ここで導入されたプロトコルでは、体内の炎症性条件の下で主要な人間のリンパ球のホーミング肺活量の評価をことができます。アレルギー性炎症のマウス モデルの転送に対して人間の免疫細胞の肺の浸潤をイメージし、化学的にクリアされた肺組織の光シート蛍光顕微鏡による定量化できます。
高活性の免疫細胞の組織蓄積を圧倒的な様々 な慢性炎症性疾患の特徴を表し、影響を受ける患者の臨床管理に魅力的な治療上のターゲットとして浮上しました。プロ炎症性免疫細胞の病理組織学的不均衡な組織浸潤の治療の規制を目指す戦略をさらに最適化するためには、病・臓器別に改良された洞察力を達成するために特に重要なこと末梢血リンパ球のホーミングのプロパティです。ここで説明されている実験的なプロトコルは、パパイン誘発肺炎症のコンテキストで蛍光に分類された、本人間のリンパ球の肺蓄積を監視できます。免疫細胞の移動と走化性の分析のために頻繁に使用される標準試験管内アッセイと対照をなして今導入された生体内の設定を組織のアカウント肺固有の側面と炎症性のコンプレックスの影響考慮します。シナリオ生物マウスで行われています。さらに、三次元断面光シート蛍光顕微鏡イメージングは免疫細胞の浸潤にだけ定量的なデータを提供しませんが、また炎症を起こした肺内免疫細胞局在化のパターンを示しています。全体的に、提供されているステップバイ ステップのプロトコルに従うことによって簡単に適用することができます慢性炎症性肺疾患における免疫学的研究価値の高い革新的な技術を導入することが。
肺、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患 (COPD) などの古典的な炎症性疾患、肺組織1,2に活性化リンパ球の増加の採用によって駆動されるよく知られています。サイトカインはリンパ球リリース (例えば、IL 4、IL-5、IL 9、IL-13、IFN-γ、TNF-α) 自然免疫と適応免疫細胞の走化性を促進、線維症の気道リモデリング誘導や肺実質2の直接損害します。これまでのところ、肺組織内のリンパ球の病理学的蓄積のための責任の根本的なメカニズムはまだよくわかっていません。肺樹状細胞 (Dc) は明らかに首相の CCR4 発現誘導を介して少なくとも部分的の優遇肺癌浸潤の末梢 T 細胞にすることができる T 細胞の組織選択的刷り込み腸と皮膚ホーミングへの類似で、リンパ球3の表面。CCR4 は、以外にも気道浸潤 T 細胞も CCR5 と末梢血1,4,5内 T 細胞に比べて CXCR3 ケモカイン受容体の発現が特に増加によって特徴付けられます。全体的に、既存のデータが肺生理学的または炎症性条件の下で T リンパ球のホーミングが異なるケモカイン受容体とのそれぞれの配位子の数を含む、従って重大決まる概念と一貫性のある、密接に自然免疫と適応免疫細胞1間のコラボレーションを制御します。特に、病原体や抗原暴露の初期段階では、生得の免疫組織の細胞応答 TLR 刺激、LTB4CCL1、CCL17 のような異なる塩基の即時釈放によって架橋 igeCCL22、CCL20、CXCL10 PGD21,6,7。主な例として PGD2と走化性因子受容体の相互作用 CRTh2 は Th2 細胞の走化性にとって特に重要なが知られている、従って喘息の臨床管理に、有望な治療上のターゲットが登場します。確かに、中等度の喘息患者を示し, 症状の改善治療後 1 秒 (fev 社1) 強制呼気量の大幅な増加 CRTh2 の選択的拮抗薬プラセボ グループの8 と比較して、9。炎症反応のより進行した状態で既に採用の T 細胞が il-4, IL 13 のリリースを介して肺の Dc の強力な刺激としての肺リンパ球蓄積をさらに増幅することができます。その後、これらの骨髄由来の生得的な細胞を調整 STAT6 依存の方法1,10、11CCL17 ・ CCL22 式。 説明したシナリオの複雑さはまだホーミング T 細胞肺の完全な理解を妨げているが、炎症やアレルギー性の肺疾患の可能性があります最適治療制御の分子標的の茄多を提供しています。そのため、緊急の必要性を深めるおよび T 細胞走化性と肺ホーミングの分野で我々 の知識を補完することができる革新的な実験があります。
肺、人体内のリンパ球のホーミングは複数の細胞、体液性および物理的なパラメーター1によって影響を受け、という事実のために、既存の実験手法のほとんどはこの免疫学的プロセスの全体の複雑さをモデル化することがありません。代わりに、ホーミングが選択的に肺の解析の多くの標準的なプロトコルはリンパ球の魅力、接着、移行および保持のカスケードに関連する特定の側面に焦点を当てます。純粋に記述決定周辺機器または肺に浸潤リンパ球のインテグリンとケモカイン受容体の mRNA やタンパク質の発現パターンとそれぞれケモカイン、血中レベルの相補的な測定のほか気管支肺胞洗浄 (BAL) または肺組織12,13,14,15、老舗の in vitro における細胞培養の試金によりリンパ球の接着や走化性の機能解析実験条件16,17,18を定義します。原則として、静的体外付着の試金監視培養リンパ球内皮細胞の単層または組換え内皮細胞接着分子 (例えば、MAdCAM 1、VCAM 1) でコーティングされたガラスの結合容量標準体外走化性アッセイは、transwell システム19のケモカイン勾配に沿って移行するリンパ球の機能を定量化するために通常適用されます。体外の両方の設定は制御調整と実験条件の変調を有効にするが、一方で批判的に体内の走化性とリンパ球の接着に影響する知られている重要な変数がないです。主に、静的な細胞培養の試金は恒久的な血流19によりせん断力の影響を無視し、可能性のある周囲の免疫環境と相互作用する非リンパ球免疫細胞の関与を無視両方の生きている有機体の存在。これらの制限を克服するために静的なインビトロ走化性または付着試験で取得した結果の解釈に必要なさらにフロー条件20,21の下での動的付着実験で検証炎症性器官病理学19の生体モデル。確かに、T 細胞肺の炎症やアレルギー性の条件の下でホーミングの規制に関する結論動物の研究から重要な遺伝子分析変更異なる肺疾患3、に定義されたモデルのマウス22,23. 興味の特定の遺伝子が特定の細胞の影響を定義するためよく確立され、広く使用されているツールを表すため欠損マウスと野生型マウスのリンパ球の浸潤肺の定量的比較経路や T 細胞分布の病気の駆動パターン上の受容体。しかし、対照的に培養細胞培養の試金を議論する前に古典的な動物モデルに基づく研究デザインを欠いている分析し、主なヒト T 細胞血液または炎症性肺を患っている患者のバルから直接派生を監視する能力病気。したがって、それはまだ機能的診断によって指定された肺疾患が優遇肺トロピズムと臨床パラメーター可能性がありますこのシナリオに影響を与えるどの程度までの人間のリンパ球をインプリントすることができるかどうかを検証する挑戦的なままです。最近では、非常にエレガントな生体内でのアプローチは、これらの制限のほとんどを克服することができたし、腸管リンパ球ホーミング24 トランスレーショナル研究の新時代が開かれた炎症性腸疾患 (IBD) のコンテキストで導入されました。.強力なイメージング ツールとして断面光シート蛍光顕微鏡に続いて溶媒基づく組織クリアするためのプロトコルを活かし、浸潤に対して転送ヒト T 細胞の分布を視覚化する可能だった24合併免疫不全マウスの腸。特に、この実験の設定は 2 つの主要な技術革新を実装: 実験的定義の生体内での条件の下で (1) 主な人間の免疫細胞を分析できます(2) 病気にかかった器官の幾分大きい区域 (約 1.5 cm × 1.5 cm) の高画質、3 D 再構築が続くイメージを作成することができます。また、いくつかの最近の研究は、正常に肺癌25,26をイメージングのための重要なツールとしてオフ溶剤系組織と光シート蛍光顕微鏡の使用を設立しました。肺の免疫学の分野でこの技術の進歩から利益のために我々 は今肺ホーミングの分析システムを採用しました。
浄化する方法と蛍光ラベル プライマリ ヒト T 細胞の肺炎症を誘導したマウスに転送するためと、また、光シートの後続のプロセスの詳細に説明します、ここで提示されたプロトコルが紹介の手順蛍光顕微鏡イメージング、器官の準備、画像処理など。全体的に、洗練された、生体内での条件の時にリンパ肺ホーミングを監視するためそれにもかかわらず可能、実験的モデルを導入することによって炎症やアレルギー性の肺疾患の分野で将来の橋渡し研究を支援していきます。
ここで説明されている実験の設定提供古典的な体内の炎症性条件およびそれにより適切補完したプライマリ人間免疫細胞のホーミング肺活量を監視する機会を実行体外密着性と走化性試金。肺のアカウント特定の解剖学的な臓器特性を考慮に、臨床的意義および集録したデータの譲渡 (標的臓器内の走化性、細胞の分布) を含むホーミング免疫細胞の重要な側面を撮りま?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、DFG 共同研究センター SFB 1181 TRR 241 で感謝します。光学イメージング センター エルランゲン (入居) と特定のラルフ パルミサーノ ・ フィリップ ・ Tripal ・ ティナ Fraaß (DFG CRC 1181 のプロジェクト Z2) 光シート蛍光顕微鏡イメージングのエキスパート技術サポートのために認めています。
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |