Summary
该方案的目的是说明如何使用小鼠新生儿心肌细胞作为一个模型系统, 以检查各种因素如何改变心脏的耗氧量。
Abstract
线粒体和氧化代谢是维持心肌功能的关键。研究表明, 线粒体功能障碍是心力衰竭中心脏功能受损的重要因素。相比之下, 恢复有缺陷的线粒体功能可能对改善心脏衰竭患者的心功能有有益的效果。因此, 研究线粒体功能的调节机制和确定新的调节剂可以提供见解, 可用于制定治疗心脏病的新的治疗靶点。在这里, 心脏肌细胞线粒体呼吸使用独特的细胞培养系统进行分析。首先, 优化了一项协议, 以快速分离和培养高生存能力的新生儿小鼠心肌细胞。然后, 用96孔格式的细胞外流量分析仪来评估这些心肌细胞的耗氧率。对于该方案, 我们优化了播种条件, 并证明新生儿小鼠心肌细胞耗氧率可以很容易地评估在细胞外流量分析仪。最后, 我们注意到, 我们的协议可以应用于更大的培养规模和其他研究, 如细胞内信号转导和收缩功能分析。
Introduction
为了维持持续的心脏收缩功能, 心肌细胞必须保持细胞能量的恒定供应, 主要是 atp1的形式。在心脏中, 大约95% 的 atp 是由线粒体产生的, 主要是通过氧化磷酸化, 表明线粒体在心脏功能2,3 中发挥着至关重要的生物能量作用。支持这一观点的是, 线粒体功能的失调可导致心肌病和心力衰竭4,5。相反, 恢复线粒体功能已被证明可以改善心脏衰竭的心功能 6,7。因此, 研究线粒体生物能量学的机制, 确定心肌细胞线粒体功能的新调节剂, 不仅可以揭示心脏能量产生的机械洞察, 还可以提供导致心脏能量产生的洞察制定治疗心脏病的新治疗靶点 6,8。
与包含肌细胞和非心肌细胞的混合物的整个心脏相比, 心肌细胞培养非常纯净, 非心肌细胞受到的心脏污染最小, 如成纤维细胞和内皮细胞10。此外, 将心肌细胞从新生幼崽中分离, 可以在短时间内培养大量细胞, 而成人心脏中的细胞为 10,11.最重要的是, 原代培养的成年小鼠心肌细胞存活时间短 (例如 24小时), 并在较长的时间点去分化。新生小鼠心肌细胞可以存活并在培养过程中纵 7 天以上 , 使其成为测试药物化合物和基因操作对心肌细胞线粒体功能的影响的理想选择 10 .当然, 成人和新生儿细胞之间存在显著的生物学差异, 但可用于新生儿细胞培养的时间较长, 使其适合许多不同类型的研究, 包括线粒体功能的研究。
迄今为止, 原代培养的新生小鼠和大鼠心肌细胞已被用作研究心脏生物能量 12,13 的模型。近年来, 研究使用细胞外助焊剂分析仪测量耗氧率 (ocr), 并评估小鼠和大鼠新生儿心肌细胞的氧化能力 14,15。与大鼠相比, 小鼠新生儿心肌细胞的细胞活力较低, 变异性较大 16.另外, 研究基因工程小鼠模型细胞的能力也使得老鼠细胞模型非常重要。鉴于 ocr 研究对细胞数量和播种密度非常敏感, 因此需要开发一种可重现、可靠和简单的协议, 以实现一致的细胞产量和活力。
在这里, 我们报告了一个优化的协议, 已经开发, 使用培养的小鼠新生儿心肌细胞与96良好的格式细胞外流量分析仪 ocr 分析。该方案大大提高了检测的重现性。此外, 该协议不仅为 ocr 分析提供了一种新颖、可重复的方法, 而且还可以适应用于其他实验目的的更大尺寸的培养, 例如研究肌纤维功能和细胞内功能可能需要的培养方法信号通路。
特别是, 该协议描述了一个为期一天的程序, 分离和培养新生儿小鼠心肌细胞在96孔细胞培养板。此外, 它还描述了使用细胞外流量分析仪测量耗氧量的过程。所有使用的溶液都经过无菌或无菌过滤。所有工具均采用75% 乙醇消毒。我们为程序的各个部分提供材料表。用于培养心肌细胞, 所有的程序和步骤都是在标准的细胞培养罩中进行的。该协议是为将新生小鼠心脏与一个垃圾 (约8-10 只小狗) 隔离而开发的。然而, 该协议也可用于隔离心肌细胞从多个垃圾。
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Protocol
对于使用新生鼠, 请参考当地大学/研究所动物护理计划规定的指南, 并遵守自己的机构和其他适当规定。本协议中描述的所有方法都已得到加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准, 并遵守联邦和州法规。
1. 试剂的制备
- 准备25 毫升的预处理溶液: hbss (不含 ca2 +和 mg2 +) 补充胰蛋白酶 (0.5 mg/ml)。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。在实验当天制作消化前溶液。
请注意:使用没有 ca2 +和 mg2 + 的hbss 是至关重要的, 因为 ca2 +和 mg2+ 会在隔离过程中导致心肌细胞收缩和随后的细胞死亡。 - 制备30 毫升胶原酶消化缓冲液:胶原酶 (0.8 mg/ml, 约 350 uml) 溶解在 hbss (不含 ca2 +和 mg2 +) 缓冲液中。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。在实验当天制作胶原酶消化液。
- 制备500毫升的心肌细胞培养基 (生长培养基): 混合375毫升的 dmem, 125 毫升的 m-199, 25 毫升的马血清, 12.5 毫升的 fbs。补充1% 青霉素和1% 链霉素溶液。
- 制备线粒体应力试验介质: 制备 200 ml 的 dmem 基应力试验介质 (dmem 不含 nhco3, 见材料表), 辅以 1 mm 丙酮酸钠、2 mm l-谷氨酰胺、10 mm 葡萄糖和 2 mm 肝。
请注意:用不含丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、葡萄糖和肝的 dmem 制备1升培养基, 无菌, 并储存在4°c。在检测当天添加其他试剂, 准备压力测试介质。使用不含 nhco3的 dmem 介质至关重要。 - 在使用当天将线粒体应力测试介质的 ph 值调整为7.4。使用前将介质加热至37°c。
- 准备寡霉素: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下储存。
- 准备fccp: 在 dmso 中准备 5 mm 库存解决方案的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
- 准备抗霉素 a: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
- 准备鱼龙酮: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
请注意:表 1列出了本协议中使用的所有试剂和解决方案。
2. 从新生小鼠中采集和消化心脏 (第1天)
- 高压灭菌剪刀、钳子和莫里亚勺子消毒。
- 为不孕不育执行细胞培养罩中的所有步骤。
- 6井细胞培养板的每口井5毫升 hbss (不含 ca2 +, mg2 +);在冰上的地方。将10毫升的 hbss 注入10厘米的细胞培养盘。
- 在50毫升无菌锥形管中制备20毫升胰蛋白酶预处理溶液。将所有解决方案放在冰上。
- 快速浸渍70% 乙醇溶液中的新生 (第0天) 小鼠进行灭菌。
- 用无菌剪刀 (直) 斩首幼崽, 不麻醉, 然后沿着胸骨打开胸部, 让进入胸腔和心脏。(图 1 a)
注: 1) 使用 p0 新生小鼠以实现高细胞活力至关重要。2) 根据 nih 和美国兽医协会的指南 17, 这种安乐死方法允许对新生儿使用。 - 用一把精细的剪刀从体内提取心脏, 并立即转移到含有 hbss 的无菌细胞培养皿中 (不含 ca 2 +, mg2 +) (图 1b)。
- 去除任何残留的肺组织、较大的血管等(如果需要, 还切除心房)。用温和的搅拌清洗 hbss 溶液中的心脏。
- 用一把精细的剪刀把每个心脏切割成8个部分, 用钳子将所有心脏组织转移到一个带有 hbss 的6井细胞培养板的井中 (图 1c 和 1C)。
- 用莫里亚勺子 (图 1d), 在装满 hbss 的6井板中, 将心脏从井中转移到井中, 清洗心脏。
请注意:把心脏从井转到井就足以洗掉血。由于血液干扰酶消化, 用 hbss 洗心、去除血液是很重要的。 - 用莫里亚勺子将心脏转移到含有20毫升胰蛋白酶 (0.5 mg/ml) 的锥形管中, 在4°C 下温和搅拌孵育 4小时 (图 1e)。
3. 准备96井文化板 (第1天)
- 制备5毫升的涂层溶液: pbs 含有0.5% 的明胶 (使用前的高压灭菌器) 和1% 的纤维连接蛋白溶液。(例如5毫升明胶溶液加上50μl 的纤维连接蛋白溶液)
- 将50μl 涂层溶液注入96孔细胞培养板的每口井 (见材料表)。如果存在气泡, 请使用20μl 移液器将气泡取出。
请注意:重要的是要覆盖每个井的所有表面积与涂层溶液。 - 将板材孵育在37°c 细胞培养孵化器中1小时或更长时间, 使基质涂层干燥。
- 在播种心肌细胞之前, 吸入任何残留的涂层溶液。
4. 酶消化和细胞电镀 (第1天)
- 在37°c 的水浴中使用预热胶原酶消化液。
请注意:这一步对于实现高效的酶消化非常重要。 - 将含有心脏的锥形管和消化前溶液从4°c 移动到细胞培养罩。(图 1f)
- 让心脏沉到试管底部, 并使用10毫升血清学移液器 (分离介质的1至2毫升可能留在管内) 去除消化前溶液。
- 在试管中加入10毫升的 hbss。用 hbss 重新暂停心脏2-3 次, 使用10毫升血清学移液器冲洗胰蛋白酶。吸气 hbss (1 至2毫升可能仍留在试管中)。
- 将预热胶原酶消化液加入10毫升。(图 1g)
- 在37°c 的水浴中用心脏将输卵管加氢 10分钟, 无需搅拌 (第一次消化)。
- 第一次消化后, 将管子移动到细胞培养罩上。用10毫升血清学移液器轻轻将心脏重新悬浮在管内, 轻轻三分心。这将使心脏分散, 细胞从心脏组织中释放。(图 1h)
请注意:由于心肌细胞是脆弱的, 温和的三化是重要的, 以实现高生存能力。 - 让未消化的组织下沉, 将富含心肌细胞 (约 9-10 ml) 的消化溶液转移到新的锥形管中, 并立即添加等量的细胞培养基, 以阻止胶原酶的消化。
- 在含有剩余未消化心脏组织的试管中加入10毫升的胶原酶消化液。
- 在37°c 的水浴中用心脏组织将输卵管加氢 10分钟 (第二次消化)。
- 重复过程4.7 和4.8。
请注意:如果仍有许多未消化的组织, 请再重复消化一次。然而, 在大多数情况下, 两个消化方法足以分散心脏组织中的大部分细胞。 - 将无菌细胞过滤器 (100μm 尼龙网) 放入新的无菌 50 ml 锥形管中。用2-3 毫升的细胞培养培养基预湿细胞过滤器, 并通过细胞过滤器。用2-3 毫升的细胞培养培养基冲洗细胞过滤器。(图 1i)
- 在 180 x g 的情况下, 含有心肌细胞的离心锥形管 5分钟 (图 1j)。吸吸上清液 (图 1k), 它将含有细胞组织碎片, 并在细胞培养培养基的10毫升中重新悬浮细胞颗粒 (图 1K)。
- 轻轻地将细胞和板细胞重新悬浮到10厘米长的细胞培养盘 (塑料无任何类型的涂层) 上, 并在细胞培养孵化器 (第一次预电镀) 中孵育 1小时 (图 1m)。此预电镀步骤允许非心肌细胞, 如成纤维细胞和内皮细胞, 粘附在未涂层细胞培养盘。
请注意:此时, 心肌细胞通常是圆形的, 在显微镜下呈闪亮。(图 1n)。 - 1小时孵育后, 轻轻搅拌板, 从10厘米培养盘中清洗非粘附细胞 (富含心肌细胞), 并使用10毫升血清学移液器在培养皿上反复移液细胞培养基, 重新悬浮细胞。然后, 将非粘附细胞 (富含心肌细胞) 转移到一个新的10厘米细胞培养盘 (塑料无任何涂层), 并在细胞培养孵化器 (第二次预电镀) 中孵育1小时。
请注意:附着在非涂层板上的细胞主要是非心肌细胞: 成纤维细胞和内皮细胞, 可以在显微镜下显示 (图 1o)。 - 第二次预电镀后, 轻轻搅拌板, 从10厘米培养盘中清洗非粘附细胞 (心肌细胞), 然后将心肌细胞转移到一个新的50毫升锥形管中。
5. 将细胞计数并将细胞放入96孔细胞培养板 (第1天)
- 用血细胞仪计数细胞。
- 通过使用最终体积为200μl 的多通道移液器, 将细胞层分为细胞外基质, 在 10-30 x10 3 活孔的密度下涂覆96孔细胞培养板 (图 1p)。使用 a1、a12、h1 和 h12 作为背景: 在这些井 (无细胞) 中添加200μl 培养基作为其他井。在37°c 细胞培养孵化器中孵育板。
请注意:在这项研究中, 使用不同的细胞密度, 如 10 x 103, 20 x 103,或 30 x10 3 细胞/井, 测试耗氧量。(图 2a)。此外, 如上所述, 分离后立即出现心肌细胞通常是圆形的, 在显微镜下呈闪亮。在培养的16-24小时内, 可存活的细胞会变平。
6. 使用96良好格式的细胞外通量分析仪进行耗氧量测定 (第2天)
请注意:耗氧量测定可以在细胞电镀后一天进行, 也可以在后一天进行。使用该协议培养的新生儿心肌细胞可在隔离后7天内存活。
- 在检测前, 将流量分析仪传感器墨盒 (参见材料表) 的水合物至少用 3个小时, 但理想情况下是一整天。在公用板的每口井中加入200μl 的校准溶液 (见材料表), 将传感器墨盒放回公用板, 并在没有 co2 或o 2补充的37°C 孵化器中孵育 。
- 在检测前一小时将细胞培养培养基改为线粒体压力测试介质。心肌细胞是脆弱的。因此, 使用多通道移液器轻轻去除细胞培养介质, 并用200μl 预热线粒体应力测试介质清洗细胞两次。二次洗涤后, 加入175μl 的预热线粒体应力测试介质, 并在没有 co2 或 o2补充的37°C 孵化器中培养细胞。
- 准备浓缩测试化合物。对于线粒体应力测试, 准备 3.0 ml, 每16μm 寡霉素, 9μm fccp, 和 20μm rotenone 和20μm 抗霉素 a 的混合物, 均在线粒体应力测试介质中。
请注意:所述浓度下的每一种化合物都经过了测试。然而, 在自己的实验室中滴定每种化合物的浓度是必要的。 - 使用多通道移液器将每个化合物的25μl 加载到传感器墨盒的喷射器端口 (图 1q)。体积和最终浓度见表 2。
- 建立细胞外通量检测方案。该程序在表 3中进行了描述。
- 启动该程序。首先, 将传感器墨盒放入机器进行校准 (图 1r)。校准步骤完成后, 请更换检测板的校准器。
请注意:使用制造商提供的软件, 指示井组以及每个化合物和端口。 - 如果需要, 在检测后, 使用多通道移液器小心丢弃所有检测介质, 并使用蛋白质检测将细胞培养微板存储在-20°c, 以便将来进行细胞归一化。
- 测量蛋白质含量。加入50μl 的标准 ripa 细胞裂解溶液 (见材料表)。在冰上加层 30分钟, 使细胞完全裂解。将所有材料转移到一个新的透明平底96井检测板。
- 根据制造商的协议, 用 bca 法测定蛋白质浓度。
请注意:用细胞外基质涂井会使每口井的蛋白质浓度都很高。因此, 减去背景井 (无细胞) 的量, 以获得实际的细胞蛋白浓度。96孔培养基中从细胞中提取的蛋白质浓度较低。此外, 由于细胞外基质涂层, 蛋白质浓度可能因良好而异。因此, 建议使用单元格数对 ocr 进行规范化。
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Representative Results
通过使用所描述的协议, 从第0天的新生幼崽中分离出心脏。获得了 5 x10 5 细胞/幼崽, 并在96个井板的密度为 10 x 10 3、20x 103 或30 x10 3的心肌细胞 (图 2a)。经过一夜的培养, 发现心肌细胞很好地附着在涂层的塑料表面, 很少有未附着的细胞 (与传播的健康的、附着的细胞相比, 未附着的细胞仍然会出现圆形和闪亮的样子) (图 2 a和 b)。在这一点上, 自发收缩心肌细胞是很容易看到的。播种密度为 30 x10 3细胞/井在播种后的一天显示融合, 因为细胞的扩散。由于圆形 (死) 细胞的数量很少, 这些结果表明, 该协议给心肌细胞带来了较高的细胞活力。心肌细胞免疫抑制与抗体对肉瘤α-放线素, 心肌细胞特异性标记18作为证明这一说法。如图2c 所示, 大多数细胞的α-放线素染色呈阳性, 显示心肌细胞分离的高纯度。
图 3显示了一个典型的线粒体应力测试方案。线粒体应力测试从氧气消耗率 (ocr) 的基线测量开始。其次是注射寡霉素, 抑制 atpase。低聚霉素注射液前后的差异显示 ocr 与 atp 的生产有关。然后, 注入解耦剂 fccp 来测量最大耗氧率。备用呼吸能力可以计算为基础和最大 ocr 之间的差异。最后, 随着两种电子转运复合物抑制剂 (抗霉素 a 和罗氏酮) 的注射, 线粒体呼吸完全停止, ocr 降至最低水平。通过阻断线粒体活性, 在这个水平上, 耗氧量是非线粒体。基础呼吸、质子泄漏和最大呼吸可以计算为非线粒体呼吸 (ocr 在抗霉素 a 和罗氏剂存在的情况下) 与基线测量、低聚辛存在下的 ocr 和 ocr 在分别存在 fccp。
在本研究中, ocr 分析是使用96孔格式的细胞外磁通分析仪系统在细胞分离一天后进行的。此外, 为了测试血清饥饿对 ocr 的影响, 在检测前 3小时, 细胞培养培养基改为常规细胞培养培养基, 或无血清。运行后, ocr 测量数据1至12为每口井, 被导出到一个电子表格, 用于记录保存和进一步分析。代谢特性的确定如下:
非线粒体呼吸 = 平均 ocr (10, 11, 12)
基础呼吸 = 平均 ocr (1, 2, 3)-平均 ocr (10, 11, 12)
atp 产量 = 平均 ocr (1, 2, 3)-平均 ocr (4, 5, 6)
质子泄漏 = 平均 ocr (4, 5, 6)-平均 ocr (10, 11, 12)
最大呼吸 = 平均 ocr (7, 8, 9)-平均 ocr (10, 11, 12)
如图 4 a所示, ocr 值易于分析, 注入化合物的影响也很明显。重要的是, 从井到井的变化很小, 标准误差就表明了这一点。细胞数量的增加导致基线测量、低霉素和 fccp 处理的呼吸的增加。与血清饥饿细胞相比, ocr 在用生长培养基培养的细胞中的含量较高。如图 4b所示, ocr 显示为每 1 x 104个细胞的基础呼吸、质子泄漏 (奥利戈) 和最大呼吸 (fccp)。每 10 x 103个细胞的 ocr 在种子密度为20k 和30k 细胞/方面高于10k 细胞/井。如图4c 所示, 通过表达相对于基础呼吸的 ocr, 质子泄漏 (oligo) 和 maximal (fccp) 的相对 ocr 在生长介质和血清饥饿群体之间显示出相似的值。这些结果表明, 播种密度不影响相对质子泄漏和最大氧化能力。
总体而言, 利用该方案, 成功分离和培养了小鼠新生心肌细胞的优良产量。ocr 可以通过在细胞外流量分析仪中使用这些肌细胞进行评估。研究结果还表明, 播种密度对细胞数计算的 ocr 没有显著影响。然而, 短期 (3小时) 血清饥饿降低 ocr。该信息可用于测试具有各种实验条件的小鼠新生儿心肌细胞 ocr。
图 1: 从0天新生小鼠开始的新生儿心肌细胞的分离和培养.(a) 新生儿被安乐死, 心脏与胸部分离。(b) 心脏在 hbss 中清洗 (不含 ca2 +, mg2 +)。(c) 每颗心被切成8颗。(d) 心脏被移动到一个6英寸的盘子里, 里面装满了 hbss。心脏是用莫里亚勺子把它们从井转移到井里来洗洗的。(e) 在4°c 时, 用胰蛋白酶-hbss 进行前消化, 搅拌温和。(f) 在4°c 孵育4小时后消化心脏组织。(g) 10分钟胶原酶消化后的心脏组织。(h) 胶原酶消化的心脏组织是三聚体。(i) 分离的心肌细胞通过细胞过滤器过滤。(j) 心肌细胞是通过离心造粒的。(k) 胶原酶和培养基被渴望删除。(l) 心肌细胞在新鲜培养基中重新悬浮。(m) 心肌细胞在10厘米的塑料盘中培养, 用于预先电镀。(n) 经过1小时的预电镀后心肌细胞 (圆形和闪亮细胞) 的代表性图像。(o) 在预先电镀并去除非粘附的心肌细胞后, 可以看到通常是成纤维细胞和内皮细胞的剩余细胞。(p) 将心肌细胞放入96孔板中。(q) 将试剂装入传感器墨盒的注射端口。(r) 将传感器墨盒放入细胞外助焊剂分析仪。刻度栏 = 0.1 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:96 孔板细胞外流量分析仪心肌细胞的培养.(a) 96 孔板中心肌细胞的代表性图像, 在播种后 (上一排) 或播种后 18小时 (下排), 具有表明的细胞密度。(b) 在 10 x 10 3 细胞密度的细胞密度下, 播种后18小时的心肌细胞放大率较高 。(c) 心肌细胞使用抗肉瘤α-放线素抗体 (绿色) 和 dapi (作为核染色) (蓝色) 染色。刻度杆 = 0.1 毫米。用于免疫染色的方法可以在我们以前的出版物18中找到。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。线粒体应力测试的原理图表示。生物能量参数, 包括基础, atp 连接, 最大和非线粒体呼吸以及备用呼吸能力和质子泄漏, 概述了与相应的线粒体效应的痕迹。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 线粒体应激分析.(a) 有代表性的追踪新生儿小鼠心肌细胞的耗氧率 (ocr, 以 pMoles/min)。在指示时间, 注射了寡霉素 (oligo, 1μm)、fccp (800 nm) 和 raa (鱼藤酮和抗霉素 a, 各 1μm)。针对每次测量, 给出了10口单井平均 (sem) 的均值和标准误差。(b) ocr 计算为每 10 x 10 3 细胞的基底呼吸、奥利戈 (质子泄漏) 和 fccp (最大呼吸).(c) ocr 相对于基础呼吸表示。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂和溶液的名称 | 制备 | 笔记 |
| 胰蛋白酶预处理液 | 在 hbss 中溶解胰蛋白酶 (不含 ca2 + 和 mg2 +)。最终浓度为 0.5 mg/ml。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。 | 在实验当天制作消化前溶液。 |
| 胶原酶消化液 | 在 hbss 中溶解胰蛋白酶 (不含 ca2 + 和 mg2 +)。最终浓度为 0.5 mg/ml。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。 | 在实验当天制作胶原酶消化液。 |
| 心肌细胞培养基 | 混合375毫升的 dmem, 125 毫升的 m-199, 25 毫升的马血清, 12.5 毫升的 fbs。补充1% 青霉素和1% 链霉素溶液。 | 肌细胞培养基可以在实验前制作, 并在4°c 下储存一个月。 |
| 线粒体应力测试介质 | 首先, 用 dmem 制作1升培养基,不含任何丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、葡萄糖和肝, 过滤后进行灭菌, 并储存在4°c。在检测当天, 加入丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、葡萄糖和肝。使用前将 ph 值调整为 7.4 (不需要灭菌)。 | 补充剂的最终浓度如下: 丙酮酸钠 (1 mm)、l-谷氨酰胺 (2 mm)、葡萄糖 (10 mm) 和 hepes (2 mm) |
| 寡霉素库存 | dmso 中溶解寡霉素。首先, 准备5毫升的库存解决方案。一旦寡霉素完全溶解在 dmso 中, 使 250μl aliquots, 储存在-20°c。 | 在检测当天, 取一个专家使用。避免许多冻融循环。 |
| fccp 股票 | 在 dmso 中溶解 fccp。首先, 准备5毫升的库存解决方案。最终浓度为 5 mm。一旦 fccp 完全溶解在 dmso 中, 使 250μl aliquots, 存储在-20°c。 | 在检测当天, 取一个专家使用。避免许多冻融循环。 |
| 反霉素 a 库存 | 在 dmso 中溶解抗霉素 a。首先, 准备5毫升的库存解决方案。最终浓度为 5 mm。一旦抗霉素 a 完全溶解在 dmso 中, 使 250μl aliquots, 储存在-20°c。 | 在检测当天, 取一个专家使用。避免许多冻融循环。 |
| 罗酮库存 | 溶解 dmso 中的鱼藤酮。首先, 准备5毫升的库存解决方案。最终浓度为 5 mm。一旦鱼酮完全溶解在 dmso 中, 使 250μl aliquots, 储存在-20°c。 | 在检测当天, 取一个专家使用。避免许多冻融循环。 |
| 细胞培养板涂层解决方案 | 首先, 使0.5% 的明胶溶液200毫升。在 pbs 和高压灭菌器中溶解明胶。在实验当天, 在5毫升明胶溶液中加入50μl 的纤维连接蛋白溶液, 制成涂层溶液。 | 0.5% 明胶溶液可在室温下储存长达2个月。 |
表 1: 试剂和解决方案。
| 注塑口 | 化合物和浓度 | 运行过程中注入的体积 (μl) | 检测中的最终浓度 |
| a 个 | 16μm 低霉素 | 25 | 2微米 |
| B | 9μm fccp | 25 | 1μm |
| C | 20μm 鱼藤酮 (罗) 和20μm 抗霉素 a (aa) |
25 | 每种2微米 |
表 2: 注射混合物。
| 步骤和程序 | 测量和循环 |
| 校准 | - |
| 平衡 | - |
| 基线测量 | 3次: 混 5分钟, 等 2分钟, 测量3分钟 |
| 注入端口 a (低霉素) | - |
| 测量 | 3次: 混 5分钟, 等 2分钟, 测量3分钟 |
| 注入端口 b (fccp) | - |
| 测量 | 3次: 混 5分钟, 等 2分钟, 测量3分钟 |
| 注入端口 c (raa) | - |
| 测量 | 3次: 混 5分钟, 等 2分钟, 测量3分钟 |
表 3: 细胞外通量分析仪程序。
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Discussion
在这项研究中, 我们建立了一个简单的方案, 用于分离和培养小鼠新生儿心肌细胞。通过使用这些心肌细胞, 我们还优化了条件, 以测量耗氧率使用细胞外流量分析仪系统。该协议允许人们使用小鼠新生儿心肌细胞作为模型系统, 以检查各种因素如何改变心脏主要工作细胞的耗氧量, 类似于在完整的器官中测量的东西。我们的协议不同于以前发布的协议16、18.首先, 为了实现高生存能力, 只使用出生时立即使用的幼崽 (即 p0), 而不是在其他协议16、19中常用的从零天到三天的幼崽 (p0 至 p3 幼崽)。其次, 为了最大限度地减少实验时间, 心脏只被前消化了4小时的胰蛋白酶。此外, 为了使过程简单, 并实现可重现的结果, 我们使用了最小数量的步骤, 概述。例如, 我们的协议仅使用两种类型的缓冲液, pbs 和 hbss, 只有一种类型的细胞培养介质, 并且在胶原酶消化过程中不使用搅拌。
为了实现新生儿小鼠心肌细胞的高生存能力, 这对于 ocr 检测的重现性非常重要, 有几个关键点。首先, 使用 p0 新生幼崽, 并在同一天进行胰蛋白酶的消化和胶原酶消化是至关重要的实现高生存能力。其次, 在胶原酶消化过程中, 不建议在37°c 的水浴中搅拌心脏组织。虽然在许多协议中都提出了激动, 但我们发现这不是必要的, 因为 p0 心脏很容易被胶原酶消化。最后, 轻轻地给心脏组织进行三指是胶原酶消化后分离心肌细胞的关键。
我们还使用相同的协议测试了 p1 和 p2 小狗心脏组织中的肌细胞。然而, 对于这些较老的心脏样本, 我们发现有必要在一夜之间进行胰蛋白酶预处理, 以获得足够的细胞产量 (数据未显示)。此外, p1 和 p2 心肌细胞的细胞活力约为 60%, 与其他已发表的研究中的水平相似.这些结果表明, p0 心肌细胞外基质的数量相对低于老年心脏, 这使得胰蛋白酶的前消化时间较短, 从而提高细胞活力和产量从这些年轻的心脏。
细胞外通量 (xf) 分析已成为测量细胞和分离线粒体中生物能量功能的一种主要且流行的方法。到目前为止, 一些研究使用大鼠新生儿心肌细胞和测量的耗氧量, 使用安捷伦 xf24 系统22,23,24 。与这里研究的小鼠心肌细胞相比, 这些使用大鼠细胞而不是鼠源性细胞的研究很可能是由于大鼠细胞的细胞活力和检测的重现性较高。鉴于转基因动物主要是在小鼠体内产生的, 正如我们在本手稿中所讨论的, 一种用于分析小鼠新生儿心肌细胞中生物能量功能的简单且可重复的协议为研究提供了机会。小鼠心肌细胞线粒体功能。这种方法可以更容易地转换为数据, 可能导致了解新的机制, 在心脏的生物能量调节, 通过使用新的或现有的基因操纵的老鼠行25,26。
在这项研究中, 我们测试了细胞数量和密度对 ocr 的影响。如图 4b所示, 在 10 x 103、20 x 103 和30x 10 3 细胞井的井中测量的 ocr 是相似的。鉴于电镀 30 x 10 3 cells"井在播种后一天内产生了融合井, 我们建议在96孔板中分离 10 x10至 30 x10 3 cellsl 井中的细胞进行 ocr 检测。有趣的是, 我们发现3小时的血清饥饿减少 ocr。据悉, 生长因子会激活糖酵解, 增加耗氧量27。另据报道, 生长因子增强心肌细胞的整体细胞活性和收缩 3,28。心肌细胞收缩需要 atp 第2代,这取决于耗氧量。因此, 这些数据表明, 血清饥饿通过心肌细胞的失活减少耗氧量。我们建议在自己的实验环境中测试血清饥饿对 ocr 的影响。
如前所述, 线粒体在心脏功能中发挥着关键作用。因此, 确定新的调节剂和途径来调节氧化代谢, 可以为确定治疗心力衰竭的新治疗靶点提供一种手段。由于96孔格式提供了测试更多的测试条件的能力, 而不是24孔格式, 因此该协议也可以很容易地适应高吞吐量屏幕, 以识别心肌细胞中新的生物能量调节剂29.因此, 通过将我们的协议与基因操纵的新生儿心肌细胞 (如有线粒体突变的细胞 30) 结合起来, 可以提供有趣的研究, 筛选化合物或 cdna 文库对 ocr 的影响。野生类型与代谢缺陷的心肌细胞。
我们知道, 新生儿和成人心肌细胞有许多不同的特点和代谢功能31, 包括葡萄糖和脂肪酸代谢酶的表达水平32。因此, 理想的情况下, 使用体外培养的心肌细胞作为完整心脏的模型系统, 这将是重要的进一步开发一个协议, 以有效地分析 ocr 在成人心肌细胞, 使人们可以比较他们的氧化能力和新生儿心肌细胞的特征。今后的研究将需要进行, 以适应这种方法, 以重现系统使用成人心肌细胞。
总之, 我们提出了一个简单和可重复的方案, 用于分析耗氧量使用原代培养的小鼠新生儿小鼠心肌细胞。利用该方案, 我们可以成功地分离和培养小鼠新生儿心肌细胞, 并使用96孔格式的细胞外流量分析仪系统进行 ocr 检测。我们的协议提供了高可行性和重要的, 一致的可重现的结果。虽然目前的研究主要集中在耗氧量和线粒体应力测试, 该协议可以很容易地适应分析脂肪酸氧化和糖酵解在心肌细胞。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢罗斯实验室和墨菲实验室的所有成员。这项工作得到了美国心脏协会 (14sdg17790005) 对 yc. nih (hl115933, hl127806) 和 va 优异 (bx003260) 至 r. s. r. 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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