Summary
这里介绍的协议允许在体内炎症条件下对原代人类淋巴细胞的肺归巢能力进行定性。通过化学清除肺组织的光片荧光显微镜, 可以对过敏性炎症小鼠模型中通过人工免疫细胞的选择性转移的肺浸润进行成像和定量。
Abstract
高度激活的免疫细胞的大量组织积累是各种慢性炎症性疾病的标志, 在受影响患者的临床管理中成为一个有吸引力的治疗靶点。为了进一步优化旨在调节促炎症免疫细胞病理不平衡组织浸润的治疗策略, 对疾病和器官特异性有更好的认识将是特别重要的。外周血淋巴细胞的归巢特性。这里描述的实验方案允许监测肺积累荧光标记和采用转移的人类淋巴细胞的背景下, 纸张引起的肺部炎症。与经常用于分析免疫细胞迁移和趋化性的标准体外检测不同, 现在引入的体内设置考虑到了肺特定的组织方面以及复杂炎症的影响发生在活的小鼠有机体的场景。此外, 三维横截面光片荧光显微镜成像不仅提供了浸润免疫细胞的定量数据, 而且还描述了免疫细胞在炎症肺内的定位模式。总的来说, 我们能够为慢性炎症性肺病领域的免疫学研究引入一种具有高价值的创新技术, 通过遵循所提供的分步协议, 可以很容易地应用。
Introduction
典型的肺部炎症性疾病, 如过敏性哮喘和慢性阻塞性肺病 (copd), 是众所周知的驱动, 增加招募活性淋巴细胞到肺组织1,2。淋巴细胞释放的细胞因子 (例如, IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、ifn-Γ和 TNF-α) 进一步促进先天免疫细胞的趋化和适应性免疫细胞, 诱导成纤维气道重塑或直接损害肺实质 2.到目前为止, 负责肺组织内淋巴细胞病理积累的潜在机制还没有完全了解。与描述为肠道和皮肤归巢的组织选择性 T 细胞印迹相比, 肺树突状细胞 (Dc) 显然能够获得优先肺浸润的原始外周 T 细胞, 至少部分是通过诱导 CCR4 表达在淋巴细胞表面3。除了 ccr4 外, 气道浸润 t 细胞的特征还包括趋化因子受体 ccr5 和 cxcr3 的表达特别增加, 在外周血中的 t 细胞为 1,4,5。总体而言, 现有数据与 t 淋巴细胞在生理或炎症条件下肺归巢的概念是一致的, 即在生理或炎症条件下, t 淋巴细胞的肺归巢涉及许多不同的趋化因子受体及其各自的配体, 因此关键取决于控制先天免疫细胞和适应性免疫细胞之间的协作1。特别是在病原体或过敏原接触的初始阶段, 先天免疫系统的细胞通过立即释放不同的趋化因子4、ccl1、ccl17 等不同的趋化因子, 对 TLR刺激或 ige 介导的交联做出反应,Ccl22、ccl20、cxcl10 和 pgd21、6、7。作为一个主要的例子, PGD2与趋化剂受体 CRTh2 之间的相互作用被认为是特别重要的 th2 细胞的趋化性, 因此在哮喘的临床管理中表现为有希望的治疗靶点。事实上, 与安慰剂第8组 相比, 中度哮喘患者在使用选择性 crth2 拮抗剂治疗后一秒钟 (fev 1) 症状改善, 强制呼气量显著增加 (fev 1),9。在炎症反应的一个更进步的状态下, 已经被招募的 T 细胞能够通过释放 IL-4 和 IL-13 作为肺 Dc 的有效刺激物, 进一步扩增肺淋巴细胞的积累。随后, 这些骨髓源性先天细胞以依赖 stat6 的方式调节 ccl17 和 ccl22 的表达, 以 1,10,11的方式。 虽然描述的情况的复杂性仍然阻碍了对 T 细胞肺归巢的全面了解, 但它为潜在的炎症性或过敏性肺病的优化治疗控制提供了大量的分子靶点。因此, 迫切需要创新的实验技术, 这些技术能够进一步深化和补充我们在 T 细胞趋化和肺定位领域的知识。
由于人体内淋巴细胞的肺归巢受到多种细胞、体液和物理参数1的影响, 现有的大多数实验方法都无法模拟这一免疫学过程的整体复杂性。相反, 许多标准的方案, 以分析肺归巢选择性地集中在一个特定的方面涉及淋巴细胞吸引, 粘附, 迁移和保留的级联。除了对外周或肺浸润淋巴细胞整合素和趋化因子受体的 mRNA 或蛋白表达模式进行纯描述性测定, 以及对血液中各自趋化因子水平的补充测量,支气管肺泡灌洗 (bal) 或肺组织12,13, 14,15, 在体外细胞培养检测允许淋巴细胞粘附或趋化的功能表征在确定的实验条件下 16,17,18。原则上, 静态体外粘附检测监测培养的淋巴细胞与内皮单层或玻璃滑块的结合能力, 并与重组内皮粘附分子 (如 MAdCAM-1, VCAM-1) 结合, 而标准的体外化疗通常是为了量化淋巴细胞在经井系统19中沿着趋化因子梯度迁移的能力而进行的。这两种体外设置都能控制实验条件的调节和调节, 但另一方面缺乏已知的重要变量, 这些变量对体内趋化和淋巴细胞的粘附产生了重要影响。静态细胞培养检测主要无视永久血流19引起的剪切力的影响, 并可能忽略周围免疫环境和相互作用的非淋巴细胞免疫细胞的参与,两者都存在于一个活的有机体中。为了克服这些限制, 对静态体外趋化或粘附检测结果的解释需要在流动条件下的动态粘附实验中进一步验证, 在流动条件下, 在 20、21和炎症器官病理的体内模型19。事实上, 从动物研究中分析不同肺部疾病的定义模型中的转基因小鼠, 可以得出有关炎症或过敏条件下调节 t 细胞肺归巢的重要结论.22,23. 野生小鼠和有特定感兴趣基因缺乏缺陷的小鼠肺浸润淋巴细胞的定量比较是定义特定细胞影响的一个成熟且广泛使用的工具T 细胞分布的疾病驱动模式上的途径或受体。然而, 与之前讨论过的体外细胞培养检测不同的是, 基于经典动物模型的研究设计缺乏分析和监测直接来自炎症性肺患者血液或 BAL 的原代人类 T 细胞的能力疾病。因此, 它仍然具有挑战性的功能验证功能指定的肺部疾病是否能够印迹人类淋巴细胞的优先肺取向, 以及临床参数可能对这种情况的影响多大。最近, 在炎症性肠病 (IBD) 的背景下引入了一种非常优雅的体内方法, 它能够克服其中的大部分限制, 并为肠道淋巴细胞归巢的高级翻译研究开辟了新的途径 24.利用溶剂型组织清除方案, 然后横截面光片荧光显微镜作为一种强大的成像工具, 可以直观地显示采用转移的人 T 细胞的浸润和分布在结肠免疫缺陷小鼠的肠道 24。特别是, 该实验设置实现了两项主要创新: (1) 在实验定义的体内条件下, 可以对原代人体免疫细胞进行分析;(2) 患病器官的相当大的区域 (约1.5 厘米 x1.5 厘米) 可以以高分辨率成像, 然后进行三维重建。此外, 最近的几项研究成功地确定了使用溶剂型组织清除和光片荧光显微镜作为先进的肺成像25,26的重要工具。为了从肺免疫学领域的这一技术进步中受益, 我们现在采用了肺归巢分析系统。
这里提出的协议提供了一个逐步介绍如何净化和荧光标记原代人类 T 细胞转移到小鼠诱发肺部炎症, 而且, 详细介绍了随后的过程的光片荧光显微镜成像, 包括器官制备和图像处理。总体而言, 我们希望通过引入一个复杂但可行的实验模型来监测人类淋巴细胞肺在体内的归巢, 以支持未来炎症或过敏性肺病领域的翻译研究。
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Protocol
涉及动物的实验是根据 Erlangen 有关地方当局批准的议定书进行的 (德国 Würzburg, Regierung von Unterfranken)。老鼠被安置在特定的无病原体条件下。人类血液的收集得到了地方道德委员会和埃尔朗根-纽伦堡大学机构审查委员会的批准。每个病人都给予了书面知情同意。
1. 诱导小鼠过敏性肺炎症
请注意:如前面的研究27所述, 以下实验过程允许在小鼠中诱发过敏性气道炎症, 从而引发 bal 中先天和适应性免疫细胞的积累。所述协议已在 C57BL/6J 小鼠中建立, 但应允许采用其他标准自交系。
有关体内实验过程的摘要, 请参见图1 a.
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用腹腔注射酮胺/木糖对小鼠进行麻醉。
注:仅使用6周以上、体重至少为16克的 C57BL/6J 小鼠。- 在 PBS 中制备酮胺/木胺溶液 (12 Mg/l 氯胺酮; 1.6 mg/mL xylazine), 并确定小鼠的确切体重。
- 向第一只小鼠注射8μlp 体重的酮胺-西拉汀溶液, 并通过没有爪子夹紧反射确认深部麻醉, 然后再进入步骤1.3。
- 在 PBS 中新鲜准备 5 mgl 木瓜蛋白酶。慢慢将木瓜蛋白酶溶液的液滴 10Μl (50μg) 输送到鼻孔。小心地监视鼠标, 直到醒来。
- 对实验中包含的所有小鼠重复步骤1.1 和1.2。连续三天执行步骤1.1–1.3。
2. 纯化和荧光标记人外周血 CD4 + t 细胞
请注意:在无菌条件下处理细胞。
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从外周静脉收集18毫升的人血。进行菲科尔-海帕梯度离心, 以选择外周血单个核细胞 (PBMC) 的分数。
请注意:收集和分析主要的人类材料需要得到地方道德当局的批准。只有具有适当医疗资格的人才可以从外周静脉采集血液。- 在乙二胺四乙酸 (EDTA) 中收集血液, 以避免凝血。
可选:使用丰富白细胞的血液捐献的副产品--蓬松的外套血液, 而不是完整的静脉血液。 - 将血液输送到锥形50毫升管中, 并在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中稀释1:2。在稀释后的血液中, 小心加入10毫升的菲科介质 (密度 1.077 G/ml) 作为底层。离心样品 (800 x克, 在室温下 15分钟, 无需刹车)。
- 小心地从离心机中取出管, 并将含有 pbmc 的相间入一个新的锥形 50 mL 管。丢弃上层和底层。用 PBS 和离心机填充含有 pmc 的管 (300 x g , 在4°c 下 10分钟)。取出上清液。
请注意:(可选择), 如有必要, 执行裂解剩余的红细胞。小心地在重新悬浮的细胞颗粒和涡旋样品中加入3毫升的氯化铵-钾 (Acp) 裂解缓冲液 (155 mM 氯化铵; 19 mM 碳酸钾和 0.68 ML EDTA; pH 7.27)。摇摇管子3分钟。要去除 ACP 裂解缓冲液, 请加入40毫升的 PBS 和离心机 (在4°c 下, 300 x g 10分钟)。放弃上清液。
- 在乙二胺四乙酸 (EDTA) 中收集血液, 以避免凝血。
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通过 CD4 微珠纯化 CD4+ t 细胞。
请注意:一般来说, 有几个分配者的磁性微珠纯化人类 CD4+细胞, 这应该会导致细胞纯度的可比水平。产品的选择应根据个人喜好进行。协议的以下步骤 (2.2.2 2.2.7) 将根据定义的 CD4 微珠产品和相应的分离列进行调整, 如材料表中所示。如果选择了替代 CD4 微珠产品, 则可能需要对协议进行一些修改。- 每 10 7bmc 至少将 PBMC 颗粒重新吸收在含有0.5% 的胎牛血清 (FBS) 和 2 mM EDTA (pbsw/Edta-redta) 的至少 80Μl pbs 中。使用约 30 x10 6 pbmc的起始群体, 以结束约 3 x10 6 至 6 x 10 6 纯化的人类 cd4 + t 细胞。
- 每 107 pbmc 加入 20Μl cd4 微珠, 在4°c 下轻轻搅拌20分钟。用 Pbsbsbsseta-缓冲器 (冷却至 4°c) 和离心机 (300 x g,在4°c 下 10分钟) 填充管。去除上清液。
- 将分离柱放入磁场中。用3毫升的 Pbsbsseta-edta-bit-acpedta-bith 冲洗色谱柱。将细胞颗粒在500μl 的 Pbsbsbsedta-edta-capc 中重新悬浮, 并将细胞悬浮液转移到放置在磁场中的冲洗分离柱上。
- 用3毫升的 pbsbsedtat 缓冲液冲洗分离柱三次 (冷却至 4°c), 并丢弃出水。
- 从磁场中取出分离柱, 并将其放入 15 mL 管中。利用柱塞在 5毫升的 Pbsbsbsedta-edta-bactacb 中清除 cd4 + 细胞分数。
- 在试管中加入 PBS 和离心机 (在4°C 下, 300 x g 10分钟)。去除上清液。重复此清洗步骤两次。
- 用标准的选择方法 (例如 Neubauer 室) 确定产生的细胞的数量。
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用荧光细胞增殖染料标记 CD4+ t 细胞。
- 在 PBS 中重新注入 CD4+ t 细胞 (最多10 7 cellss/ml; 不使用小于500ΜL 的 pbs)。
- 在 PBS (根据室温预热) 中制备红色光可激发细胞增殖染料的6μm 溶液 (见材料表)。将该溶液1:2 与前制备的细胞悬浮液和涡流彻底混合 (3μm 最终浓度)。
- 在37°c 下孵化 10分钟 (防光)。之后, 添加5卷含有 10% FBS 的 RPMI 培养基, 并在冰上孵育 5分钟 (免受光线影响)。
- 在含有 10% FBS 的 RPMI 介质中清洗标记细胞三次 (在4°c 时, 以 300 x g 离心 10分钟)。在 PBS 中重新使用标记的单元格, 储存在冰上, 并防止光线照射, 直到使用。
请注意:长时间储存细胞 (和 gt;60 分钟) 可能会对细胞存活产生负面影响。
可选:通过流式细胞仪确定 CD4+细胞分数的纯度和标记过程的有效性。在100μl 的缓冲液中 (pbs 中的 1% fbs, 2mm Edta) 中重新注入 0.5 x10 6至 1 x 10 6 cd4 + 细胞, 并添加抗人类 cd4 抗体, 并添加所选荧光染料。在4°C 下孵化30分钟。加入1毫升缓冲液和离心机 (在4°C 下10分钟内添加 300 x g). 放弃上清液。继续对样品进行流式细胞仪测量 (典型结果如图1 b, c所示)。
3. 采用将人 CD4+ t 细胞转移到丘回书暴露的受体细胞中
请注意:有关体内执行的实验过程的摘要, 请参见图1 a.在最后一次注射木瓜蛋白酶后的一天进行细胞转移。
- 将荧光标记的人类 CD4+ t 细胞的悬浮液 (步骤 2.3.4) 调整为 pbs 中 1 x 10 7细胞的浓度。将细胞悬浮液的100μl 填充到 1 mL/30 g 注射器中。
- 小心地将第一只暴露在纸张上的 C57BL/6J 小鼠 (步骤 1.1–1.3) 放入用于尾静脉注射的约束装置中。使用准备好的注射器 (步骤 3.1) 穿刺尾部静脉, 并慢慢注入含有 1 x 10 6 标记的人类 CD4 + 细胞的细胞悬浮液 100Μl.注射后不要立即拔掉针头, 但要多等 5秒, 以防止细胞悬浮液排出。
- 将鼠标从约束装置中释放, 然后继续进行下一种动物。保留至少一个暴露在纸上的动物, 它不会经过荧光标记的细胞转移, 作为光片荧光显微镜的负控制。
4. 准备肺组织, 用于光片荧光显微镜
请注意:以下步骤是在荧光标记的人体细胞转移3小时后执行的 (步骤 3.2)。所述实验程序, 包括肺组织的采集、固定和溶剂型组织清除, 都是根据目前描述的协议24,28进行调整的。
- 通过吸入二氧化碳 (C02) 来牺牲老鼠。
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用含有 5 mM EDTA 的 PBS 在原位完美地使用肺。
- 通过沿着胸骨切割打开胸部, 露出心脏。用连接在导管上的 21 g 插管刺穿右心室。
- 通过切割打开左心室, 从而允许血液和灌注液排出。慢慢地将含有 5 Mm EDTA 的冷 PBS 的肺部通过导管慢慢灌满。
- 为了进行肺的原位固定, 不要从右心室取出导管。在 PBS 中缓慢灌流2毫升的冷4% 甲醛 (PFA) 肺。取出导管和插管。
请注意:基于 pfa 的肺组织原位固定是一种成熟的技术, 目的是为随后的显微分析 29、30 准备小鼠肺组织。
注意事项:P f a 是有毒的, 必须小心在引擎盖下处理。 -
在原位灌满0.75 琼脂糖。
- 在 PBS 中制备0.75 琼脂糖, 并在热振荡器中保持在50°c 的固体, 直至使用。取下小鼠的唾液腺, 割断胸膜肌, 通过在下面滑动钳子来暴露气管。
- 用 30 G 针刺穿暴露的气管, 用钝器 30 G 导管代替, 以防止气管进一步受损, 导致琼脂糖意外泄漏。使用针架密封插入的导管与气管之间的连接点。
可选:将这里描述的过程与 BAL 集合结合起来, 分析 BAL 中浸润的人体细胞, 如最近在 31 中所述 (有关代表性的结果, 请参见图 2e) 。 - 小心地填充气道0.75 琼脂糖 (冷却到体温) 通过导管, 直到肺完全展开;等到琼脂糖完全凝固。取出导管, 并在充满 4% PFA 的黑暗的 2 mL 管中仔细收获肺。
- 对于额外的固定孵育在 PBS 中求解的 4% PFA 中的样品, 在连续旋转 (31 转/分) 的情况下, 在4°c 下, 在2小时内求解。
- 随后在50°c 的乙醇 (pH 值 9)、70% 乙醇 (ph 值 9) 和100% 乙醇中连续旋转 (31 转/分) 孵育样品, 从而使组织脱水;每个步骤至少4小时。最后, 在新鲜的100% 乙醇中进行4小时的第二次孵育。
- 使用肉桂酸乙酯 (ECi) 对组织进行溶剂型清除。因此, 将样品转移到 ECi 中。在室温下 (在恒定旋转下) 隔夜孵化, 直到组织显示半透明 (代表性图像见图 1d )。
请注意:在室温下 (防止光线) 储存在 ECi 中的样品在几周到几个月内保持稳定。
5. 对小鼠肺叶进行光片荧光显微镜检查
请注意:有关轻质荧光显微镜和相应软件的详细信息, 请参阅材料表, 这些软件是以下列步骤为基础的。但是, 其他制造商的可比较系统也可用于对以下协议进行特定于开发人员的修改。在开始之前, 熟悉显微镜特定的操作手册, 并按照现场负责人的技术说明进行操作。
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设置光片显微镜。
- 打开光板显微镜, 打开计算机上相应的成像软件。用过滤的 ECi (100μm 过滤器) 填充样品室, 并将其放置在激光束之间的位置。
- 使用一小滴有机溶剂稳定的胶水将肺粘在样品支架上。为了使光板所需的穿透深度尽可能小, 请将肺叶垂直。接下来, 将样品支架放置在其腔内。
- 使用 ECi 作为清除试剂时, 将目标的折射率设置为3.5。
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调整光片显微镜的设置, 以检测整个器官背景下的人体细胞。
- 选择所需的激光器 (用于测量的过滤器 > 激活所需激光的复选框), 并在控制软件 (激光传输控制 > 使用滑块来设置激光强度) 中选择适当的强度 >申请)。使用488纳米 (525/过滤器) 的激发波长检测自身荧光肺组织和 640 nm (680/30 过滤器) 来激发在红色光谱中贴有荧光体发射标签的人体细胞。
- 聚焦在 488 nm 激发的样品, 并通过激发波长 640 nm 的 "色度校正" 工具调整焦点 (使用滑块设置色度校正 > 适用)。
- 选择适当的缩放系数;使用低放大倍率概述 (例如, 6.3 x) 来确定标记细胞在肺组织中的总体分布和放大图像 (例如 32x), 以便进行详细定位。
- 选择一个工作表宽度, 统一地阐明整个器官或特定的感兴趣的部分 (光学 > 使用滑块来设置工作表宽度; 通常在20–40% 之间)。定义板状数值孔径 (NA) 与更高的 NA 创建更清晰的图像 (光学 > 使用滑块设置板状na; 对于小鼠肺叶扩展到其生理大小, 通常可以使用0.7% 的 na)。
- 选择要在 "高级测量设置" 下使用的光板数量。在双向照明的情况下, 合并左、右光片以创建均匀照明的图像 (高级 > 合并光片 > 选择混合模式 > 使用滑块来定义两个光片之间的重叠)。
请注意:建议利用样品的双向照明, 每个样品有三个光片。
可选:要进一步提高图像质量, 请使用动态对焦操作。这允许在图像采集过程中向 x 方向移动焦点。 - 定义要测量的 z 堆栈的开始和结束位置, 并将步长设置为 5μm (xyz-table z > 扫描范围)。
请注意:Z 堆栈的开始和结束位置取决于样品室内肺叶的大小和位置。然而, 大约300到 800个 z 堆栈通常是为一个肺叶 (5μm 步长大小) 获得的。 - 使用 "自动保存设置" 保存文件, 并开始测量以捕获图像。完成数据采集后, 在自来水下清洗被 eci 污染的样品支架和室。
请注意:使用相同的设置来想象几个肺裂片, 应该在之后进行比较。
6. 肺积累的人体细胞的后图像处理和定量
请注意:有关用于3D 分析的成像后软件的详细信息, 请参阅材料表, 这些软件是基于以下步骤的。但是, 也可以使用其他成像后软件。
- 加载 z 堆栈的第一个图像 (激活超越按钮、文件 > 打开 > 选择图像), 以启动所选 z 堆栈的所有其他图像的打开及其自动3d 重建。
- 为确保正确显示 x、y 和 z 尺寸, 请检查体素尺寸, 并在必要时对其进行调整 (编辑 > 图像属性 > 手动输入体素大小)。对于 z 的体素尺寸, 请在两个图像之间输入所选的步长 (此处为 5μm)。
- 以不同的颜色显示每个通道 (编辑 > 显示显示调整)。依次单击每个通道以定义所选颜色 (在图 2a、b、c、d 中, 自动荧光信号以灰色显示, 并以红色标记人类 cd4+细胞)。
- 使用通道栏中的三角形或在通道设置中输入精确数字, 调整每个通道的强度、黑色级别和对比度 (编辑 > 显示显示调整)。对于强度调整, 请使用直角三角形。对于黑色级别调整, 使用左三角形, 对于对比度调整, 使用中间三角形。
请注意:使用从没有细胞转移的对照小鼠中获得的肺 (步骤 3.3) 来区分特定的人类细胞信号和非特异性背景。 -
要量化肺组织中标记的细胞, 请在工具栏中使用 "添加新斑点", 并选择 "跳过自动创建, 手动编辑" 以进行手动细胞计数。
注:或者, 使用 "斑点" 下的自动单元格计数工具。但是, 手动计数可以更准确地区分特定信号和非特定信号。- 要比较不同样本中人类细胞的积累情况, 请使用3D 切削刀具 (编辑 > 裁剪 3d) (此处为 813μm x 813μm x 1, 000μm) 定义具有特定体积的肺立方体。
- 要计算累积单元数, 请选择 640 nm 通道, 并定义10μm 的 "半径刻度"。然后, 点击 "编辑", 在指针菜单中检查 "选择", 并通过移动鼠标按钮的移位单击标记每个单元格。查找统计信息中显示的计数单元格的总数。
请注意:强烈建议每个肺叶计数几个立方体 (这里五个), 以确保结果的可靠性, 并补偿计数肺体积的科学依赖选择 (量化策略和代表性的结果描述在图 2D)。
- 使用 "快照" 工具捕获图像, 或使用 "动画" 工具拍摄视频。将调整后的文件另存为. ims 文件(文件 > 导出)。
请注意:出于代表性的目的, 通过检查或取消选中工具栏中的框架来显示或隐藏框架。此外, 将图像显示为最大强度投影 (MIP)(工具栏 > 音量 > 模式 > 检查 MIP) 或使用 "曲面模式" (工具栏 > 添加新曲面)。每个通道都必须分别激活 "表面模式", 以突出组织结构和或细胞体 (典型图像如图 2c 所示)。
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Representative Results
该协议描述了一个实验小鼠模型, 它允许监测和量化通过光片荧光显微镜在肺中通过传递的人 t 淋巴细胞的积累。图 1A提供了实验计划的体内步骤的示意图概述。为了保证可靠的结果, 它是非常重要的, 以确保一个良好的质量的隔离和荧光标记的人类 CD4+ t 细胞, 这将随后转移到小鼠。如图 1b、c所示, 上述微珠基细胞富集和随后的荧光标记程序通常会导致流式细胞检查确定 cd4+ t 细胞纯度 & gt;95%和成功的荧光标记的所有 CD4+ t 细胞。光片荧光显微镜的质量和穿透深度关键取决于适当的组织清除等级。如图 1d 所示, 这里应用的基于 eci 的组织清除协议能够保证高水平的器官透明度, 表明成功的折射率匹配。最后,图 2b、c、d和补充视频以经过充分处理的光片荧光显微镜图像的形式显示了所述实验方案的代表性总体结果。自动荧光信号 (显示为灰色) 为肺的解剖结构成像提供了一个有用的工具。红色信号代表肺积累的人类 CD4+ t 细胞。光片荧光显微镜成像的定量可以确定每个被定义的肺组织区域的肺累积人类 CD4+ t 细胞的总数。图 2e显示了一种量化人体细胞浸润的策略。如图 2f所示, 接受者小鼠 bal 内荧光标记细胞的 (可选) 流式细胞仪检测可用, 可作为补充技术, 以确认采用小鼠的成功组织迁移转移 CD4+ t 细胞。此外, 在本方法所述的实验环境中, 转移的人 T 细胞倾向于在发炎的肺组织中选择性积累, 这进一步支持了人类 CD4+ t 细胞无法在肠道黏膜中被回收的事实如图 2b (右面板) 所示。
图 1: 体内实验工作流程示意图概述.(A) 连续三天 (d0、d0 和 d0) 吸入木瓜蛋白酶 (50μg/2), 引起 C57BL/6J 小鼠过敏性肺部炎症。第二天 (d3), 新分离和荧光标记的人类 CD4+ t 细胞通过尾静脉注射被采用转移到小鼠体内。再过三个小时, 老鼠就被牺牲了, 然后进行了原位灌注和肺固定。最后, 用光片荧光显微镜对肺部进行了解释, 并对其进行了进一步的体外分析。(可选) 在肺解释之前可以收集 BAL, 以便对成功外渗和迁移的人体细胞进行延长的体外分析。(B) 用流式细胞术测定分离 CD4+ t 细胞分数的纯度的代表性直方图。被抗人类 CD4 抗体或同型对照染色的细胞分别显示为黑色和灰色。(C) 代表性直方图, 证实在采用转移之前对人类 cd4+细胞进行荧光标记的有效性。(D) 用 eci 清除前后有缺陷的小鼠肺叶的代表性图像。FI, 荧光强度。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 有代表性的分析人 CD4+细胞在体内肺部炎症的背景下的肺积累.采用密度梯度离心法从外周血中分离出人类 CD4+细胞, 然后采用磁性微珠纯化步骤。人类 CD4+细胞被标记使用一种红色的光可激发细胞增殖染料, 并静脉注射到木瓜暴露的 C57BL/6J 小鼠体内。三个小时后, 选择光片荧光显微镜对小鼠进行采集和进一步分析肺组织。(A) 通过光片荧光显微镜记录的注射标记的人类 CD4 + 细胞 (红色) 3小时后, 对小鼠、纸张暴露的肺组织 (灰色) 进行三维重建的代表性概述。(B) 接收小鼠在细胞转移3小时后的肺组织显示为概述或高放大段 (左面板)。被检索到的人类 CD4+细胞可以可视化为红色信号, 并被描绘为覆盖与肺组织的自体荧光信号或单通道图像。为了确认检测信号的特异性, 在没有静脉细胞转移的情况下控制肺组织作为负控制 (中间面板)。与肺组织不同的是, 在同一受应受者小鼠 (右面板) 的回肠中, 没有检测到贴有标记的人 CD4+细胞 (红色)。(C) 后图像处理允许分析肺组织的单片, 以及生成整个器官段的三维重建, 可以表示为最大强度投影 (mip) 或在表面模式。描绘了具有代表性的图像。(D) 量化战略在图2a 中已经描述的同一个肺中得到了示范。选择了经分析的肺段的定义立方体, 并对每个立方体的人类 CD4+细胞 (红色) 数量进行了量化。随后进行的定量结果 (事件813微米 x813μm x 1, 000 微米立方体) 被表示为平均值±SEM. (e) 作为另一种选择, 流式细胞仪检测在接受者动物的 bal 动物的 bal t 细胞中的荧光标记的人 t 细胞可以为了证实累积的人类 CD4+ t 细胞的成功组织迁移而进行的研究。请点击这里查看此图的较大版本.
补充视频: 代表性视频序列, 显示小鼠肺组织中积累的人类 CD4+细胞。小鼠肺的三维重建显示在注射到尾静脉3小时后的肺组织 (灰色) 上下文中积累的人类 cd4 + 细胞 (红色)。图像在开始时显示为 MIP, 在结束时显示为曲面模式。图像是通过光片荧光显微镜获得的, 并通过成像后软件进行三维分析进行处理。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
这里描述的实验设置提供了一个机会来监测在体内炎症条件下的原代人类免疫细胞的肺归巢能力, 从而相关地补充了经典的体外粘附和趋化。检测。考虑到肺的具体解剖器官特征、免疫细胞归巢的重要方面 (包括目标器官内的趋化和细胞分布) 以及获得的数据的临床相关性和可转移性, 我们采取了三个技术关键特征的优势: (1) 对活小鼠机体内原代人细胞的分析;(2) 纸张介导的肺部炎症诱导;(3) 清肺组织的光片荧光显微镜。
尽管在小鼠体内通过对人类免疫细胞进行的通过转移的功能研究在某些方面可能有限, 但由于小鼠和男性之间在受体-配体相互作用中可能存在相关的不兼容性, 这一总体概念在过去的几十年里, 人性化的小鼠模型已成功地作为翻译医学领域的一个重要实验工具,24, 32,33, 34,35.与传统的动物模型相比, 对人性化小鼠的研究提供了一个优势, 即在体内场景中直接分析患者获得的免疫细胞, 从而识别特定疾病32印迹的功能改变, 36,37。关于人类免疫细胞表面的定义受体与其各自的小鼠配体之间潜在不匹配的相关性, 以前的研究已经表明, 人类 CD4+ t 细胞能够有效地相互作用小鼠粘附分子 MAdCAM-1 和 VCAM-1, 这是整合素介导淋巴细胞归巢的关键配体32。因此, 通过临床使用的α4β7整合素抗体 vedolizumab32在体内成功阻断了通过血管内转移的人的免疫细胞向小鼠肠道组织的迁移。然而, 即使一个特定的受体-配体相互作用的相关性可能显示出完全的人/小鼠不匹配, 它大概是有可能克服这种限制的基因工程, 例如, 转基因过度表达分别为人类配体、生长因子、细胞因子或小鼠机体内受体33,35。
作为慢性炎症对趋化因子局部分泌的重要影响, 粘附分子的内皮表达和随后淋巴细胞的积累已在许多出版物中被描述为 38、39 40、选择合适的肺部炎症实验模型是建立上述方案的关键一步, 可能会根据每项研究的临床背景进行调整。这里选择的纸张引起的过敏性肺炎症的设置代表了一个很好的描述的实验模型, 这是基于局部管理的半胱氨酸蛋白酶木瓜刺激气道上皮和触发随后发布的 alarmins27,41,42。有趣的是, 意外地阐述木瓜蛋白酶是众所周知的导致哮喘的发展, 以及在人类43。根据木瓜蛋白酶的吸入剂量, 暴露在外的小鼠显示出肺27中先天和适应性免疫细胞的积累以及2型细胞因子水平的升高.虽然剂量上升导致气隙扩大 (慢性阻塞性肺病的典型组织学现象) 和血管壁的破坏, 随后出血, 适度的剂量计划与突出的肺嗜酸性粒细胞从而模仿了人类哮喘的一个重要组织学特征由于我们的目的是利用这个实验模型产生一个炎症背景来分析肺免疫细胞归巢, 我们仔细地试图避免纸张引起的血管损伤, 否则可能导致不生理由于内皮完整性紊乱而导致的人体免疫细胞外渗。因此, 我们在上述协议中选择了每只小鼠每天50微克的木瓜蛋白酶的中间剂量。虽然纸张诱导的气道炎症的发展也发生在没有 b 和 t 淋巴细胞, 肺浸润适应性免疫细胞已知对疾病的过程中的 27,42显着显著的影响。例如, 调节 T 细胞可以被确定为纸张诱导的气道嗜酸性粒细胞27的有效调节剂。从角度来看, 肺淋巴细胞在纸张暴露小鼠炎症发病机制中的积极介入表明, 上述方案可能还有助于分析收养转移的功能能力和成功地肺积累的人类免疫细胞来调节肺病理 (例如, 通过流式细胞仪获取 bal 中的嗜酸性计数)。此外, 在血管内转移之前, 额外进行的经鼻内给药的选定的人类趋化因子可能允许分析这些体液介质对不同人类肺归巢过程的影响在体内环境中的免疫细胞群。同样, 可以研究抑制剂对肺归巢过程的影响, 进而对炎症性肺病理的影响。
本文介绍的实验程序的一个特别优点是通过光片荧光显微镜的高端成像质量对肺浸润人体免疫细胞进行精确跟踪和定位。最近的研究已经证明, 光片荧光显微镜技术是一个有价值的实验工具, 分析肠道免疫细胞归巢在翻译 IBD 的研究, 并能够克服的主要局限性常规免疫荧光显微镜和流式细胞术24,32。虽然基于传统显微镜的分析通常被限制在器官的一个非常小的区域, 而且可能不具有代表性, 流式细胞术根本没有考虑组织的方面, 光片荧光显微镜化学清除的组织允许增加穿透深度, 而不会严重失去分辨率, 从而能够3d 重建相当大的器官部分 (高达1.5 厘米 x 1.5 厘米)24,28,44。可以肯定的是, 获得的三维重建的质量和有效性关键取决于组织间隙的性能。在这里描述的设置中, 我们包括了最近发布的基于 eci 的组织清除44的协议的一个稍微采用的版本。与其他成熟的溶剂型组织清除策略26,45, 46 相比, eci 基协议结合了优良的清除性能, 低毒性的优势。试剂和适度时间要求44。由于标准光片荧光显微镜解决肺泡毛细血管等最佳组织结构的能力仍然有限, 即使在最佳的清除条件下也是如此 28, 因此可能难以可靠地区分血管内免疫细胞和已经外渗的免疫细胞之间。在这里描述的协议中增加一个标准的基于荧光的血管染色, 很可能无法完全克服这一限制。因此, 特别关注肺微循环或其副循环中免疫细胞行为的研究可能会优先考虑最近公布的基于2光子的免疫内肺成像方案, 该协议非常优雅显微镜47。在这个实验环境中, 胸腔窗户被植入麻醉和通风的小鼠体内, 通过它可以通过谐振扫描2光子显微镜模块监测稳定的肺, 从而实现整个过程中的高分辨率成像。呼吸周期后保留通气和灌注47,48。该技术已成功地应用于各种研究, 并能够可视化例如肺内血小板生物发生和循环肿瘤细胞的肺入口49,50。然而, 除了对精密仪器设备的要求 (如小鼠通风系统) 和活体动物广泛侵入操作的需要 (胸窗植入术和活体显微镜) 外, 主要的限制因素是这种活肺显微镜系统的是封闭的 z 轴渗透。所进行的肺表面成像只允许分析胸膜下肺组织 47,48的外100μm。根据科学背景, 它可能是一个有价值的选择, 实现2光子显微镜的解释肺作为一个额外的程序到上述协议。首先用 2-光子显微镜分析同一肺, 然后用光片荧光显微镜分析同一肺可能代表一种策略, 以获得人类免疫细胞在小鼠肺内的分布和定位的定量概述 (光片荧光显微镜), 同时, 获得更详细的见解, 细胞或微血管过程 (2 光子显微镜)。事实上, 2 光子显微镜的小鼠气管外植体代表了一个既定的成像工具, 用于分析免疫细胞行为的背景下, 实验诱导的肺炎症 51,52。在我们的实验模型中, 转移的人 t 细胞成功的外渗和肺组织浸润也可以通过检测受者 BAL 中荧光标记的人体细胞来证明, 而不是想象小肺毛细血管的存在和肺组织浸润动物通过流式细胞术, 如图 2e所示。一般来说, 对细胞 BAL 室的分析是描述炎症性呼吸道疾病背景下肺免疫细胞流入的一种既定方法。最后, Galkina 等人 (2005年) 53 描述了另一种流式细胞仪策略, 用于量化肺组织内采用转移的免疫细胞的外渗, 并有可能与这里描述的协议结合。在 Galkina 等人的研究中, 在肺切除前不久一次静脉注射荧光结合抗 CD8 抗体, 就会对肺内转移的 CD8+ t 细胞进行独家和完整的标记血管室, 而已经外渗的 CD8+ t 细胞在肺间质保持未染色。在肺组织体外消化53后, 对体内标记肺免疫细胞进行了流式细胞仪化分析。当然, 组织消化的过程意味着血管内和血管外肺室之间的解剖分离被废除, 因此, 由于抗体泄漏, 间质免疫细胞存在误报的一般风险两个隔间之间。只有在有大量未标记抗体53的情况下进行组织消化, 或者有可能通过光片荧光显微镜取代流式细胞仪分析, 才能将这种风险降至最低, 这使得这种风险成为可能以完全避免组织结构的破坏。
总之, 这里介绍的荧光标记的原发免疫细胞的体内归因组合和随后的光片荧光显微镜能够可靠地识别, 量化和本地化肺积累的人类免疫细胞在肺炎症实验小鼠模型。
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Disclosures
M. f. Neurath 曾担任宾得、朱利亚尼、MSD、Abbvie、Janssen、Takeda 和 Boehringer 的顾问。其余作者没有透露任何冲突。
Acknowledgments
作者感谢 DFG 合作研究中心 SFB 1181 和 TRR 241 的资助。光学成像中心 erlangen (OICE), 特别是 Ralf Palmisano、Philip Tripal 和 Tina Fraaß (DFG CRC 1181 Z2 项目) 被公认为光片荧光显微成像的专家技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 mL, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
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