Summary
이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.
Abstract
미토 콘 드리 아 및 산화 대사는 심장 근육 기능을 유지 하기 위한 중요 합니다. 연구는 미토 콘 드 리아 기능 장애는 심장 마비에서 장애인된 심장 기능에 중요 한 기여 요인으로 나타났습니다. 대조적으로, 결함이 있는 미토 콘 드리 아 기능을 복원 하는 것은 실패에 심장 기능을 개선 하기 위해 유익한 효과 있을 수 있습니다. 따라서 규제 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능에 대 한 새로운 레 귤 레이 터를 식별 심장 질환 치료를 위한 새로운 치료 목표를 개발 하는 데 사용할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, 심장 myocyte 미토 콘 드리 아 호흡 독특한 셀 문화 시스템을 사용 하 여 분석 된다. 첫째, 프로토콜은 신속 하 게 격리 하 고 높은 생존 신생아 마우스 cardiomyocytes 문화 최적화 되었습니다. 다음, 96-잘 포맷 세포 외 유출 분석기는 이러한 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 평가 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 시드 조건을 최적화 하 고 그 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비 속도 세포 외 유출 분석기에서 쉽게 평가 될 수 있다 설명 했다. 마지막으로, 우리는 우리의 프로토콜 큰 문화 크기에 적용할 수 및 다른 연구, 세포내 신호 등 및 수축 성 기능 분석 주의.
Introduction
지속적인 심장 수축 기능을 하려면 cardiomyocytes ATP1의 형태로 주로 세포 에너지의 지속적인 공급을 유지 해야 합니다. 에, ATP의 대략 95%는 미토 콘 드리 아 중요 한 역할 bioenergetic 심장 기능2,3에서 보여주는 산화 인 산화를 통해 주로 미토 콘 드리 아에 의해 생성 됩니다. 그는이 개념을 지 원하는 미토 콘 드 리아 기능의 dysregulation 심근과 심장 마비4,5이어질 수 있습니다. 반대로, 미토 콘 드리 아 기능을 복원 표시 되었습니다 실패의 심장 기능을 개선 하기 위해6,7심장. 따라서 미토 콘 드리 아 생체의 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능 cardiomyocytes에의 소설 레 귤 레이 터를 식별만 심장 에너지 생산의 기계 론 적인 통찰력을 공개 하지 않습니다 하지만 또한 이어질 것입니다 통찰력을 제공할 수 있습니다. 심장 질환6,8치료에 새로운 치료 목표의 개발.
온 마음에 비해, 매우 순수 하 고, 섬유 아 세포와 내 피 세포10같은 마음에서 비 myocytes의 최소한의 오염 있습니다 myocytes 및 비 myocytes9, cardiomyocyte 문화의 혼합물을 포함 하. 또한, 신생아 강아지에서 cardiomyocytes 격리 성인 마음10,11에서 고립 세포에 비해 시간의 작은 금액에 많은 수의 셀을 배양 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 기본 교양된 성인 마우스 cardiomyocytes 짧은 생존 시간 (예: 24 시간)와 장시간에 포인트 드 차별화. 신생아 마우스 cardiomyocytes 살아남을 수 그리고 문화, cardiomyocytes10마약 화합물 및 미토 콘 드리 아의 기능에 유전자 조작의 효과 테스트에 이상적에 7 일 이상에 대 한 조작. 물론, 성인 및 신생아 셀 사이의 중요 한 생물 학적 차이가 있다 하지만 미토 콘 드 리아 기능 포함 하는 연구의 다양 한 종류에 대 한 적절 한 게 신생아 셀의 문화에 대 한 사용할 수 있는 더 긴 기간.
날짜 하려면, 기본 교양된 신생아 마우스와 쥐 cardiomyocytes 심장 생체12,13연구 모델로 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 연구 산소 소비 속도 (OCR)을 측정 하 고 쥐와 쥐 신생아 cardiomyocytes14,15산화 용량을 평가 하는 세포 외 유출 분석기를 사용 합니다. 쥐에 비해, 하는 동안 마우스 신생아 cardiomyocytes의 세포 생존 능력 낮은 이며 더 큰 다양성16했다. 또한, 유전자 조작된 마우스 모델에서 세포를 공부 하는 능력 만드는 마우스 셀 모델 매우 중요 하다. 감안할 때 그 OCR 연구 세포 수 및 밀도 뿌리기에 너무 민감합니다, 일관 된 셀 생산량 및 생존 능력 달성을 재현 하 고 신뢰할 수 있는, 간단한 프로토콜의 개발이 필요 합니다.
여기, 우리는 최적화 된 프로토콜 개발 된 OCR 분석에 대 한 교양된 마우스 신생아 cardiomyocytes 함께 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 보고 합니다. 이 프로토콜은 매우 분석 결과의 재현성을 증가 한다. 또한, 프로토콜 소설 및 OCR 분석, 재현 방법 제공 뿐만 아니라 또한 필요한 myofibrillar 기능을 공부 하 고 세포내 있을 수 있습니다 같은 다른 실험적인 목적을 위한 큰 크기 문화에 적응 될 수 있습니다. 신호 경로.
