Her introducerede protokollen tillader karakterisering af primære humane lymfocytter under in vivo betændelsestilstande homing lunge-kapacitet. Pulmonal infiltration af adoptively overførte human immun celler i en musemodel af allergisk betændelse kan afbildet og kvantificeres ved lys-ark Fluorescens mikroskopi af kemisk ryddet lungevæv.
Overvældende væv akkumulering af stærkt aktiverede immunceller repræsenterer et adelsmærke for forskellige kroniske inflammatoriske sygdomme og fremstod som et attraktivt terapeutiske mål i den kliniske behandling af ramte patienter. For at optimere yderligere strategier sigter mod terapeutisk regulering af patologisk ude af balance væv infiltration af pro-inflammatoriske immunceller, vil det være af særlig betydning at opnå bedre indsigt i sygdoms – og orgel-specifikke homing egenskaber af perifere lymfocytter. Den her beskrevne eksperimentel protokol giver mulighed for at overvåge lunge ophobning af fluorescently mærket og adoptively overførte humane lymfocytter i forbindelse med papain-induceret lunge betændelse. I modsætning til standard in vitro-assays ofte anvendes til analyse af immun celle migration og chemotaxis, nu indført in vivo indstillingen tages hensyn lunge-specifikke aspekter af væv organisation og indflydelse af de komplekse inflammatoriske scenario finder sted i den levende murine organisme. Desuden tre-dimensionelle tværsnits lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse giver ikke kun kvantitative data på infiltrerer immunceller, men også skildrer mønster af immun celle lokalisering inden for den betændte lunge. Samlet set er vi kan indføre en innovativ teknik af høj værdi for immunologiske forskning vedrørende Kronisk inflammatorisk lungesygdomme, som let kan anvendes ved at følge den angivne trinvise protokol.
Klassiske inflammatoriske sygdomme i lungerne, såsom allergisk astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er kendt for at være drevet af et øget ansættelse af aktiverede lymfocytter i pulmonal væv1,2. Lymfocyt-udgivet cytokiner (fx, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) yderligere fremme chemotaxis af medfødte og adaptive immunceller, fremkalde fibrotisk luftvejene remodeling eller direkte skader lungerne parenkym2. Hidtil har er de underliggende mekanismer er ansvarlige for patologisk ophobning af lymfocytter i lungevæv endnu ikke fuldt forstået. I analogi med væv-selektiv T celle prægning beskrevet for gut og hud homing, pulmonal dendritiske celler (DCs) er naturligvis stand til prime perifert T-celler til præferentiel lunge infiltration, i det mindste delvist via induktion af CCR4 udtryk på de overfladen af lymfocytter3. Udover CCR4, er luftvejs-infiltrerer T celler også kendetegnet ved en særlig øget ekspression af chemokine receptorer CCR5 og CXCR3 i forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlede, eksisterende data er i overensstemmelse med begrebet at lunge homing af T-lymfocytter fysiologiske eller inflammatoriske betingelser omfatter en række forskellige chemokine receptorer og deres respektive ligander og dermed afhænger en nøje kontrolleret samarbejde mellem medfødte og adaptive immunceller1. Især i den indledende fase af patogen eller allergen eksponering reagerer celler af den medfødte immunsystem TLR stimulation eller IgE-medieret cross-linking af øjeblikkelig løsladelse af forskellige chemoattractants, ligesom LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et mønstereksempel, samspillet mellem PGD2 og chemoattractant receptor CRTh2 er kendt for at være af særlig betydning for chemotaxis Th2 celler og dermed syntes så lovende terapeutiske mål i den kliniske behandling af astma. Faktisk, patienter med moderat astma viste en forbedring af symptomer og en væsentlig forøgelse af den tvungen ekspirationsvolumen i ét sekund (FEV1) efter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist sammenlignet med placebo-gruppen8 ,9. I en mere skred det inflammatoriske respons er allerede ansat T celler i stand til yderligere forstærke pulmonal lymfocyt ophobning via frigivelse af IL-4 og IL-13 som potent stimuli for pulmonal DCs. Efterfølgende er regulere disse myeloid-afledte medfødte celler op-udtryk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-afhængige måde1,10,11. Selv om kompleksiteten af det beskrevne scenario stadig hindrer en komplet forståelse af T celle lunge homing, tilbyder det et væld af molekylære mål for et potentielt optimeret terapeutisk kontrol af inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme. Derfor er der et presserende behov for innovative eksperimentelle teknikker, som er i stand til yderligere at uddybe og supplere vores viden inden for T-celle chemotaxis og lunge målsøgende.
At lunge homing af lymfocytter i den menneskelige krop er påvirket af flere cellulære og humorale fysiske parametre1, er de fleste af de eksisterende eksperimentelle metoder ikke købedygtig model af denne immunologiske proces hele kompleksitet. I stedet, mange standardprotokoller til analyse af lunge homing selektivt fokusere på et specifikt aspekt, der er involveret i kaskade af lymfocyt tiltrækning, vedhæftning, migration og fastholdelse. Ud over en beskrivende bestemmelse af mRNA eller protein udtryk mønster af integriner og chemokine receptorer på perifere eller lunge-infiltrerer lymfocytter og supplerende måling af respektive chemokine niveauet i blodet, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge væv12,13,14,15, veletablerede in vitro celle kultur assays tillade en funktionel karakterisering af lymfocyt vedhæftning eller chemotaxis ved defineret forsøgsbetingelser16,17,18. I princippet overvåge statiske in vitro-vedhæftning assays bindende kapacitet af kulturperler lymfocytter til en endotel éncellelag eller på glas dias belagt med rekombinant endotelial adhæsionsmolekyler (f.eks. MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard in vitro- chemotaxis assays er normalt anvendes til at kvantificere lymfocytter evne til at overføre langs en chemokine forløb i et transwell system19. Både in vitro-indstillinger aktiverer en kontrolleret justering og graduering af forsøgsbetingelser, men på den anden side mangler vigtige variabler kendt til kritisk indvirkning på in vivo chemotaxis og vedhæftning af lymfocytter. Overvejende, statisk celle kultur assays se bort fra indflydelsen fra shear styrker forårsaget af permanent blod flow19 og forsømme potentielt inddragelse af omkringliggende immunologiske milieu og interagerende ikke-lymfocyt immunceller, begge til stede i en levende organisme. For at overvinde disse begrænsninger, fortolkning af resultaterne opnået i statisk in vitro-chemotaxis eller overholdelse af assays skal yderligere validering i dynamisk friktionskoefficient eksperimenter under flow betingelser20,21 og i i vivo modeller af inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk vigtigt kunne drages konklusioner om regulering af T celle lunge homing inflammatoriske eller allergiske betingelser fra dyreforsøg analysere genetisk modificerede mus i definerede modeller af forskellige lungesygdomme3, 22 , 23. de kvantitative sammenligning af lunge infiltrerer lymfocytter mellem vildtype mus og mus med en mangel, for et bestemt gen af interesse udgør en veletableret og bredt anvendte redskab til at definere virkningen af særlige cellular veje eller receptorer på sygdom-drevne mønster af T celle distribution. Men i modsætning til før drøftet in vitro celle kultur assays, en undersøgelse design baseret på klassisk dyremodeller mangler evnen til at analysere og overvåge primære human T-celler direkte afledt af blod eller BAL af patienter, der lider af en inflammatorisk lunge sygdom. Således er er det stadig udfordrende at funktionelt validere om en diagnostisk angivne lungesygdom er købedygtig Kolofon humane lymfocytter til præferentiel lunge tropisme og hvor langt kliniske parametre kan have indflydelse på dette scenario. For nylig har blev en meget elegant in vivo tilgang indført i forbindelse med inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), som var i stand til at overvinde de fleste af disse begrænsninger og åbnet nye muligheder for avanceret translationel undersøgelser på intestinal lymfocyt homing24 . Drage fordel af protokoller for opløsningsmiddel-baserede væv clearing efterfulgt af tværsnits lys-ark Fluorescens mikroskopi som et kraftfuldt værktøj til afbildning, det var muligt at visualisere infiltration og distribution af adoptively overførte human T celler i tarmen af colitic immundefekte mus24. Især denne eksperimentelle indstilling gennemført to vigtigste nyskabelser: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres på eksperimentelt definerede in vivo betingelser; (2) en temmelig stor område af det syge organ (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan være afbildet i høj opløsning kvalitet, efterfulgt af 3D-genopbygning. Desuden etableret flere nyere undersøgelser med succes brug af opløsningsmiddel-baserede væv clearing og lys-ark Fluorescens mikroskopi som vigtige værktøjer til avanceret lunge imaging25,26. For at drage fordel af dette teknologiske fremskridt inden for pulmonal immunologi, vedtog vi nu system til analyse af lunge målsøgende.
Her præsenteres protokollen giver en trinvis Introduktion hvordan til at rense og fluorescently etiket primære menneskelige T celler for overførsel ind i musene med induceret lunge betændelse, og Derudover beskriver i detaljer den efterfølgende proces med lys-ark Fluorescens mikroskopisk billeddannelse, herunder orgel forberedelse og billedbehandling. Samlet set håber vi at støtte fremtidige translationel undersøgelser inden for inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme ved at indføre en sofistikeret, men ikke desto mindre muligt, eksperimentelle model til overvågning af menneskelige lymfocyt lunge homing på in vivo betingelser.
Den her beskrevne eksperimentelle indstilling giver mulighed for at overvåge den homing lungekapacitet primære human immun celler under in vivo betændelsestilstande og dermed relevant supplerer klassisk udføres in vitro-vedhæftning og chemotaxis assays. For at tage hensyn særlige anatomiske orgel Karakteristik af lungen, vigtige aspekter af immun celle homing (herunder chemotaxis og celle fordeling inden for målorgan) samt klinisk relevans og overførsel af erhvervede data, vi tog ford…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne parlamentsarbejdet, finansiering af DFG Collaborative Research Centre SFB 1181 og TRR 241. Optisk Imaging Center Erlangen (OICE) og i særlige Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (projekt Z2 af DFG CRC 1181) er anerkendt for teknisk ekspertbistand til lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |