여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.
매우 활성화 된 면역 세포의 조직 축적 압도적인 다양 한 만성 염증 성 질환의 특징을 대표 하 고 영향을 받는 환자의 임상 관리에 매력적인 치료 대상으로 등장. 프로-염증 성 면역 세포의 병 적 불균형 조직 침투의 치료 규제를 목표로 하는 전략을 더욱 최적화 하기 위해서는 그것은 향상 된 통찰력으로 질병 및 기관 관련을 달성 하기 위해 특별 한 중요성의 될 것입니다. 주변 세포의 속성을 추적 합니다. 여기 설명된 실험 프로토콜 papain 유도 폐 염증의 맥락에 놓여있는지 레이블 및 adoptively 전송 인간 림프 톨의 폐 축적을 모니터링할 수 있습니다. 면역 세포 이동과 chemotaxis 분석을 위해 자주 사용 표준 생체 외 분석 실험, 달리 지금 소개 vivo에서 설정 계정 폐 관련 조직 조직 및 복잡 한 염증의 영향으로 걸립니다. 시나리오 murine 생명체에서 일어나입니다. 또한, 3 차원 횡단면 빛 시트 형광 현미경 이미징만 양적 데이터, 면역 세포를 침투에 제공 하지 않습니다 하지만 또한 염증이 폐 내에서 면역 세포 지역화의 패턴을 보여 줍니다. 전반적으로, 우리는 제공 된 단계별 프로토콜에 따라 쉽게 적용 될 수 있는 만성 염증 성 폐 질환의 분야에서 면역학 연구에 대 한 높은 값의 혁신적인 기술을 소개 수 있습니다.
알레르기 천식 등 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐의 고전적인 염증 성 질환으로 폐 조직1,2활성화 된 림프 톨의 증가 채용에 의해 구동 잘 알려져 있습니다. 림프 구 출시 cytokines (예를 들어, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-9, IL-13, TNF-α와 IFN-γ) 더 타고 난 및 적응형 면역 세포의 chemotaxis를 홍보, 거리 기도 개장을 유도 하거나 직접 폐 실질2손상. 지금까지, 폐 조직 내에서 세포의 병 적인 축적에 대 한 책임 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지. 조직 선택적 T 세포 각 인 그리고 피부 본질적인 유도 대 한 설명에 비유, 폐 모 수석 세포 (DCs)는 분명히에 적어도 분할 CCR4 식의 유도 통해 우선 폐 침투에 대 한 주변 T 세포를 수는 림프 톨3의 표면입니다. CCR4, 외 기도 침투 T 세포는 CCR5와 CXCR3 주변 혈액1,,45내의 T 세포에 비해 chemokine 수용 체의 증가 특히 식 또한 특징. 전반적으로, 기존 데이터 폐 유도 생리 또는 염증 성 조건에서 T 세포의 다른 chemokine 수용 체와 그들의 각각 ligands의 수를 포함 하 고 따라서 결정적으로 의존 개념와 일치 하는 밀접 하 게 타고 난 및 적응형 면역 세포1간의 협업을 제어. 특히, 병원 체 또는 알레르기에 노출의 초기 단계, 타고 난 면역 계통의 세포 응답 TLR 자극 또는 LTB4, CCL1, CCL17, 같은 다른 chemoattractants의 즉각적인 석방 cross-linking IgE 중재 PGD, CXCL10, CCL20, CCL2221,,67. 대표적인 사례로 PGD2 와 chemoattractant 수용 체 간의 상호 작용 CRTh2 Th2 세포의 chemotaxis에 대 한 특정 중요성의 것으로 알려져 있다 하 고 따라서 나타났다 천식의 임상 관리에 유망 치료 대상. 실제로, 온건한 천식 환자 증상의 개선 및 치료 후 1 초 (FEV1)에서 강제로 내쉬는 숨의 볼륨의 상당한 증가와 보여주었다 위약 그룹8 에 비해 선택적 CRTh2 길 항 9. 염증 반응의 더 진행된 상태에서 이미 채용된 T 세포 폐 림프 구 축적 발표를 통해 IL-4, IL-13의 강력한 자극으로 폐 Dc에 대 한 증폭 수 있습니다. 그 후, 이러한 골수성 파생 된 타고 난 셀 최대-규제 STAT6 종속 방식으로1,,1011CCL17 및 CCL22의 표현. 있지만 설명된 시나리오의 복잡성은 여전히 귀환 T 세포 폐의 완전 한 이해를 방해, 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 잠재적으로 최적화 된 치료 제어를 위한 분자 대상의 과다를 제공 합니다. 따라서, 기술의 혁신적인 실험, 더 깊게 T 셀 chemotaxis 및 폐 유도의 분야에서 우리의 지식을 보완 하는 긴급 한 필요가 있다.
사실은 폐 유도 인체 내에서 세포의 여러 세포, 체액 및 물리적 매개 변수1에 의해 영향을 받습니다, 대부분 기존 실험 방법의 면역학 프로세스의 전체 복잡성을 모델링 할 수 없습니다. 대신, 림프 구 매력, 접착, 마이그레이션 및 보존 캐스케이드에 관련 된 특정 측면에 초점을 선택적으로 귀환 하는 폐의 분석에 대 한 많은 표준 프로토콜. 주변 또는 폐에 침투 림프 톨에 integrins 및 chemokine 수용 체의 mRNA 나 단백질 식 패턴의 혈액, 각각 chemokine 수준 보완 측정의 순전히 설명 결정 외 bronchoalveolar 게 (발) 또는 폐 조직12,13,,1415, 잘 설립 체 외 세포 문화 분석 허용 림프 구 접착 또는 chemotaxis의 기능 특성 따라 실험 조건16,,1718정의. 원칙적으로, 정적 생체 접착 분석 표준 생체 외에서 하는 동안 교양된 세포는 내 피 단층 또는 재조합 형 내 피 접착 분자 (MAdCAM-1, VCAM-1), 코팅 유리 슬라이드의 바인딩 용량 모니터링 chemotaxis 분석 실험 수 세포의 chemokine 그라데이션 transwell 시스템19에 따라 마이그레이션할 계량 하기 위해 일반적으로 적용 됩니다. 둘 다 생체 외에서 설정을 제어 조정 및 실험 조건, 변조 있지만 비판적 vivo에서 chemotaxis와 세포의 접착에 미치는 영향에 알려진 중요 한 변수를 다른 한편으로 부족. 정적 셀 문화 분석 실험19 영구 혈액 흐름 의해 발생 하는 전단 세력의 영향을 무시 하 고 잠재적으로 면역 주변 환경 및 비 림프 구 면역 세포 상호 작용의 개입을 무시 하는 주로, 둘 다 살아있는 유기 체에. 이러한 한계를 극복 하기 위해 정적 생체 외에서 또는 준수 chemotaxis 분석 실험에서 얻은 결과의 해석 추가 동적 접착 실험 흐름 조건20,21 에서 고에 유효성 검사에 필요한 염증 성 장기 병 리19의 vivo 모델. 실제로, 중요 한 동물 연구에서 T 세포 폐 염증 또는 알레르기 성 조건 하에서 귀환의 규제에 관한 결론을 얻을 수 수 유전자 분석 수정 다른 폐 질환3, 의 정의 된 모델에서 마우스 22 , 23. 대 한 관심의 특정 유전자 나타냅니다 특정 세포의 영향을 정의 하기 위한 확고 하 고 광범위 하 게 사용 도구 wildtype 쥐와 쥐 결핍과 세포를 침투 하는 폐의 양적 비교 경로 또는 T 세포 분포의 질병 제어 패턴에 수용 체. 그러나, 달리 생체 외 세포 문화 분석, 논의 하기 전에 클래식 동물 모델에 따라 연구 설계 능력이 없다 분석 하 고 기본 인간 T 세포 혈액 또는 염증 성 폐에서 고통 받는 환자의 발에서 직접 파생 된 모니터링 질병입니다. 따라서, 그것은 여전히 기능 진단 지정 된 폐 질환은 우선 폐 차 있는 굴곡 운동 그리고 얼마나 멀리 임상 매개 변수 영향을 줄 수이 시나리오에 대 한 인간의 세포 간 기 수를 확인 하기 위해 도전 남아 있습니다. 최근, 매우 우아한 vivo에서 접근 대부분의 이러한 한계를 극복할 수 있었던 고 창 자 림프 톨 귀환24에 고급 변환 연구를 위한 새로운도 열 선 동적인 장 질병 (IBD)의 맥락에서 소개 되었다 . 용 매 기반 조직 비운 뒤에 강력한 이미징 도구로 횡단면 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 프로토콜을 이용 침투 및 adoptively 전송된 인간 T 세포의 분포를 시각화 가능 했다 colitic immunodeficient 마우스24의 소장. 특히,이 실험 설정 두 가지 주요 혁신 구현: 실험적으로 정의 된 vivo에서 조건; (1) 기본 인간의 면역 세포를 분석할 수 있습니다 (2) 병에 걸리는 기관의 오히려 큰 영역 (약 1.5 c m x 1.5 c m) 고해상도 품질, 3D 개조 뒤에 몇 군데 있습니다. 또한, 여러 최근 연구 성공적으로 설립 용 매 기반 조직 삭제 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 고급 폐25,26이미징에 대 한 중요 한 도구. 폐 면역학의 분야에서이 기술 진보에서 혜택, 우리는 지금 폐 유도의 분석을 위한 시스템을 채택 했다.
여기 제시 프로토콜 정화 방법과 붙일 레이블에 기본 인간 T 세포 유도 폐 염증와 쥐에 전송에 대 한, 또한, 빛 시트의 후속 과정 자세히 설명 단계별 소개를 제공 합니다. 기관 준비 및 이미지 처리를 포함 하 여 형광 현미경 이미지입니다. 전반적으로, 정교한 모니터링 vivo에서 조건에 따라 인간 림프 구 폐 유도 역시 가능한, 실험 모델만 도입 하 여 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 분야에서 미래의 변환 연구를 지원 하기 위해 노력 하겠습니다.
여기 설명된 실험 설정 제공 고전적인 vivo에서 염증 성 조건 및 그로 인하여 relevantly 보완 기본 인간의 면역 세포의 유도 폐 용량을 모니터링 하는 기회가 chemotaxis를 수행 하는 생체 접착 분석 실험입니다. 폐의 계정 특정 해부학 기관 특성 고려, 임상 관련성 및 수집 된 데이터의 양도 (를 포함 하 여 대상 기관 안에 chemotaxis 및 셀 유통) 귀환 하는 면역 세포의 중요 한 측면 우?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 기꺼이 DFG 공동 연구 센터 SFB 1181 TRR 241에 의해 자금을 인정 합니다. 광학 이미징 센터 에를랑겐 (OICE) 특정 랄 프 사노, 필립 Tripal, 티 나 Fraaß (DFG CRC 1181의 프로젝트 Z2) 빛 시트 형광 현미경 이미징에 대 한 전문 기술 지원에 대 한 인정.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |