De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.
Overweldigend weefsel accumulatie van zeer geactiveerde immune cellen vertegenwoordigt van een kenmerk van verschillende chronische ontstekingsziekten en naar voren gekomen als een aantrekkelijke therapeutisch doel in de klinische behandeling van de betrokken patiënten. Om strategieën die gericht zijn op therapeutische regulering van pathologisch onevenwichtige weefsel infiltratie van pro-inflammatoire immune cellen verder te optimaliseren, zal het van bijzonder belang voor het bereiken van betere inzichten in de ziekte – en orgel-specifieke homing eigenschappen van perifere lymfocyten. Het hier beschreven experimentele protocol kunt controleren Long accumulatie van fluorescently geëtiketteerde en adoptively overgedragen menselijke lymfocyten in het kader van papaïne-geïnduceerde pulmonaire ontsteking. In tegenstelling tot de standaard in-vitrotests vaak gebruikt bij de analyse van immuun cel migratie en chemotaxis, de nu geïntroduceerde in vivo instelling rekening wordt gehouden met Long-specifieke aspecten van weefsel organisatie en de invloed van de inflammatoire complex scenario plaatsvinden in de lymfkliertest levend organisme. Bovendien, driedimensionale transversale licht vel fluorescentie microscopische beeldvorming voorziet niet alleen kwantitatieve gegevens over infiltreren immune cellen, maar ook ziet u het patroon van immuun cel localisatie binnen de ontstoken Long. We kunnen over het algemeen om een innovatieve techniek van grote waarde voor immunologische onderzoek op het gebied van chronische inflammatoire longziekten, die gemakkelijk kunnen worden toegepast door het volgen van het verstrekte stapsgewijze protocol.
Klassieke inflammatoire aandoeningen van de longen, zoals allergische astma en chronische obstructieve longziekte (COPD), zijn bekend om te worden aangedreven door een toegenomen rekrutering van geactiveerde lymfocyten in het Long weefsel1,2. Lymfocyt-vrijgegeven cytokines (b.v., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-gamma en TNF-α) chemotaxis van aangeboren en aanpassings immune cellen verder te bevorderen, veroorzaken fibrotische airway remodelleren of direct beschadigen de longen parenchym2. Tot nu toe zijn de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de pathologische accumulatie van lymfocyten in longweefsel nog niet volledig begrepen. In analogie met weefsel-selectieve T cel inprenting beschreven voor gut en huid homing, pulmonale dendritische cellen (DC’s) kunnen uiteraard prime perifere T-cellen voor preferentiële Long infiltratie, ten minste gedeeltelijk via de inductie van CCR4 expressie op de oppervlak van lymfocyten3. Naast CCR4, worden luchtweg-infiltreren T-cellen ook gekenmerkt door een bijzonder verhoogde expressie van de chemokine receptoren CCR5- en CXCR3 in vergelijking met de T-cellen in het perifere bloed1,4,5. Algemene, bestaande gegevens in overeenstemming zijn met het idee dat Long homing van T lymfocyten onder fysiologische of inflammatoire voorwaarden een aantal verschillende chemokine receptoren en hun respectieve liganden omvat en cruciaal dus hangt een nauw samenwerking tussen aangeboren en aanpassings immune cellen1gecontroleerd. Vooral tijdens de eerste fase van pathogenen of allergeen blootstelling reageren cellen van het aangeboren immuunsysteem TLR stimulatie of IgE-bemiddelde cross-linking door de onmiddellijke vrijlating van verschillende chemoattractants, zoals LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 en PGD21,6,7. Als een schoolvoorbeeld, de interactie tussen PGD2 en de chemoattractant receptor CRTh2 is bekend om zijn van bijzonder belang voor chemotaxis Th2 cellen en zodoende verschenen zo veelbelovend therapeutisch doel in de klinische behandeling van astma. Inderdaad, patiënten met matige astma bleek een verbetering van de symptomen en een aanzienlijke stijging van het geforceerde expiratoire volume in één seconde (FEV1) na de behandeling met een selectieve antagonist van de CRTh2 ten opzichte van de placebo groep8 ,9. In een meer gevorderde staat van de inflammatoire respons kunnen reeds aangeworven T cellen pulmonaire lymfocyt accumulatie via de release van de IL-4 en IL-13 als krachtige prikkels voor pulmonaire DCs verder te versterken. Vervolgens reguleren deze myeloïde afkomstige aangeboren cellen up-de uitdrukking van CCL17 en CCL22 in een STAT6-afhankelijke wijze1,10,11. Hoewel de complexiteit van het beschreven scenario nog een compleet begrip van de T cel Long homing belemmert, biedt het een overvloed aan moleculaire targets voor een potentieel geoptimaliseerde therapeutische controle van inflammatoire of allergische longziekten. Daarom is er een dringende behoefte aan innoverende experimentele technieken, die kunnen verder verdiepen en onze kennis op het gebied van de T cel chemotaxis en longkanker homing aan te vullen.
Wijten aan het feit dat de Long homing van lymfocyten in het menselijk lichaam wordt beïnvloed door meerdere cellulaire en humorale fysieke parameters1, kunnen allermeest naar de bestaande experimentele methoden niet de gehele complexiteit van deze immunologische proces model. In plaats daarvan, vele standaardprotocollen voor de analyse van Long homing selectief richten op een specifiek aspect betrokken in de opeenvolging van lymfocyt aantrekken, hechting, migratie en behouden. Naast een zuiver beschrijvende bepaling van het mRNA of eiwit-expressiepatroon van verschijnsel en chemokinereceptoren op perifere of Long-infiltreren lymfocyten en de aanvullende meting voor respectieve chemokine levels in bloed, bronchoalveolar lavage (BAL) of pulmonaire weefsel12,13,14,15, gevestigde in vitro cel cultuur assays toestaan een functionele karakterisering van lymfocyt hechting of chemotaxis gedefinieerd op experimentele omstandigheden16,17,18. In principe controleren statische hechting van in vitro testen de bindingscapaciteit van gekweekte lymfocyten een endothelial enkelgelaagde of glas dia’s bedekt met recombinant endothelial celadhesie-moleculen (bijv. MAdCAM-1, VCAM-1), terwijl de standaard in-vitro chemotaxis tests worden gewoonlijk toegepast om het vermogen van lymfocyten te migreren langs een chemokine verloop in een transwell systeem19kwantificeren. Zowel in vitro instellingen inschakelen een gecontroleerde aanpassing en modulatie van de experimentele omstandigheden, maar aan de andere kant geen belangrijke variabelen bekend aan kritisch gevolgen voor in vivo chemotaxis en hechting van lymfocyten. Voornamelijk statische cel cultuur testen negeren de invloed van shear krachten veroorzaakt door de permanente bloed stroom19 en de betrokkenheid van de omliggende immunologische milieu en interactie niet-lymfocyt immune cellen, potentieel te verwaarlozen beiden aanwezig in een levend organisme. Om deze beperkingen te overwinnen, de interpretatie van de resultaten verkregen in statische in-vitrotests voor chemotaxis of naleving moeten verdere validatie in dynamische wrijvingscoëfficiënt experimenten onder stroom voorwaarden20,21 en met in vivo modellen van inflammatoire orgel pathologie19. Inderdaad, belangrijke conclusies over de regulering van de T cel Long homing bij inflammatoire of allergische konden worden getrokken uit dierstudies analyseren genetisch gemodificeerde muizen in gedefinieerde modellen voor verschillende longziekten3, 22 , 23. kwantitatieve vergelijking van longkanker infiltreren lymfocyten tussen wildtype muizen en muizen met een tekort voor een specifiek gen van belang een gevestigde en in het algemeen gebruikte instrument is voor het bepalen van het effect van bijzondere cellulaire trajecten of receptoren van het ziekte-gedreven patroon van T cel distributie. Echter, in tegenstelling tot voordat besproken in vitro cel cultuur testen, een ontwerp van de studie op basis van klassieke diermodellen ontbreekt de mogelijkheid om analyseren en controleren van primaire menselijke T cellen rechtstreeks afgeleid van het bloed of de BAL van patiënten met een inflammatoire Long ziekte. Dus, het is nog steeds uitdagende functioneel valideren of een diagnostisch opgegeven longziekte vermag Impressum menselijke lymfocyten voor preferentiële Long tropisme en hoe ver klinische parameters kunnen van invloed zijn op dit scenario. Onlangs, een zeer elegante in vivo benadering werd geïntroduceerd in het kader van inflammatoire darmziekten (IBD), die was in staat om de meeste van deze beperkingen te overwinnen en opende nieuwe wegen voor geavanceerde translationeel onderzoek naar intestinale lymfocyt homing24 . Profiteren van protocollen voor op basis van oplosmiddel weefsel clearing gevolgd door transversale licht vel fluorescentie microscopie als een krachtige imaging tool, bleek het mogelijk om te visualiseren de infiltratie en de distributie van adoptively overgedragen menselijke T cellen in de darm van colitic immunodeficiëntie muizen24. In het bijzonder, deze experimentele instelling twee belangrijkste innovaties uitgevoerd: (1) primaire menselijke immune cellen kunnen worden geanalyseerd onder experimenteel gedefinieerde omstandigheden in een in vivo; (2) een eerder groot gebied van de zieke orgel (ongeveer 1,5 x 1,5 cm) kan worden beeld in hoge resolutie kwaliteit, gevolgd door 3D-reconstructie. Bovendien vastgesteld verscheidene recente studies met succes het gebruik van op basis van oplosmiddel weefsel clearing en licht vel fluorescentie microscopie als belangrijke instrumenten voor geavanceerde Long imaging25,26. Om te kunnen profiteren van deze technologische vooruitgang op het gebied van pulmonaire immunologie, we nu het systeem voor de analyse van longkanker homing aangenomen.
Het hier gepresenteerde protocol bestaat uit een stapsgewijze inleiding hoe te zuiveren en fluorescently label primaire menselijke T cellen voor overdracht in muizen met geïnduceerde pulmonaire ontsteking en, bovendien, beschrijft in detail het daaropvolgende proces van licht-blad fluorescentie microscopische beeldvorming, met inbegrip van de voorbereiding van het orgel en de beeldverwerking. Wij hopen over het geheel genomen ter ondersteuning van toekomstige translationeel studies op het gebied van inflammatoire of allergische longziekten door de invoering van een verfijnd, maar toch haalbaar, experimenteel model voor het toezicht op menselijke lymfocyt Long homing op omstandigheden in vivo.
De hier beschreven experimentele instelling biedt de mogelijkheid om te controleren de homing longcapaciteit van primaire menselijke immune cellen onder omstandigheden van in vivo inflammatoire en daardoor relevantly aanvulling klassiek uitgevoerd in vitro hechting en chemotaxis testen. Om te houden met de kenmerken van de specifieke anatomische orgel van de longen, belangrijke aspecten van immuun cel homing (inclusief chemotaxis en cel distributie binnen de doelgroep orgel) evenals de klinis…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen dankbaar financiering door de DFG Collaborative Research centra SFB 1181 en TRR 241. De optische Imaging centrum Erlangen (OICE) en in bepaalde Ralf Palmisano, Philipp Tripal en Tina Fraaß (Project Z2 van de DFG CRC-1181) worden erkend voor deskundige technische ondersteuning voor de microscopische beeldvorming licht vel fluorescentie.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |