Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы проиллюстрировать использование мыши неонатальной cardiomyocytes как модель системы для изучения, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в самом сердце.
Abstract
Митохондрии и окислительного метаболизма являются критическими для поддержания функции сердечной мышцы. Исследования показали, что митохондриальной дисфункции является важным фактором для нарушения функции сердца, в сердечной недостаточности. Контрастом восстановление дефектных митохондриальной функции может иметь благоприятные последствия для улучшения сердечной функции, в противном случае сердце. Таким образом изучая механизмы регулирования и выявления роман регуляторы для функции митохондрий может обеспечить понимание, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических целей для лечения болезни сердца. Здесь сердечной myocyte митохондриальное дыхание анализируется с использованием системы культуры уникальный клеток. Во-первых протокол был оптимизирован для быстро изолировать и культура высокой жизнеспособности новорожденного мыши кардиомиоцитов. Затем анализатор внеклеточного поток 96-луночных формат используется для оценки норма расхода кислорода этих кардиомиоцитов. Для этого протокола мы оптимизирована посева условий и продемонстрировал, что темпы потребления кислорода кардиомиоцитов неонатальной мыши можно легко оценивать внеклеточного потока анализатора. Наконец мы отмечаем, что наш протокол может быть применен к большим размером культуры и другие исследования, такие как внутриклеточной сигнализации и сократительной функции анализа.
Introduction
Для поддержания непрерывной сократительной функции сердца, кардиомиоцитов должны поддерживать постоянную поставку клеточной энергии в виде АТФ1. В самом центре около 95% АТФ генерируется митохондрий, главным образом через окислительное фосфорилирование, показаны, что митохондрии играть решающую роль биоэнергетический в сердечной функции2,3. Поддерживая это понятие, что dysregulation митохондриальной функции может привести к сердечной недостаточности и кардиомиопатия4,5. И наоборот, восстановление функции митохондрий было показано для улучшения сердечной функции неисправного сердце6,7. Таким образом изучая механизм митохондриальной биоэнергетики и выявления роман регуляторы митохондриальной функции в cardiomyocytes будет не только выявить механистический идеи производства сердечной энергии, но также может обеспечить понимание того, что приведет для развития новых терапевтических целей для лечения заболеваний сердца6,8.
По сравнению с всем сердцем, который содержит смесь миоцитов и не миоцитах9, cardiomyocyte культур очень чистый, с минимальным загрязнением не миоцитах от сердца, таких как фибробластов и эндотелиальных клеток10. Кроме того изоляция кардиомиоцитов из новорожденных щенков позволяет культивирование большое количество клеток в небольшом количестве времени, по сравнению с переключательным клетки от взрослых сердец10,11. Самое главное культивированный взрослых мыши кардиомиоцитов имеют короткие выживания раз (например, 24 ч) и на длительное время точек де продифференцируйте. Cardiomyocytes новорожденных мыши может выжить и манипулировать для свыше 7 дней в культуре, что делает их идеальными для тестирования воздействия наркотиков соединений и генные манипуляции на функцию митохондрий в cardiomyocytes10. Конечно Существуют значительные биологические различия между клетками взрослых и новорожденных, но дольше продолжительность культуре клеток новорожденных делает их подходящими для различных типов исследований, в том числе митохондриальной функции.
На сегодняшний день основной культурный новорожденных крыс и мышей кардиомиоцитов используются в качестве модели для изучения сердца Биоэнергетика12,13. В последние годы исследования используется анализатор внеклеточного потока для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и оценки окислительного потенциала в мышь и крыса неонатальной кардиомиоцитов14,15. Хотя по сравнению с крысами, жизнеспособность клеток новорожденных кардиомиоцитов мыши ниже и имеет большую изменчивость16. Кроме того возможность изучать клетки генетически модифицированные мыши модели делает ячеечная модель мыши очень важно. Учитывая, что OCR исследования настолько чувствительны к ячейке количество и плотность посева, необходима разработка воспроизводимых, надежной и простой протокол для достижения последовательного клеток урожайность и жизнеспособности.
Здесь мы приводим оптимизированный протокол, который был разработан, который использует культивировали мыши неонатальной кардиомиоцитов наряду с 96-хорошо формат внеклеточного потока анализатор для анализа OCR. Этот протокол значительно увеличивает воспроизводимость анализа. Кроме того протокол не только обеспечивает Роман и воспроизводимый метод для анализа OCR, но также могут быть адаптированы к культуре большего размера для других экспериментальных целей, например, которые могут быть необходимы для изучения миофибрилл функций и внутриклеточной сигнальные пути.
В частности этот протокол описывает один день процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов неонатальной мыши в пластине культуры 96-луночных клеток. Кроме того он описывает процедуру для измерения потребления кислорода с помощью анализатора внеклеточного потока. Все решения, используемые в стерильную или стерильной фильтрации. Все инструменты стерилизуются, 75% этанола. Мы предоставляем Таблицу материалов для различных частей процедуры. Для культивирования кардиомиоцитов, все процедуры и шаги выполняются в капюшоне культуры стандартной ячейки. Этот протокол разработан для изоляции сердца новорожденных мыши из одного помета (примерно 8-10 щенков). Однако протокол также может быть адаптирована для изоляции кардиомиоцитов из нескольких пометов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для работы с новорожденных мышей пожалуйста, обратитесь к набору руководящих принципов местного университета/института вперед программами ухода за животными и придерживаться своих институциональных и других соответствующих правил. Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены UC Сан-Диего институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC) и придерживаться правил федеральных и государственных.
1. Подготовка реагентов
- Подготовка 25 мл раствора предварительно пищеварения: HBSS (без Ca2 + и Mg2 +) дополнены трипсина (0.5 мг/мл). Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте предварительный пищеварение решение в день эксперимента.
Примечание: Очень важно использовать HBSS без Ca2 + и Mg2 +, как Ca2 + и Mg2 + вызовет сокращение myocyte и последующие клеточной гибели во время изоляции. - Подготовка 30 мл коллагеназы пищеварениебуфера: коллагеназа (0,8 мг/мл, примерно 350 ед/мл) растворяют в HBSS (без Ca2 + и Mg2 +) буфера. Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте коллагеназы пищеварение решение в день эксперимента.
- Подготовка 500 мл cardiomyocyte культуры массовой информации (рост): Mix DMEM 375 мл, 125 мл M-199, 25 мл сыворотки лошади и 12,5 мл FBS. Дополнение с 1% пенициллина и стрептомицина 1% раствор.
- Подготовка среднего митохондриальной стресс-тест: сделать 200 мл DMEM на основе среднего стресс-тест (DMEM без NaHCO3, см. Таблицу материалы) дополнены пируват натрия 1 мм, 2 мм L-глютамином и глюкоза 10 мм и 2 мм Hepes.
Примечание: Сделайте 1 Л с DMEM среды без пируват натрия, L-глютамин, глюкозы и Hepes, фильтром стерильные и хранить в 4 ° C. Подготовка среднего стресс-тест в день assay путем добавления других реагентов. С помощью DMEM среднего без NaHCO3 имеет решающее значение. - Отрегулируйте пэ-аш митохондриальной стресс-тест СМИ до 7,4 в день использования. Теплый СМИ до 37 ° C перед использованием.
- Подготовка oligomycin: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
- Подготовка FCCP: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
- Подготовка antimycin A: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
- Подготовить ротенон: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
Примечание: В таблице 1перечислены все реагенты и решения, используемые в настоящем Протоколе.
2. Заготовка и предварительно пищеварение сердец от новорожденных мышей (1 день)
- Автоклав ножницы, щипцы и ложкой Мории стерилизовать.
- Выполните все шаги в капот культуры клеток для бесплодия.
- Аликвота 5 мл HBSS (без Ca2 +, мг2 +) для каждой скважины 6-ну клетки культуры плиты; место на льду. Аликвота 10 мл HBSS в блюдо культуры клеток 10 см.
- Подготовка 20 мл раствора предварительно Пищеварение трипсина в 50 мл стерильного Конические трубки. Держите все решения на льду.
- Быстро окуните новорожденных (день 0) мышах в 70% этанола раствор для стерилизации.
- Обезглавить щенков, используя стерильные ножницы (прямой) без наркоза, а затем открыть сундук вдоль грудины, чтобы разрешить доступ к грудной полости и сердце. (Рис. 1A)
Примечание: 1) очень важно использовать P0 новорожденных мышей для достижения жизнеспособности высокой клеток. 2) Этот метод эвтаназия разрешена для новорожденных в соответствии с руководящими принципами низ и американской ветеринарной медицинской ассоциации 17. - Извлечение сердца из тела с тонкой ножницы и передачи непосредственно в стерильных клетки культуры блюдо, содержащие HBSS (без Ca2 +, мг2 +) (рис. 1B).
- Удалите любые остаточные легочной ткани, более крупных судов и т.д. (и атриумов, при необходимости). Помыть сердца в HBSS решения с помощью нежный агитации.
- 8 нарезать каждое сердце с тонкой ножницы и передавать все ткани сердца с щипцами в одну скважину 6-ну клетки культуры плиты с HBSS (Рисунок 1 c и 1 D).
- Помыть сердца путем передачи сердца от скважины в пластину 6-хорошо наполненный HBSS, используя ложку Мории (рис. 1 d).
Примечание: Передача сердца от скважины является достаточно промыть крови. Поскольку кровь вмешивается ферментативного пищеварения важно помыть сердца с HBSS и удалить кровь. - Передача сердца ложкой Мориа в коническую пробирку, содержащую 20 мл трипсина (0.5 мг/мл) и инкубировать с нежным агитации на 4° C для 4 h (Рисунок 1E).
3. Подготовьте тарелку 96-луночных культуры (день 1)
- Подготовить 5 мл раствора покрытие: PBS, содержащие желатин (автоклав перед использованием) 0,5% и 1% раствор фибронектин. (например, 5 мл раствора желатина плюс 50 мкл раствора фибронектин)
- Раствор для нанесения покрытия в каждой скважине пластину культуры клеток 96-луночных аликвота 50 мкл (см. Таблицу материалы). Если присутствуют пузырьки, удалите их с помощью пипетки 20 мкл сосать пузыри вне.
Примечание: Важно охватить все площади поверхности каждой скважины с раствор для нанесения покрытия. - Инкубируйте пластину в инкубатор культуры клеток 37 ° C за 1 ч или больше, чтобы позволить сушки покрытия матрицы.
- Аспирационная любое решение остаточного покрытия перед посевом кардиомиоцитов.
4. ферментативный пищеварения и обшивка клеток (1 день)
- Предварительно теплой коллагеназы пищеварение раствор в ванну воды 37 ° C.
Примечание: Этот шаг является важным для достижения эффективной ферментативного пищеварения. - Переместите конические трубка, содержащая сердца и предварительно пищеварение решение от 4 ° C капот культуры клеток. (Рисунок 1F)
- Пусть сердца опускаться на дно трубки и удалить предварительно пищеварение решение с помощью Пипетки серологические 10 мл (1-2 мл среды изоляции может оставаться в трубе).
- Добавьте 10 мл HBSS в трубу. Вновь приостановить сердца с HBSS 2 - 3 раза промыть трипсина, используя Серологические Пипетки 10 мл. Аспирационная HBSS (1-2 мл может оставаться в трубе).
- Добавьте 10 мл раствора подогретым коллагеназы пищеварение в пробирку с сердечками. (Рис. 1 g)
- Инкубировать трубки с сердечками на водяной бане 10 минут без агитации 37 ° C (1 пищеварение).
- После 1-й пищеварение переместите трубку на капот культуры клеток. Аккуратно нарезанных сердца путем повторного приостановления сердца внутри трубки, нежно 10 раз с помощью Пипетки серологические 10 мл. Это позволит клетки выйдет из ткани сердца и сердца разойтись. (Рис. 1 H)
Примечание: Так как кардиомиоцитов хрупки, нежный Тритурация имеет важное значение для достижения высокой жизнеспособности. - Пусть непереваренных ткани раковина, передачи переваривается раствор обогащенный кардиомиоцитов (примерно 9-10 мл) для новой Конические трубки и сразу же добавить равное количество клеток культуры СМИ прекратить коллагеназы пищеварение.
- Добавьте 10 мл раствора коллагеназы пищеварение в пробирку, содержащую оставшиеся непереваренных сердечной ткани.
- Инкубировать трубку с ткани сердца в водяной бане 10 минут 37 ° C (2-й пищеварение).
- Повторите процедуру 4.7 и 4.8.
Примечание: Если есть еще много непереваренных ткани, повторите пищеварение еще один раз. Однако в большинстве случаев, две пищеварения являются достаточно, чтобы разогнать большинства клеток из ткани сердца. - Место стерильным клеток сито (100 мкм нейлоновая сетка) в новый стерильный 50 мл Конические трубки. Предварительно Влажные клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации и передайте клетки через клетки ситечко. Промойте клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации. (Рисунок 1I)
- Центрифуга конические трубка, содержащая кардиомиоцитов за 5 мин при 180 x g (Рисунок 1J). Аспирационная супернатант (рис. 1 K), который будет содержать клетки ткани мусор и вновь приостановить Пелле клеток в 10 мл СМИ культуры клеток (рис. 1 Л).
- Нежно ресуспензируйте клетки и клетки пластины на культуры клеток 10 см блюдо (пластик без любой тип покрытия) и инкубировать 1 час в инкубатор культуры клеток (1 предварительного покрытия) (рис. 1 M). Этот шаг перед покрытием позволяет non кардиомиоцитов, например фибробластов и эндотелиальных клеток, придерживаться блюдо немелованной культуры клеток.
Примечание: На данный момент кардиомиоцитов обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. (Рисунок 1N). - После инкубации 1 h аккуратно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо и вновь приостановить клетки, неоднократно закупорить клетки культуры среднего за блюдо с помощью Пипетки серологические 10 мл. Затем не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) перехода в новое блюдо культуры клеток 10 см (пластик без каких-либо покрытия) и проинкубируйте еще 1 ч в инкубатор культуры клеток (2 предварительного покрытия).
Примечание: Клетки, которые придают пластину-покрытием являются преимущественно не кардиомиоцитов: фибробластов и эндотелиальных клеток, которые могут быть визуализированы под микроскопом (Рисунок 1O). - После 2 Предварительная обшивка, осторожно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо, а затем перевести кардиомиоцитов в новой 50 мл Конические трубки.
5. Подсчет клеток и гальванических клеток в культуре плиту 96-луночных клеток (1 день)
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
- Пластина клетки в 96-луночных клетки культуры пластины внеклеточного матрикса покрытием на плотности между 10-30 x 103 клеток/колодец с помощью многоканальных дозаторов в окончательном объеме 200 мкл (рис. 1 P). Использование скважин А1, A12, H1 и H12 для фона: 200 мкл питательной среды как другие скважины в этих скважинах (без клетки). Инкубируйте пластины в инкубатор культуры клеток 37 ° C.
Примечание: В этом исследовании потребление кислорода был протестирован с помощью различных клеток плотности или 10 x 103, 20 x 103, 30 x 103 клеток/хорошо. (Рис. 2A). Кроме того, как указано выше кардиомиоцитов сразу после изоляции обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. В течение 16-24 ч культуры будет расплющить жизнеспособных клеток.
6. кислорода Assay потребления с помощью анализатора внеклеточного Flux 96-хорошо формат (день 2)
Примечание: Пробирного потребление кислорода может осуществляться через один день после покрытия клетки или более поздней версии. Неонатальный кардиомиоцитов культивированный используя этот протокол может продержаться до 7 дней пост изоляции.
- Гидрат картридж датчик анализатор потока (см. Таблицу материалы) для по крайней мере 3 часа, но в идеале на полный рабочий день, до assay. Добавить 200 мкл раствора Calibrant (см. Таблицу материалы) в каждой скважины пластину Утилита, поместить датчик картридж обратно на пластину утилита и инкубировать в инкубаторе 37 ° C без CO2 или O2 добавок.
- Изменить ячейки культуры средств массовой информации на митохондрии стресс тест средний один час до assay. Cardiomyocytes являются хрупкими. Таким образом аккуратно извлеките носитель культуры клеток с помощью многоканальных дозаторов и вымыть клетки с 200 мкл подогретым митохондриальной стресс-тест СМИ дважды. После второй мыть 175 мкл подогретым митохондрий стресс тест СМИ и культура клетки в инкубаторе 37 ° C без CO2 или O2 добавок.
- Подготовьте концентрированной испытаний соединений. Для стресс-теста митохондрий Подготовьте 3,0 мл 16 мкм oligomycin, 9 мкм FCCP и смесь из 20 мкм ротенон и 20 мкм antimycin A, все в среде митохондриальной стресс-тест.
Примечание: Каждое соединение на концентрации, в описанный был протестирован. Однако необходима титрования концентрации каждого соединения в собственной лаборатории. - Загрузите 25 мкл каждого соединения в порты инжектор датчик картриджа с помощью многоканальных дозаторов (Рисунок 1 квартал). Объем и конечная концентрация, описаны в таблице 2.
- Настройте протокол assay внеклеточного потока. Программа описана в Таблица 3.
- Запустите программу. Во-первых Вставьте картридж датчик в машину для калибровки (Рисунок 1R). Замените calibrant на пластину пробирного после калибровки шаг делается.
Примечание: С помощью программного обеспечения, предоставленного изготовителем, указывают группы скважин и каждое соединение и порт. - При желании, после анализа, тщательно удалить все пробирного среднего с помощью многоканальных дозаторов и хранить микроплиты культуры клеток при-20 ° C для нормализации будущих клеток, используя assay протеина.
- Измерить содержание белка. Добавьте 50 мкл стандартного раствора лизис клетки RIPA (см. Таблицу материалы). Инкубируйте пластину на льду на 30 минут, чтобы полностью Лизируйте клетки. Передать все материалы нового ясно плоская 96 хорошо пробирного днище.
- Измерить концентрацию белка BCA пробирного согласно протоколу от производителя.
Примечание: Покрытие также с внеклеточного матрикса приводит к высоким содержанием белка концентрацию в каждой скважине. Таким образом вычтите количество фон well(s) (без клетки) чтобы получить фактические ячейки концентрацию белка. Концентрация белка, полученные из клеток низка в плиту 96-луночных культуры. Кроме того концентрация белка может варьироваться от скважины из-за покрытия внеклеточного матрикса. Таким образом предлагается использование мобильный номер для нормализации OCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью протокола описаны, сердца были изолированы от день 0 новорожденных щенков. 5 x 105 клеток/щенка были получены, и кардиомиоцитов были осеменены на плотности 10 x 103, 20 x 103или 30 x 103 клеток/Ну, в 96 хорошо пластины (рис. 2A). После ночи культуры, были найдены кардиомиоцитов хорошо прилагаемый к поверхности покрытые пластиковые и там было очень мало неприсоединенной клетки (неприсоединенной клетки будут по-прежнему появляются как круглый и блестящий, по сравнению с здоровым, прилагаемый клеток, которые spreadout) () Рисунок 2A и B). На данный момент спонтанно Договаривающихся кардиомиоцитов были хорошо видны. Высева плотность 30 x 103 клеток/скважины показали слияния один день после посева как клетки распространяются. Как число круглых клеток (мертвый) были очень низкими, эти результаты показали, что протокол дает высокий клеток жизнеспособности кардиомиоцитов. Cardiomyocytes были immunostained с антитело против саркомерных α-актинина, конкретных маркер cardiomyocyte18 как доказательство этого заявления. Как показано на рис. 2 c, большинство клеток показали положительный пятнать α-актинина показаны высокой чистоты cardiomyocyte изоляции.
Схема один типичный митохондриальной стресс-теста показан на рисунке 3. Митохондриальной стресс-тест начинается с базового измерения скорости потребления кислорода (OCR). Это сопровождается инъекций oligomycin, который препятствует АТФазы. Разница до и после oligomycin инъекции показывает OCR связано с производства АТФ. Затем для измерения кислорода максимальный расход вводили расцеплять агент FCCP. Запасные дыхательных возможностей может быть рассчитана как разница между базальной и максимальной OCR. Наконец с введения двух сложных Ингибиторы переноса электронов (antimycin A и ротенон), митохондриальное дыхание полностью останавливается, и оптического распознавания текста снижается до самого низкого уровня. Блокируя митохондриальной активности, на этом уровне, потребление кислорода не митохондрий. Базальные дыхания, Протон утечки и максимальной дыхания может быть рассчитана как разница между не митохондриальное дыхание (OCR в присутствии antimycin A и ротенон) и базовые измерения, OCR в присутствии oligomycin и OCR в наличие FCCP, соответственно.
В этом исследовании был проведен анализ OCR, с использованием системы анализатор формат 96-луночных внеклеточного потока один день после изоляции клеток. Кроме того чтобы проверить действие сыворотки голода на OCR, три часа до assay, СМИ культуры клеток были изменены на регулярные клетки культуры выращивания с сывороткой, или без сыворотки. После запуска распознавания данных измерений 1 до 12 для каждого хорошо, были экспортированы в электронную таблицу для учета и дальнейшего анализа. Метаболические характеристики были определены следующим образом:
Non митохондриальное дыхание = средняя OCR (10, 11, 12)
Базальные дыхания = средняя OCR (1, 2, 3)-средний OCR (10, 11, 12)
Производство СПС = средняя OCR (1, 2, 3)-средний OCR (4, 5, 6)
Протон утечки = средняя OCR (4, 5, 6) - средний OCR (10, 11, 12)
Максимальная дыхания = средняя OCR (7, 8, 9) - средний OCR (10, 11, 12)
Как показано на рисунке 4A, распознавание значения легко были проанализированы, и последствия введенного соединений также были очевидны. Важно отметить, что вариации из скважины была небольшой, как показано в стандартной ошибки. Увеличение в камере номер привело к увеличению базовых измерений, Oligomycin и FCCP-лечение дыхания. По сравнению с клеток сыворотки голодали, OCR был выше в клетках, проанализированы, которые были инкубировали с роста средств массовой информации. Как показано на рисунке 4В, OCR показано как базальную дыхания, Протон утечки (Oligo) и максимальной дыхания (FCCP) за 1 х 104 клетки. OCR на 10 x 103 клеток была выше в посевной плотность 20 K и 30 K клеток/Ну чем 10 K клеток/хорошо. Как показано на рисунке 4 cвыразить OCR по отношению к базальной дыхания, относительная OCR Протон утечки (Oligo) и максимального (FCCP) показывают одинаковые значения между роста средств массовой информации и сыворотки голодали групп. Эти результаты показывают, что плотность посева не влияет на относительную Протон утечки и максимальной окислительного потенциала.
В целом используя этот протокол, отличные урожаи неонатальной кардиомиоцитов мыши были успешно изолированные и культивировали. OCR можно оценить с помощью этих миоцитов в анализаторе внеклеточного потока. Результаты также показывают, что плотность посева существенно не влияет OCR, рассчитанные по номеру ячейки. Тем не менее короткий срок (3 h) сыворотки голодания уменьшается OCR. Информация полезна для тестирования мыши новорожденных кардиомиоцитов OCR с различных экспериментальных условиях.
Рисунок 1: изоляции и культуры неонатальной кардиомиоцитов от новорожденных мышей день 0. Умерщвлены новорожденных (A), и сердце рассекается от грудной клетки. (B) сердца промывают в HBSS (без Ca2 +, мг2 +). (C) каждое сердце разрезать на 8 частей. (D) сердца, перемещаются в 6-ну пластины, наполненный HBSS. Сердца моют с помощью ложки Мории перенести их из скважины. (E) сердца предварительно перевариваются в трипсин-HBSS при 4 ° C с нежным агитации. (F) Predigested сердце ткани после 4 ч инкубации при 4 ° C. (G) сердце тканей после переваривания коллагеназы 10 мин. (H) коллагеназы переваривается сердца, которую тканей являются порошкового. (я) изолированный кардиомиоцитов были фильтруют через стрейнер ячейки. (J) кардиомиоцитов гранулированных центрифугированием. (K) коллагеназы и культуры СМИ удаляются путем аспирации. (L) кардиомиоцитов вновь приостановлено в свежей питательной среды. (M) кардиомиоцитов культивировали в 10 см пластиковые блюдо для предварительного покрытия. (N) A представитель изображение кардиомиоцитов (круглый и блестящий клетки) после 1 час до обшивки. (O) после предварительного покрытия и затем удаление не сторонник кардиомиоцитов, оставаясь клетки, которые обычно фибробластов и эндотелиальных клеток являются видимыми. (P) покрытие кардиомиоцитов в 96-луночных плиту. (Q) Загрузка реагентов в порты инъекции датчик картриджа. (R) класть датчик картридж в машину анализатор внеклеточного потока. Шкалы бар = 0.1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Культура кардиомиоцитов табличке внеклеточного потока анализатор 96-луночных. (A) представитель образы кардиомиоцитов в 96-луночных пластины с плотностью указанной ячейке, сразу после посева (верхняя строка) или 18 h пост посева (нижний ряд). (B) выше, увеличение изображения кардиомиоцитов 18 h поста высев на плотность клеток 10 x 103 клеток/хорошо. (C) кардиомиоцитов окрашивали антитела анти саркомерных α-актинина (зеленый) и DAPI (как ядерной пятно) (синий). Шкалы бар = 0,1 мм. Методы, используемые для иммуноокрашивания можно найти в нашей предыдущей публикации18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Схематическое представление митохондриальной стресс-теста. Биоэнергетический параметров, включая базальную, АТФ связаны, максимальной и Non митохондриальное дыхание, а также запасные дыхательных возможностей и Протон утечки, изложены на следе с соответствующим митохондриальной эффекторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: митохондриальной стресс пробирного. (A) представитель трассировки нормы потребления кислорода (OCR, pMoles/мин) по неонатальной мыши кардиомиоцитов. В указанных раза, oligomycin (Oligo, 1 мкм), FCCP (800 Нм), и вводили САР (ротенон и antimycin A, 1 мкм). Для каждого измерения представлен среднее и Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) 10 отдельных скважин. OCR (B) рассчитывается как базальную дыхания, Oligo (Протон утечки) и FCCP (максимальная дыхания) за 10 x 103 клеток. (C) OCR выражается по отношению к базальной дыхания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя реагента и решение | Подготовка | Примечания |
| Решение предварительно Пищеварение трипсина | Растворите трипсина в HBSS (без Са2 + и Mg2 +). Конечная концентрация — 0,5 мг/мл. Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. | Сделайте предварительный пищеварение решение в день эксперимента. |
| Коллагеназы пищеварение решение | Растворите трипсина в HBSS (без Са2 + и Mg2 +). Конечная концентрация — 0,5 мг/мл. Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. | Сделайте коллагеназы пищеварение решение в день эксперимента. |
| Cardiomyocyte культуры СМИ | Mix 375 мл DMEM, 125 мл M-199, 25 мл сыворотки лошади и 12,5 мл FBS. Дополнение с 1% пенициллина и стрептомицина 1% раствор. | Cardiomyocyte культуры средств массовой информации могут быть сделаны до эксперимента и храниться при температуре 4 ° C на месяц. |
| Средний митохондриальной стресс-тест | Во-первых сделать 1 Л среды с DMEM без каких-либо пируват натрия, L-глютамин, глюкозы и Hepes, фильтр для стерилизации и хранить при 4 ° C. В день анализа добавьте пируват натрия, L-глютамин, глюкозы и Hepes. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 перед использованием (стерилизация не является обязательным). | Конечная концентрация добавки являются следующие: пируват натрия (1 мм), L-глютамин (2 мм), глюкозы (10 мм) и Hepes (2 мм) |
| Oligomycin фондовая | Растворяют oligomycin в ДМСО. Во-первых Подготовьте 5 мл раствора запасов. После того как oligomycin полностью не растворится в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты, хранить при температуре от-20 ° C. | В день анализа Возьмите один Алиготе использовать. Избегайте многих циклов замораживания оттаивания. |
| FCCP фондовая | Растворяют FCCP в ДМСО. Во-первых Подготовьте 5 мл раствора запасов. Конечная концентрация составляет 5 мм. После того как FCCP полностью не растворится в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты, хранить при температуре от-20 ° C. | В день анализа Возьмите один Алиготе использовать. Избегайте многих циклов замораживания оттаивания. |
| Antimycin A фондовая | Растворяют antimycin A в ДМСО. Во-первых Подготовьте 5 мл раствора запасов. Конечная концентрация составляет 5 мм. После того, как antimycin, которые A полностью растворяется в ДМСО, 250 мкл аликвоты, храните при температуре от-20 ° C. | В день анализа Возьмите один Алиготе использовать. Избегайте многих циклов замораживания оттаивания. |
| Ротенон фондовой | Растворите ротенон в ДМСО. Во-первых Подготовьте 5 мл раствора запасов. Конечная концентрация составляет 5 мм. После того как ротенон полностью растворяется в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты, хранить при температуре от-20 ° C. | В день анализа Возьмите один Алиготе использовать. Избегайте многих циклов замораживания оттаивания. |
| Раствор для нанесения покрытия плиты культуры клетки | Во-первых сделайте 200 мл 0,5% раствора желатина. Растворите желатин в PBS и автоклав. В день эксперимента добавьте 50 мкл раствора фибронектин в 5 мл раствора желатина, чтобы сделать раствор для нанесения покрытия. | 0,5% раствор желатина может храниться при комнатной температуре до 2 месяцев. |
Таблица 1: Реактивы и решения.
| Порт впрыска | Соединений и концентрация | Объем, вводят во время выполнения (мкл) | Конечная концентрация в assay |
| A | Oligomycin 16 мкм | 25 | 2 МКМ |
| B | FCCP 9 МКМ | 25 | 1 МКМ |
| C | 20 мкм ротенон (Rot) и 20 мкм antimycin (AA) |
25 | 2 мкм каждого |
Таблица 2: Инъекции смеси.
| Шаги и процедуры | Измерения и петли |
| Калибровка | - |
| Уравновешивания | - |
| Базовые измерения | 3 раза: смешать 3 мин, подождите 2 минуты, измерения 3 мин |
| Придать порт (Oligomycin) | - |
| Измерения | 3 раза: смешать 3 мин, подождите 2 минуты, измерения 3 мин |
| Придать порта B (FCCP) | - |
| Измерения | 3 раза: смешать 3 мин, подождите 2 минуты, измерения 3 мин |
| Придать порта C (САР) | - |
| Измерения | 3 раза: смешать 3 мин, подождите 2 минуты, измерения 3 мин |
Таблица 3: Внеклеточная потока анализатор программы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы создали простой протокол для изоляции и культивирования мыши неонатальной кардиомиоцитов. Используя эти кардиомиоцитов, мы также оптимизировали условий для измерения скорости потребления кислорода с помощью системы анализатора внеклеточного потока. Протокол позволяет использовать мышь неонатальной cardiomyocytes как модель системы рассмотреть, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в основной рабочей клетки сердца, сродни что будет измеряться в органе, нетронутыми. Наш протокол отличается от ранее опубликованные протоколы16,18. Во-первых, чтобы добиться высокой жизнеспособности, только щенков сразу при рождении являются используется (то есть P0), вместо того, чтобы те, от нулевой до трех дней возраст (P0 на P3 щенков), которые широко используются в других протоколах16,19. Во-вторых чтобы свести к минимуму время эксперимента, сердца были только предварительно переваривается с трипсином за 4 ч. Кроме того чтобы упростить процедуру и добиться воспроизводимости результатов, мы работали минимальное количество шагов, как указано. Например наш протокол использует только два типа PBS и HBSS буферов и только один тип клеток культуры средств массовой информации и не используют агитации во время пищеварения коллагеназы.
Для достижения высокой жизнеспособности неонатальной мыши кардиомиоцитов, которая имеет важное значение для воспроизводимости результатов OCR assay, есть несколько критических точек. Во-первых использование P0 новорожденных щенков и выполнение предварительной Пищеварение трипсина и коллагеназы пищеварение в тот же день имеет решающее значение для достижения высокой жизнеспособности. Во-вторых во время пищеварения коллагеназы, не рекомендуется, чтобы агитировать ткани сердца в ванну воды 37 ° C. Хотя агитация предложено множество протоколов, мы нашли, что это не обязательно, как легко усваивается коллагеназы P0 сердца. Наконец нежно истирание ткани сердца имеет решающее значение для отмежеваться кардиомиоцитов после переваривания коллагеназы.
Мы также протестировали миоцитах от P1 и P2 ткани сердца щенка, используя тот же протокол. Однако для этих старых образцов сердца, мы обнаружили, что это необходимо для выполнения предварительной Пищеварение трипсина на ночь для достижения достаточной клеток урожайности (данные не показаны). Кроме того жизнеспособность клеток для P1 и P2 cardiomyocytes был около 60%, похоже, что в других опубликованных исследований16. Эти результаты показывают, что P0 миокарда имеет относительно низкую количество внеклеточного матрикса, чем старые сердца, который позволяет более короткое время для предварительного Пищеварение трипсина, что приводит к более высокой жизнеспособности клеток и дает от этих маленьких сердец.
Внеклеточные потока (XF) анализ стал крупных и популярных метод измерения биоэнергетический функции клеток и изолированных митохондриях20,21. На сегодняшний день, ряд исследований используется крыса неонатальной кардиомиоцитов и измерить потребление кислорода, используя23,22,система Agilent XF2424 . Эти исследования с использованием крыса клетки отличие от мыши производные клетки, вероятно были выполнены как крыса клетки, как правило, имеют более высокие жизнеспособность клеток и воспроизводимость пробы, по сравнению с мыши культивировании, учился здесь. Учитывая, что генетически модифицированных животных были получены главным образом в мыши линии, простой и воспроизводимые протокол для анализа биоэнергетических функции мыши неонатальной кардиомиоцитов, как мы обсуждаем в этой рукописи, предоставляет возможности для изучения митохондриальной функции в культивировании мыши. Этот метод может быть более легко переведён для данных, которые могут привести к пониманию новых механизмов биоэнергетических регулирования в самом сердце, с использованием новых или существующих генетически манипулировать мышью линии25,26.
В этом исследовании мы проверили влияние количества клеток и плотности на OCR. Как показано на рисунке 4В, OCR, измеряется в скважинах с 10 x 103, 20 x 103, 30 x 103 клеток/хорошо, был похож. Учитывая, что покрытие 30 x 103 клеток/хорошо подготовлены вырожденная хорошо в течение одного дня после посева, мы рекомендуем разбиение ячеек между3 10 x 10 до 30 x 103 клеток/хорошо в 96-луночных плита, для распознавания assay. Интересно, мы обнаружили, 3 h голода в сыворотке крови снизился OCR. Чтобы активировать гликолиза и увеличить потребление кислорода27известны факторы роста. Было также сообщено, что факторы роста повышения общей клеточной активности и сокращением кардиомиоцитов3,28. Cardiomyocyte сужением требует СПС поколения2, которая зависит от потребления кислорода. Таким образом эти данные указывают, что сыворотка голодания уменьшается потребление кислорода через инактивации кардиомиоцитов. Мы рекомендуем тестирование эффект сыворотки голода на распознавание в собственных экспериментальных условиях.
Как уже упоминалось, митохондрии играют ключевую роль в функции сердца. Таким образом выявления роман регуляторы и пути, регулирующие окислительного метаболизма может служить средством для выявления роман терапевтических целей для лечения сердечной недостаточности. Поскольку 96 хорошо формат предусматривает возможность тестировать большее количество условий, по сравнению с 24 хорошо формат тестирования, этот протокол также может быть легко адаптирована к экран высокой пропускной способности для выявления роман биоэнергетический регуляторы в cardiomyocytes29 . Таким образом объединив наши протокол с генетически манипулировать неонатальной кардиомиоцитов, например те, которые имеют митохондриальных мутаций30, может предоставить интересные исследования на экране эффекты химических соединений или кДНК библиотек, на распознавание текста в одичал тип vs. метаболически дефект кардиомиоцитов.
Мы осознаем, что у новорожденных и взрослых кардиомиоцитов имеют много различных характеристик и метаболические функции31, включая выражение уровня глюкозы и жирные кислоты метаболические ферменты32. Таким образом, идеально для использования в пробирке культивировали cardiomyocytes как модель системы нетронутыми сердца, было бы важно для дальнейшего развития протокола эффективно анализировать OCR в взрослых кардиомиоцитов, так, что одно может сравнить их окислительного потенциала и характеристики с новорожденным кардиомиоцитов. Будущие исследования должны осуществляться для адаптации этой методологии на воспроизводимый систему, с помощью взрослого культивировании.
В целом мы показать простой и воспроизводимые протокол для анализа потребления кислорода с помощью искусственного мыши неонатальной мыши кардиомиоцитов. Используя этот протокол, мы могли бы успешно изолировать и культура мыши неонатальной кардиомиоцитов и выполнять этот assay OCR, с помощью системы анализатор формат 96-луночных внеклеточного потока. Наш протокол дает высокую жизнеспособность и, главное, последовательно воспроизводимость результатов. Хотя настоящее исследование главным образом сосредоточена на потребление кислорода и митохондриальной стресс-тест, протокол может быть легко адаптирована для анализа окисление жирных кислот и гликолиза в кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех Росс лаборатории и лаборатории членов Мерфи. Эта работа поддерживается американской ассоциации сердца (14SDG17790005) клуба NIH (HL115933, HL127806) и заслуги ва (BX003260) для R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T.
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S.
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
