Здесь представлен протокол позволяет характеристика самонаведения емкости легких первичного человека лимфоцитов в естественных условиях воспалительные условиях. Легких инфильтрации восприимчивую передаваемых человека иммунокомпетентных клеток в мышиной модели аллергические воспаления может образы и количественно микроскопии флуоресцирования свет лист химически очищенной легочной ткани.
Подавляющее ткани накопление высоко активации иммунных клеток представляет отличительной чертой различных хронических воспалительных заболеваний и стала привлекательным терапевтического клинического управления пострадавших пациентов. Для дальнейшей оптимизации стратегии, направленные на терапевтические регулирования инфильтрации патологически несбалансированным ткани про воспалительных иммунных клеток, он будет иметь особое значение для достижения улучшения идеи в конкретных заболеваний и органа самонаведения свойства периферических лимфоцитах. Здесь описаны экспериментальный протокол позволяет отслеживать накопление легкого дневно обозначенные и восприимчивую передаются лимфоцитах человека в контексте папаин индуцированной воспаления легких. В отличие от стандартных анализов в пробирке часто используется для анализа миграции иммунных клеток и хемотаксис параметр теперь введено в естественных условиях учитывает легких специфические аспекты организации ткани и влияние комплекса воспалительных сценарий, происходящие в живом организме мышиных. Кроме того микроскопических изображений трехмерных поперечного сечения флуоресценции свет лист не только представить количественные данные о проникают в клетки иммунной системы, но также изображает шаблон локализации иммунных клеток в воспаление легких. В целом мы в состоянии внедрить инновационные техники высокого значения для иммунологических исследований в области хронических воспалительных легочных заболеваний, которые могут быть легко применены следуя предоставленного шаг за шагом протокол.
Классический воспалительные заболевания легких, такие как аллергическая астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хорошо известны управляться путем увеличения найма активированных лимфоцитов в легочной ткани1,2. Лимфоцит выпущена цитокинов (например, Ил-4, Ил-5, IL-9, IL-13, ИФН γ и TNF-α) далее содействовать хемотаксис врожденного и адаптивного иммунных клеток, побудить фиброзных сократимость реконструкции или непосредственно повреждения паренхимы легких2. До настоящего времени основные механизмы, ответственные за патологического накопления лимфоцитов в легочной ткани еще не понял полностью. По аналогии с импринтинг ткани селективный Т-клеток, описанные для кожи и кишки самонаведения, легочной дендритных клеток (DCs) способны очевидно премьер периферийные клетки T для проникновения преференциальных легких, по крайней мере частично через индукции CCR4 выражение на поверхности лимфоцитов3. Помимо CCR4 проникают в дыхательные пути Т-клетки характеризуются особенно увеличение выражение хемокиновых рецепторов CCR5 и CXCR3, по сравнению с Т-клеток в периферической крови1,4,5. В целом, существующих данных в соответствии с концепцией легких самонаведения Т-лимфоцитов при физиологических или воспалительные условиях предполагает целый ряд различных хемокиновых рецепторов и их соответствующих лигандов и таким образом в решающей степени зависит тесно контроль взаимодействия между врожденного и адаптивного иммунные клетки1. Особенно на начальном этапе патогена или аллерген воздействия клетки иммунной системы отвечают стимуляции TLR или IgE опосредованной cross-linking немедленного освобождения различные chemoattractants, как LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 и ПГД2в1,6,7. Как яркий пример взаимодействие между ПГД2 и хемотаксического рецептора CRTh2 как известно, имеют особое значение для хемотаксис Th2 клетки и таким образом появилась как многообещающие терапевтические цели в клиническому ведению астмы. Действительно у пациентов с умеренной астмы показали улучшение симптомов и значительное увеличение объема принудительного выдоха в одну секунду (ОФВ1) после лечения с селективный антагонист CRTh2, по сравнению с группой плацебо8 ,9. В состоянии более продвинулись воспалительной реакции уже набранных Т-клетки способны далее усиливать легочной лимфоцитов накопления через выпуск Ил-4 и IL-13 как мощные стимулы для легких DCs. Впоследствии эти врожденной клетки миелоидного производный вверх регулируют выражение CCL17 и CCL22 в STAT6-зависимых образом1,10,11. Хотя сложность описан сценарий по-прежнему препятствует полное понимание Т-клеток легких самонаведения, он предлагает множество молекулярных целей для элемента потенциально оптимизированный лечебный воспалительным или аллергическим легочных заболеваний. Таким образом существует настоятельная необходимость новаторских экспериментальных методов, которые способны далее углублять и дополнить наши знания в области хемотаксис Т-клеток и легких самонаведения.
С тем, что легких самонаведения лимфоцитов в организме человека влияют несколько сотовых, гуморальный и физических параметров1, большинство существующих экспериментальных методов не способны модели всю сложность этой иммунологические процесса. Вместо этого многие стандартные протоколы анализа легких самонаведения выборочно сосредоточиться на конкретном аспекте участвующих в каскад лимфоцитов притяжения, адгезии, миграция и удержание. Помимо чисто описательного определения мРНК белка или выражению интегринов и хемокиновых рецепторов на лимфоцитах периферической или проникают в легких и дополнительные измерения соответствующих хемокиновых уровней в крови, Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) или легочной ткани12,13,14,15, установившаяся в пробирке клеток культуры анализы позволяют функциональная характеристика лимфоцитов адгезию и хемотаксис После определенных экспериментальных условиях16,17,18. В принципе статические в пробирке адгезии анализов контролировать связывающая способность культурной лимфоциты эндотелиальной монослоя или стеклянных скольжениях покрытые рекомбинантным эндотелиальной адгезии молекулы (например, MAdCAM-1, VCAM-1), то время как стандарт в пробирке хемотаксис анализов обычно применяются для того, чтобы количественно оценить способность лимфоцитов мигрируют вдоль хемокиновых градиент в системе transwell19. Оба в пробирке параметры позволяют контролируемых перестройки и модуляции экспериментальных условиях, но с другой стороны отсутствуют важные переменные, известный критически воздействия на в-vivo хемотаксис и адгезии лимфоцитов. Преимущественно статические клетки культуры игнорировать влияние сдвига, вызванных постоянным крови поток19 и потенциально пренебрегать участия окружающих иммунологические окружение и взаимодействующих-лимфоцит иммунных клеток, Оба представляют в живом организме. Для того, чтобы преодолеть эти ограничения, интерпретацию результатов, приобретенных в статических в пробирке хемотаксис или присоединение анализы требуют дальнейшего проверки в динамических адгезии экспериментов под поток условий20,21 и в в VIVO модели воспалительных орган патологии19. Действительно важные выводы о регулировании Т-клеток легких самонаведения воспалительным или аллергическим условиях от животных исследования анализа генетически изменены мышей в определенных моделей различных легочных заболеваний3, 22 , 23. количественные сравнения легких, проникнув лимфоцитов между wildtype мышей и мышей с дефицитом для конкретных генов интерес представляет устоявшихся и широко используемый инструмент для определения воздействия конкретных сотовых пути или рецепторов на болезнь управляемый характер распределения Т-клеток. Однако в отличие от к до обсуждения в пробирке клеток культуры анализов, Дизайн исследования, основанные на классических моделях животных не хватает возможности для анализа и мониторинга первичных человеческих клеток T непосредственно вытекает из крови или бал пациентов, страдающих от воспалительных легких болезни. Таким образом она по-прежнему остается сложным функционально проверить ли диагностически указанного легкое заболевание способна запечатлеть лимфоцитах человека для преференциального легких тропизма и насколько клинические параметры могут повлиять на этот сценарий. Недавно очень элегантный подход в естественных условиях была введена в контексте воспалительные заболевания кишечника (IBD), который был в состоянии преодолеть большую часть этих ограничений и открыла новые возможности для передовых исследований трансляционного на кишечные лимфоцитов самонаведения24 . Воспользовавшись протоколов для очистки ткани на основе растворителя, следуют поперечного сечения свет лист флуоресцентной микроскопии как мощный инструмент визуализации, можно было визуализировать проникновения и распространения восприимчивую передаваемых человеческих клеток T в кишечнике colitic иммунодефицитных мышей24. В частности, этот экспериментальный параметр реализованы две главные нововведения: (1) основного человеческого иммунные клетки могут быть проанализированы в экспериментально определенных условиях в естественных условиях; (2) довольно большой площади больного органа (около 1,5 х 1,5 см) может отражаться в высоким разрешением качества, следуют 3D-реконструкции. Кроме того некоторые недавние исследования успешно установлено использование ткани на основе растворителя очистки и микроскопии флуоресцирования свет лист как важные инструменты для передовых легких изображений25,26. Для того, чтобы выгоду от этого технологического прогресса в области легких иммунологии, мы сейчас приняли системы для анализа легких самонаведения.
Здесь представлены протокол предусматривает поэтапное введение как для очистки и дневно этикетке первичной человека T клетки для передачи в мышей с индуцированного легочного воспаления и, Кроме того, подробно описывает процесс последующего света-листа флуоресценции микроскопических изображений, включая подготовку орган и обработки изображений. В целом мы надеемся на поддержку будущих трансляционного исследования в области воспалительным или аллергическим легочных заболеваний путем введения сложных, но тем не менее возможно, Экспериментальная модель для мониторинга самонаведения легких человека лимфоцитов на условиях, в естественных условиях.
Здесь описаны экспериментальной установки обеспечивает возможность контролировать самонаведения емкости легких первичных человеческих иммунных клеток при воспалительных процессов в естественных условиях и таким образом уместно дополняет классическом исполнении в…
The authors have nothing to disclose.
Авторы с благодарностью признаем, финансирование DFG совместных научно-исследовательских центров SFB 1181 и TRR 241. Оптических изображений центра Эрлангена (ОНИС) и в частности Ральф Палмисано, Филипп Tripal и Тина Fraaß (проект Z2 DFG CRC 1181) признал экспертов техническую поддержку для света лист флуоресценции микроскопических изображений.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |