाधान के एक aliquot को पतला करने के लिए १.९ से ०.८ मिलीग्राम/एमएल में ०.९% बाँझ खारा ।
      2. पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) वाले सीरिंज में huA33-TCO सॉल्यूशन के १५० µ l (१०० µ g) की खुराकों को ड्रा करें और इन सीरिंज को बर्फ पर स्टोर करे ।
        नोट: BSA उपचार सिरिंज की दीवारों के लिए एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी कम कर देता है.
      3. पूंछ नस को चौड़ा करने के लिए 3 मिनट के लिए एक गर्मी लैंप के तहत जानवरों को गर्म ।
      4. xenograft-असर माउस की पूंछ नस में huA33-TCO समाधान सुई । huA33-TCO के लिए माउस के ट्यूमर में जमा करने के लिए 24 घंटे (या एक अलग पूर्व निर्धारित समय अंतराल) की अनुमति दें ।
    2. Radioligand
      1. Radiolabel Tz-खूंटी7-DOTA धारा 5 में उल्लिखित के रूप में.
      2. १५० μL में खुराक ड्रा ०.९% बाँझ खारा युक्त १.१ दाढ़ के समकक्ष Tz-खूंटी7-DOTA की राशि के सापेक्ष huA33-TCO प्रशासित. एक उदाहरण के रूप में, यदि १०० μg (०.६७ nmol) huA33-TCO के पशु में इंजेक्ट किया गया था और [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz प्रतिक्रिया मिश्रण १२.४ GBq/μmol की एक विशिष्ट गतिविधि के साथ किया गया था, तो खुराक प्रत्येक गतिविधि के ९.१४ MBq युक्त तैयार किया जाएगा. यह ०.७४ nmol के Tz (१.१ दाढ़ eq. सापेक्ष huA33-TCO) के लिए संगत है ।
      3. पूंछ नस को चौड़ा करने के लिए 3 मिनट के लिए एक गर्मी लैंप के तहत जानवरों को गर्म ।
      4. xenograft-असर माउस की पूंछ नस में radioligand की खुराक सुई । इंजेक्शन लगाने के लिए गतिविधि की राशि शोधकर्ता द्वारा निर्धारित की जाती है । प्रकाशित डेटा ७.४-५५.५ MBq की एक श्रेणी के भीतर खुराक पर निर्भर उपचारात्मक प्रभाव ट्यूमर के आकार पर दिखाया गया है ।
  3. पुनर्वितरण
    1. radioligand के प्रशासन के बाद वांछित समय बिंदु पर, एक 2% ओ2 /6% सह2 गैस मिश्रण का उपयोग चूहों के प्रत्येक पलटन euthanize ।
      नोट: माध्यमिक शारीरिक इच्छामृत्यु (जैसे, गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन) के लिए तरीकों के बारे में किसी भी संस्थागत आवश्यकताओं का पालन करें ।
    2. प्रत्येक जानवर के लिए, ब्याज के सभी अंगों को हटाने, उंहें एक पानी के स्नान में धोने के लिए किसी भी अतिरिक्त रक्त निकालने के लिए, और उंहें खुली हवा में एक कागज तौलिया पर 5 मिनट के लिए सूखी । सुझाए गए क्रम में नमूना अंग सूची: रक्त, ट्यूमर, दिल, फेफड़े, जिगर, तिल्ली, पेट, छोटी आंत , बड़ी आंत, गुर्दे, मांसपेशी, हड्डी, त्वचा, पूंछ ।
    3. एक बार पर्याप्त रूप से सूख, पूर्व में अंगों जगह प्रयोज्य संस्कृति ट्यूबों तौला । अब एक बार फिर से भरा ट्यूबों वजन प्रत्येक अंग या ऊतक के द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए ।
    4. एक गामा काउंटर का उपयोग ट्यूबों में से प्रत्येक में गतिविधि को मापने । तैयार की खुराक को मापने के लिए इस्तेमाल किया डिटेक्टर के लिए गामा काउंटर में मापा गतिविधि जांचना. प्रत्येक साधन पर १७७लू के रेडियोधर्मी मानकों की गणना और गतिविधि और गिनती-प्रति मिनट (सीपीएम) के बीच रूपांतरण के लिए एक अंशांकन कारक का निर्धारण ।
    5. एक बार ग्राफ के रूप में ( चित्रा 5देखें) के साथ एक मानक विचलन एक बार टिप्पण एक पट्टी के साथ प्रदर्शित प्रत्येक अंग के लिए सामान्यीकृत सालभर मतलब के रूप में इस तरह के वितरण डेटा प्लॉट । नमूना समूहों के बीच में सांख्यिकीय मतभेद एक ख़राब टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें महत्व जब p < ०.०५ प्राप्त है ।
  4. चिकित्सा निगरानी
    1. कैलिपर्स का प्रयोग, आयताकार ट्यूमर (लंबाई) के रूप में अच्छी तरह से चौड़ाई, जो लंबाई के लिए सीधा है की सबसे लंबी तरफ उपाय । किसी ellipsoid की मात्रा के लिए सूत्र का उपयोग करके वॉल्यूम परिकलित करें: (4/3) πL · W H, जो ½ को सरल करता है L · W2, यह मानते हुए कि ऊंचाई लगभग चौड़ाई के बराबर है ।
      नोट: यह भी एक handheld ट्यूमर को मापने के उपकरण का उपयोग करने के लिए संभव है अगर एक उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. समय के साथ वजन बढ़ाने या वजन घटाने को ट्रैक करने के लिए एक संतुलन पर प्रत्येक माउस तौलना ।
    3. महत्वपूर्ण बात, संकट के संकेत के लिए एक जानवर की शारीरिक उपस्थिति की निगरानी, जैसे वापस कूबड़ या चमड़े के नीचे रक्त वाहिकाओं उठी (जो haematotoxicity संकेत हो सकता है) ।
      नोट: ट्यूमर माप हर 1-2 दिन अनुदैर्ध्य चिकित्सा अध्ययन के दौरान एकत्र किया जाना चाहिए ।
    4. समय पर औसत ट्यूमर की मात्रा के रूप में अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन से प्लॉट डेटा और यदि वांछित ट्यूमर मात्रा शुरू करने के लिए सामान्य. नमूना समूहों के बीच एक ही दिन में सांख्यिकीय मतभेद एक ख़राब टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें महत्व जब पी < ०.०५ प्राप्त है । अधिक व्यापक सांख्यिकीय विश्लेषण कर सकते है और बाहर किया जाना चाहिए के रूप में एक प्रशिक्षित biostatistician द्वारा सिफारिश की ।

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Representative Results

huA33 करने के लिए TCO के विकार अमीन-प्रतिक्रियाशील TCO-एन एच एस और lysine की सतह पर predicated अवशेषों के बीच युग्मन पर immunoglobulin है । इस विधि अत्यधिक मजबूत और reproducible है और मज़बूती से 2-4 TCO/मॉब के एक डिग्री के लेबल की पैदावार । इस मामले में, मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री लगभग ४.० TCO/मॉब के लेबलिंग की एक डिग्री की पुष्टि करने के लिए नियोजित किया गया था; एक समान मूल्य एक रिपोर्टर24के रूप में एक fluorophore संशोधित tetrazine का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । tetrazine ligand के संश्लेषण तीन चरणों में किया जाता है: (1) एक मोनो-बीओसी-संरक्षित खूंटी linker करने के लिए tz-एन एच एस के युग्मन (2) इस मध्यवर्ती उपज Tz-खूंटी7-NH2के लिए, और (3) के बीच एक thiourea लिंकेज के गठन पी-SCN-बीएन-DOTA और Tz-खूंटी7-NH2. यह प्रक्रिया अपेक्षाकृत सतही है और मुलाजिम Tz-खूंटी7-DOTA की एक समग्र उपज में ~ ७५% । मध्यवर्ती के प्रत्येक HRMS और 1ज-एनएमआर की विशेषता है; यह डेटा तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है ।

radiolabeling पर चलती, १७७lu3 + आम तौर पर एक क्लोराइड नमक के रूप में वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त होता है [१७७Lu] LuCl3 में ०.५ एम एचसीएल. १७७लू के साथ tz-खूंटी7-DOTA के radiolabeling radioligand [१७७lu] लू-DOTA-खूंटी7-Tz बहुत सीधा है: सिर्फ 20 मिनट में, प्रतिक्रिया पूर्ण है, > 99% में वांछित उत्पाद का निर्माण radiochemical पवित्रता के रूप में रेडियो द्वारा निर्धारित-iTLC । आमतौर पर, कोई आगे शुद्धि के लिए तैयार करने से पहले आवश्यक है । tz/TCO-आधारित टार्गेटिंग पर साहित्य के एक सर्वेक्षण से पता चलता है कि एक tz: मॉब दाढ़ अनुपात ~ 1:1 vivo डेटा10 में सबसे अच्छा पैदा करता है । एक परिणाम के रूप में, यह सबसे अधिक संभव दाढ़ गतिविधि में radioligand प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है । उदाहरण के लिए, यहां पर चर्चा की गई गैर वितरण प्रयोगों को रोजगार [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-एक दाढ़ गतिविधि के साथ Tz ~ 12 GBq/µmol । अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन के लिए, इसके विपरीत में, [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-उच्च दाढ़ गतिविधि के साथ Tz के इंजेक्शन के तिल की संख्या को बदलने के बिना रेडियोधर्मिता की बड़ी खुराक के प्रशासन की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया था tetrazine ।

के रूप में चर्चा में आगे संबोधित किया जाएगा, को समझने और PRIT के लिए किसी भी दृष्टिकोण को अनुकूलित करने के लिए, अधिक वितरण प्रयोगों सर्वोपरि महत्व के हैं । इस मामले में, immunoconjugate के प्रशासन और radioligand के इंजेक्शन के बीच इष्टतम अंतराल समय निर्धारित करने के लिए, वितरण प्रयोगों का आयोजन किया गया । इस अंत करने के लिए, हम athymic नग्न अपने दाहिने कंधे पर चमड़े के नीचे A33 प्रतिजन-व्यक्त SW1222 xenografts असर चूहों कार्यरत हैं । इन पशुओं को १०० µ जी (०.६७ nmol) की huA33-TCO 24, ४८, ७२, या १२० एच के इंजेक्शन से पूर्व प्राप्त हुआ [१७७लू] लू-DOTA-खूंटी7-Tz (९.१४ MBq, ०.७४ nmol) । चित्रा 5 से पता चलता है कि सभी इंजेक्शन अंतराल ट्यूमर ऊतक में उच्च गतिविधि सांद्रता के साथ ही स्वस्थ अंगों में कम गतिविधि सांद्रता का उत्पादन । 24 एच इंजेक्शन अंतराल १२० एच पोस्ट-इंजेक्शन: २१.२ ± 2.9% आईडी में सबसे अधिक ट्यूमर ले affords जी/ शर्तों के प्रत्येक सेट भी प्रभावशाली ट्यूमर के लिए अंग गतिविधि एकाग्रता अनुपात पैदा करता है । एक 24 एच अंतराल के साथ, उदाहरण के लिए, पैदावार ट्यूमर के लिए रक्त, ट्यूमर से जिगर, और ट्यूमर के लिए मांसपेशियों के अनुपात के साथ 20 ± 5, ३७ ± 7, और १८४ ± 30, क्रमशः, १२० एच radioligand के प्रशासन के बाद । इन निष्कर्षों के आधार पर, एक 24 एच अंतराल बाद अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन के लिए चुना गया था (नीचे देखें) ।

के लिए vivo अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन में, समानताएं (n = 10) athymic नंगा चूहों का असर उनके दाहिने पार्श्व पर चमड़े के नीचे SW1222 xenografts प्रशासित किया गया huA33-TCO (१०० यूजी, ०.६७ nmol) के इंजेक्शन से 24 घंटे पहले [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी 7-Tz. तीन विभिन्न प्रायोगिक साथियों कार्यरत थे, प्राप्त १८.७, ३७, या ५५.५ MBq के [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz (इसी दाढ़ गतिविधियों के लिए 24, ४५, और ७० GBq/µmol). इसके अलावा, दो नियंत्रण पलटनों PRIT आहार का एक आधा प्राप्त: या तो huA33-TCO (१०० यूजी, ०.६७ nmol) बिना [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-tz or [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-tz (५५.५ MBq, ०.७४ nmol) बिना huA33-TCO । इन आवश्यक नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए कि चिकित्सीय प्रतिक्रिया या तो immunoconjugate या अकेले radioligand द्वारा नहीं है । ट्यूमर के संस्करणों के अध्ययन के पहले तीन हफ्तों के लिए हर 3 दिन मापा गया और फिर प्रयोग के निष्कर्ष तक प्रति सप्ताह एक बार (७० दिन, 10 आधा १७७लू के जीवन) । जैसा कि चित्र 6में देखा गया है, नियंत्रण समूहों की तुलना में प्रयोगात्मक समानताओं के जवाब में एक स्टार्क अंतर है । जबकि PRIT रणनीति के केवल एक घटक प्राप्त चूहों में ट्यूमर अनियंत्रित हो जाना जारी, पूर्ण PRIT आहार प्राप्त करने के चूहों के ट्यूमर बढ़ रही बंद करो और अंत में अध्ययन की शुरुआत में मापा उन नीचे अच्छी तरह से संस्करणों के लिए सिकुड़ते. महत्वपूर्ण बात, कोई विषाक्त दुष्प्रभाव देखा गया है, और सभी जानवरों को अपने प्रारंभिक द्रव्यमान (चित्रा 7A) के 20% के भीतर एक वजन बनाए रखा । डेटा के एक कापलान-Meier भूखंड अध्ययन के एक और भी अधिक हड़ताली दृश्य प्रदान करता है: जबकि नियंत्रण पलटने वाले सभी चूहों को कुछ हफ्तों के भीतर euthanized जाना था, प्रायोगिक साथियों के चूहों जांच के अंत में अस्तित्व का एक सही रिकॉर्ड था ( चित्रा 7B).

Figure 1
चित्रा 1: radioimmunotherapy व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder प्रतिक्रिया पर आधारित निशाना बनाया कार्टून की । यह आंकड़ा संदर्भ #28 से संशोधित किया गया है । Membreno, आर., कुक, बी. ई., फंग, के. के., लुईस, जे. एस., & Zeglis, बी. एम. क्लिक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) कोलोरेक्टल कार्सिनोमा की मध्यस्थता से निर्धारित Radioimmunotherapy । आणविक Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (२०१८) । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: huA33-TCO के निर्माण की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Tz-खूंटी7-DOTA के संश्लेषण की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: (क) योजनाबद्ध की radiolabeling की [ १७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz; (B) प्रतिनिधि रेडियो-iTLC वर्णलेख का प्रदर्शन > 98% radiochemical शुद्धता का [१७७lu] lu-DOTA-खूंटी7-Tz. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: में का वितरण vivo में huA33-TCO और [१७७Lu]-DOTA-खूंटी7के साथ निशाना बनाया-athymic नग्न चूहों असर चमड़े के नीचे SW1222 मानव कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमर 24 (बैंगनी), ४८ (हरे रंग) का उपयोग करने वाले अंतराल का प्रयोग , ७२ (नारंगी), या १२० (नीला) घंटे । n = 4 के साथियों से मानक त्रुटियों के साथ डेटा; सांख्यिकीय विश्लेषण एक ख़राब छात्र टी परीक्षण द्वारा किया गया था, * *p < ०.०१ । यह आंकड़ा संदर्भ #28 से संशोधित किया गया है । Membreno, आर., कुक, बी. ई., फंग, के. के., लुईस, जे. एस., & Zeglis, बी. एम. क्लिक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) कोलोरेक्टल कार्सिनोमा की मध्यस्थता से निर्धारित Radioimmunotherapy । आणविक Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (२०१८) । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: चूहों के 5 समूहों के अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन (n = 10 प्रत्येक) समय के एक समारोह के रूप में औसत ट्यूमर मात्रा में चित्रित चमड़े के नीचे SW1222 ट्यूमर असर (क); और समय के एक समारोह के रूप में प्रारंभिक मात्रा को सामान्यीकृत ट्यूमर मात्रा (ख). नियंत्रण समूहों या तो immunoconjugate बिना radioligand (नीला) या radioligand बिना immunoconjugate (लाल) प्राप्त किया । तीन उपचार समूह प्राप्त huA33-TCO (१०० µ g, ०.६ nmol) द्वारा फ़ॉलो 24 h बाद में या तो १८.५ (हरा), ३७.० (जामुनी), या ५५.५ (नारंगी) MBq (~ ०.८ nmol प्रत्येक मामले में) के [१७७Lu]-DOTA-खूंटी7-Tz । लॉग-रैंक (Mantel-कॉक्स) परीक्षण के द्वारा, अस्तित्व महत्वपूर्ण था (पी < ०.०००१) सभी उपचार समूहों के लिए । यह आंकड़ा संदर्भ #28 से संशोधित किया गया है । Membreno, आर., कुक, बी. ई., फंग, के. के., लुईस, जे. एस., & Zeglis, बी. एम. क्लिक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) कोलोरेक्टल कार्सिनोमा की मध्यस्थता से निर्धारित Radioimmunotherapy । आणविक Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (२०१८) । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: चूहों के 5 समूहों के अनुदैर्ध्य चिकित्सा अध्ययन के दौरान जानवरों के लिए वजन घटता (n = 10 प्रत्येक) असर चमड़े के नीचे SW1222 ट्यूमर (क); इसी कापलान-Meier अस्तित्व वक्र (बी) । नियंत्रण समूहों या तो immunoconjugate बिना radioligand (नीला) या radioligand बिना immunoconjugate (लाल) प्राप्त किया । तीन उपचार समूह प्राप्त huA33-TCO (१०० µ g, ०.६ nmol) द्वारा फ़ॉलो 24 h बाद में या तो १८.५ (हरा), ३७.० (जामुनी), या ५५.५ (नारंगी) MBq (~ ०.८ nmol प्रत्येक मामले में) के [१७७Lu]-DOTA-खूंटी7-Tz । यह आंकड़ा संदर्भ #28 से संशोधित किया गया है । Membreno, आर., कुक, बी. ई., फंग, के. के., लुईस, जे. एस., & Zeglis, बी. एम. क्लिक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) कोलोरेक्टल कार्सिनोमा की मध्यस्थता से निर्धारित Radioimmunotherapy । आणविक Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (२०१८) । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

यौगिक 1 एच-एनएमआर शिफ्ट्स HRMS (ईएसआई)
५०० MHz, DMSO
Tz-खूंटी7-NHBoc १०.५२ (एस, अ. ज), ८.५० (एम, 3H), ७.८२ (टी, सी. ए.), ७.४६ (डी, 2H), ६.६९ (टी, सी. ए.), ४.३३ (डी, 2H), ३.४२ (एम, 22H), ३.३३ (t, 2H), ३.३१ (t, 2H), ३.१२ (q, 2H), २.९९ (q, 2H), २.१२ (t, 2H), २.०३ (t, 2H), २.१२ (t, 2H), १.७० (q, 2H), १.२९ (s 9H m/z परिकलित । के लिए C३५H५७N7O11न: ७७४.४००५; पाया गया: ७७४.४०१४.
Tz-खूंटी7-NH2 १०.५८ (एस, अ. ज), ८.४६ (एम, 2H), ७.८७ (टी, सी. ए.), ७.७५ (डी, 2H), ७.५२ (डी, अ. ज.), ४.४० (डी, 2H), 3.60-3.50 (एम, 26H), ३.४० (टी, 2H), ३.३२ (बी एस, 2H), ३.२० (क्यू, 2H), २.९९ (बी एस, 2H), २.१९ (टी, 2H), २.१२ (टी, 2H), १.७९ (क्यू, 2H) । m/z परिकलित । के लिए C30H५०N7O9: ६५२.३६७०; पाया गया: ६५२.३६७६.
Tz-खूंटी7-DOTA १०.५७ (एस, अ. ज), ९.६३ (बी. ए., अ. ज), ८.४५ (एम, 3H), ७.८६ (एम, ए. ए.), ७.७३ (बी. एस., ए.), ७.५४ (डी, 2H), ७.४१ (एम, 2H), ७.१९ (एम, 2H), ६.५४ (बी एस, अ. ज), ४.४० (डी, 2H), 4.00-3.20 (एम, 55H), ३.२० (क्यू, 4H), २.५४ (एस, ए, एच), २.१८ (टी, 3H), २.१० (टी, 3H), १.७६ (क्यू , 2H) । m/z परिकलित । के लिए सी५०एच७६एन11ओ15एस: १२०२.५६; पाया गया: १२०३.५७४१.

तालिका 1. इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्बनिक यौगिकों के लिए लक्षण वर्णन डेटा ।

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Discussion

एक इस दृष्टिकोण की ताकत के लिए vivo में निशाना साधने-विशेष रूप से bispecific एंटीबॉडी और radiolabeled haptens पर रणनीतियों predicated के संबंध में-अपनी मॉड्यूलरता है: ट्रांसcyclooctene moieties किसी भी एंटीबॉडी के लिए जोड़ा जा सकता है, और tetrazine radioligands अपने क्लिक भागीदारों के साथ प्रतिक्रिया करने की क्षमता को बिगड़ने के बिना radionuclides की एक असाधारण विविधता के साथ radiolabeled जा सकता है । अभी तक अंय एंटीबॉडी/प्रतिजन प्रणाली के लिए इस दृष्टिकोण के अनुकूलन के रूप में यहां वर्णित प्रोटोकॉल डुप्लिकेट के रूप में सरल नहीं है । बेशक, किसी भी प्रयास के लिए एक नया मॉब-TCO immunoconjugate या एक उपंयास tetrazine असर radioligand बनाने के लिए उपयुक्त रासायनिक और जैविक लक्षण वर्णन परख, स्थिरता और जेट के लिए परीक्षण सहित के साथ किया जाना चाहिए । लेकिन इस से परे, वहां दो चर कि विशेष रूप से पता लगाने और अनुकूलन महत्वपूर्ण हैं: (1) मॉब-TCO immunoconjugate प्रशासित और (2) मॉब-TCO और radioligand के प्रशासन के इंजेक्शन के बीच अंतराल समय के द्रव्यमान । दोनों कारकों नाटकीय रूप से लक्ष्यीकरण प्रणाली के vivo व्यवहार में प्रभावित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक immunoconjugate या अंतराल अवधि है कि बहुत कम कर रहे है की पीढ़ी उच्च खुराक के उपयोग के लिए radioligand और immunoconjugate संचलन में शेष के बीच क्लिक प्रतिक्रियाओं के कारण रक्त में वांछनीय उच्च गतिविधि सांद्रता में परिणाम कर सकते हैं । इसके विपरीत, immunoconjugate के आम जनता को रोजगार कि बहुत कम है या पीढ़ी लंबे अंतराल अवधि पडती एक विफलता के कारण ट्यूमर में गतिविधि सांद्रता को कम कर सकते है प्रतिजन या निष्ठुर (हालांकि धीमी गति से) isomerization ट्रांस की -cyclooctene to निष्क्रिय सीआईएस-cyclooctene । इन पंक्तियों के साथ, immunoconjugate और निशाना अंतराल की जनता की एक श्रृंखला का उपयोग कर बायोमास वितरण प्रयोगों असाधारण सहायक हो सकता है । बेशक, यह भी है कि उचित नियंत्रण के साथ मिलकर में चलाने की सिफारिश की है vivo प्रयोगों में किसी भी । इनमें शामिल है — लेकिन इन तक ही सीमित नहीं हैं — antigen-ऋणात्मक कक्ष रेखाओं की विशेषता वाले प्रयोग, उन पलटनों को अवरुद्ध करते हैं, जो unconjugated एंटीबॉडी की एक विशाल अतिरिक्तता प्राप्त करते हैं, अकेले radioligand के प्रशासन, radioligand के इंजेक्शन के बाद TCO- कमी immunoconjugate, और vivo में एक गैर विशिष्ट, isotype नियंत्रण TCO असर immunoconjugate का उपयोग कर निशाना ।

वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग प्रयोगों अनुकूलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर चिकित्सीय रेडियोन्यूक्लाइड उत्सर्जन करता है positrons या ' imaged ' फोटॉनों या यदि चिकित्सीय रेडियोन्यूक्लाइड का एक ' imaged ' isotopologue उपलब्ध है । अंततः, चर के सेट है कि उच्च ट्यूमर गतिविधि सांद्रता और उच्च ट्यूमर के लिए पृष्ठभूमि गतिविधि एकाग्रता अनुपात का सबसे अच्छा संतुलन प्रदान बाद में अनुदैर्ध्य थेरेपी अध्ययन के लिए चुना जाना चाहिए । यहां प्रस्तुत मामले में, huA33-TCO के १०० µ जी 24 एच Dosimetry गणना के अंतराल के साथ इंजेक्शन था-विशेष रूप से उन है कि ट्यूमर खुराक और चिकित्सीय अनुपात की गणना के लिए अनुमति-भी अनुकूलन की प्रक्रिया के दौरान सहायक हो सकता है ।

यह भी आशाजनक [१७७लू] लू-DOTA-खूंटी7-Tz/huA33-TCO प्रणाली है कि अतिरिक्त अनुकूलन से लाभ हो सकता है विकसित किया गया है कि ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है । एक १७७लू के साथ PRIT और पारंपरिक RIT के लिए इस दृष्टिकोण से dosimetry डेटा के बीच एक तुलना-huA33 के संस्करण लेबल से पता चलता है कि PRIT की ट्यूमर खुराक पारंपरिक RIT की है कि नीचे निहित है । इसके अलावा, PRIT प्रणाली (०.०५४ mSv/MBq) की प्रभावी खुराक पारंपरिक RIT (०.०६८ mSv/MBq) की तुलना में केवल थोड़ा कम है ।

फिलहाल इन मुद्दों को लेकर दो उपायों की पड़ताल की जा रही है । सबसे पहले, एक वृक्ष पाड़ TCOs की संख्या में वृद्धि करने में सक्षम विकसित किया गया है प्रत्येक एंटीबॉडी30के लिए संलग्न । निशाना पीईटी इमेजिंग के संदर्भ में, इस दृष्टिकोण नाटकीय रूप से ट्यूमर गतिविधि सांद्रता को बढ़ा देता है, और [१७७लू] के साथ अनुरूप प्रयोगों लू-DOTA-खूंटी7-Tz चल रहे हैं. दूसरा, tetrazine-असर समाशोधन एजेंटों के उपयोग PRIT के संदर्भ में उपयोगी हो सकता है । radioligand के इंजेक्शन से पहले एजेंटों समाशोधन के प्रशासन के लिए एक तरह से रक्त में अवशिष्ट immunoconjugate की एकाग्रता में कमी और इस तरह गतिविधि सांद्रता को कम करने के तरीके के रूप में निशाना साधने की एक किस्म में शोषण किया गया है स्वस्थ अंगों23,31। एजेंटों समाशोधन का उपयोग अपनी कमियां के बिना नहीं है, हालांकि; जिनमें से सबसे उल्लेखनीय एक पहले से ही बेशक जटिल चिकित्सीय मोडल की जटिलता बढ़ रही है । बहरहाल, मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर सेंटर में शोधकर्ताओं ने हाल ही में निर्माण पर एक संमोहक रिपोर्ट प्रकाशित एक टीज़ेड-dextran समाशोधन एजेंट के लिए निशाना बनाया पीईटी इमेजिंग, और के साथ संयोजन के रूप में निर्माण के उपयोग पर डेटा [१७७Lu] लू-DOTA-खूंटी7-टीज़ेड और huA33-TCO आगामी३२हैं । PRIT के dosimetric लाभों को अधिकतम करने के लिए एक और दृष्टिकोण कम शारीरिक आधा जीवन के साथ radionuclides का उपयोग है । यह इमेजिंग के लिए अत्यधिक प्रभावी साबित कर दिया है; हालांकि, कम शारीरिक आधा जीवन के साथ चिकित्सीय radionuclides कुछ और दूर के बीच हैं ।

अंत में, हम अगर हम ठीक से व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन की मांग Diels-Alder प्रतिक्रिया के आधार पर निशाना लगाने की आंतरिक सीमाओं के कुछ पता करने में विफल याद किया जाएगा । इन समस्याओं के पहले सभी के लिए दृष्टिकोण में निहित है vivo निशाना लगाने: एंटीबॉडी कार्यरत लक्ष्य ऊतक के लिए बाध्यकारी पर आंतरिक रूप से नहीं किया जा सकता है । यह, ज़ाहिर है, आवश्यक है, के रूप में एंटीबॉडी radioligand के बजाय एक intracellular डिब्बे में तनहा करने के लिए सुलभ रहना चाहिए । इस सीमा बेशक मुश्किल को दरकिनार है, हालांकि यह हाल ही में दिखाया गया है कि internalizing की धीमी गति से उदारवादी दरों के साथ एंटीबॉडी vivo ३३,३४का लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दूसरा, isomerization निष्क्रिय करने के लिए सक्रिय ट्रांसcyclooctene के vivo में धीमी सीआईएस-cyclooctene क्षमता TCO-असर immunoconjugate के प्रशासन के बीच अंतराल की लंबाई सीमित करने के लिए है और radioligand के इंजेक्शन । गंभीर, १२० घंटे तक के अंतराल अभी भी दोनों को निशाना बनाया पीईटी इमेजिंग और PRIT के संदर्भ में उत्कृष्ट परिणाम प्रदान की है । हालांकि, इन लंबे अंतरालों का उपयोग लगभग हमेशा ट्यूमर गतिविधि सांद्रता, एक परिणाम है जो इस isomerization से उपजी हो सकता है में मामूली कटौती के साथ है । इस समस्या को हल करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं ने जेट समझौता किए बिना अधिक स्थिर ट्रांस-cyclooctenes बनाने का प्रयास किया है, जबकि अंय लोगों ने पूरी तरह से नए dienophiles को विकसित करने की कोशिश की है tetrazine ३५ के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम . आने वाले वर्षों में, यह हमारी आशा है कि इन रासायनिक विकास PRIT के लिए leveraged किया जाएगा ।

अंत में, PRIT व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder बंधाव पर आधारित एक आपात और कुछ हद तक अपरिपक्व प्रौद्योगिकी निर्विवाद है । हालांकि, हम फिर भी हम प्राप्त की है और इस रणनीति के नैदानिक वादा के लिए उत्साहित है नैदानिक परिणाम द्वारा प्रोत्साहित कर रहे हैं । हमें पूरी उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल दूसरों को प्रोत्साहित करने का पता लगाने और इस दृष्टिकोण का अनुकूलन और इस तरह प्रयोगशाला से क्लिनिक के लिए अपनी यात्रा ईंधन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने डॉ जैकब ह्यूटन को मददगार बातचीत के लिए धन्यवाद दिया । लेखक भी अपने उदार धन (R00CA178205 और U01CA221046) के लिए NIH का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

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केमिस्ट्री इश्यू १४३ radioimmunotherapy प्री-टार्गेटेड radioimmunotherapy टार्गेटिंग प्रतिलोम इलेक्ट्रॉन डिमांड Diels-Alder रिएक्शन tetrazine ट्रांस-cyclooctene huA33 A33 antigen लुटेटियम-१७७
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