특히,이 프로토콜 고립과 96 잘 셀 문화 접시에 신생아 마우스 cardiomyocytes의 문화에 대 한 일 절차를 설명합니다. 또한, 그것은 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 절차를 설명 합니다. 모든 솔루션에 사용 되는 살 균 또는 살 균 필터링. 모든 도구는 75% 에탄올에 의해 살 균. 우리는 절차의 다양 한 부분에 대 한 테이블의 자료 를 제공합니다. Cardiomyocytes 경작에 대 한 모든 절차 및 단계는 표준 셀 문화 후드에서 수행 됩니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스 마음 한 쓰레기 (약 8-10 새끼)에서 격리에 대 한 개발. 그러나, 프로토콜 또한 cardiomyocytes 여러 담가에서 분리 하는 데 적용할 수 있습니다.
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Protocol
신생아 쥐와 작품에 대 한 동물 보호 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학/연구소 지침 설정을 참조 하 고 하나의 기관 및 다른 적절 한 규정을 준수 하십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)을 승인 하 고 연방 및 주 규정 준수.
1입니다. 시 약의 준비
- 25 mL 사전 소화 솔루션의 준비: (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS trypsin (0.5 mg/mL)와 보충. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험 당일 사전 소화 솔루션을 확인 합니다.
참고: 그것 없이 캘리포니아2 + HBSS를 사용 하 여 중요 한 이며, Mg2 +, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + myocyte 수축과 격리 중 후속 세포 죽음을 발생 합니다. - 30 mL 콜라 소화 버퍼의 준비: 콜라 (0.8 mg/mL, 약 350 U/mL) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS 버퍼에 녹아. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험의 하루에 콜라 소화 솔루션을 확인 합니다.
- 500 mL cardiomyocyte 문화 미디어 (성장 매체)의 준비: DMEM의 375 mL, M-199의 125 mL, 말 혈 청의 25 mL 및 FBS의 12.5 mL를 혼합. 1% 페니실린과 1% 스 솔루션으로 보충.
- 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 매체준비: DMEM의 게 200 mL 1 m m 나트륨 pyruvate, 2 m L-글루타민, m 그리고 10 mM 포도 당와 2 mM Hepes 보충 스트레스 테스트 매체 (DMEM NaHCO3, 없이 재료의 표참조)를 기반으로.
참고: DMEM 매체의 1 L 나트륨 pyruvate, L-글루타민, 포도 당, Hepes, 살 균, 필터 없이 만들고 4 ° C에 저장 다른 시 약을 추가 하 여 분석 결과의 날에 스트레스 테스트 매체를 준비 합니다. DMEM을 사용 하 여 매체 NaHCO3 없이 중요 합니다. - 사용 당일 7.4 미토 콘 드 리아 스트레스 테스트 미디어의 pH를 조정 합니다. 37 ° c 사용 하기 전에 따뜻한 미디어입니다.
- Oligomycin준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
- FCCP준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
- 준비 antimycin A: DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL을 준비, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
- 로 테 논준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
참고: 모든 시 약 및 솔루션이이 프로토콜에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다.
2. 수확 및 신생아 쥐 (주 1)에서 하트의 사전 소화
- 오토 클레이 브가 위, 집게, 그리고 소독 모리아 숟가락.
- 불 임에 대 한 셀 문화 후드에 있는 모든 단계를 수행 합니다.
- 6 잘 셀 문화 접시;의 각 잘 HBSS (없이 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +)의 aliquot 5 mL 얼음에 놓습니다. Aliquot 10 mL HBSS 10 cm 세포 배양 접시에.
- 20 mL 50 mL의 멸 균 원뿔 튜브에 트립 신 소화 전 솔루션의 준비. 얼음에 모든 솔루션을 유지.
- 신속 하 게 신생아 (0 일) 쥐 살 균을 위한 70% 에탄올 용액에 담근 다.
- (똑바로) 마 취 없이 무 균가 위를 사용 하 여 새끼를 목을 벨 한 다음 흉 강 심장에 대 한 액세스를 허용 하도록 흉 골을 따라 가슴을 엽니다. (그림 1A)
참고: 1) P0 신생아 쥐를 사용 하 여 높은 세포 생존 능력을 달성 하는 것이 중요. 2)이 안락사 메서드는 NIH와 미국 수의 의학 협회 지침 17에 따라 신생아에 대 한 허용 됩니다. - 좋은 위와 HBSS (캘리포니아2 +, 마그네슘2 +) 없이 포함 된 살 균 세포 문화 접시에 즉시 전송 몸에서 마음을 추출 (그림 1B).
- 모든 잔여 폐 조직, 큰 혈관 등 을 제거 (및 심 방, 원하는 경우). 부드러운 동요를 사용 하 여 HBSS 솔루션에 마음을 씻으십시오.
- 각 심장 좋은 위 8 조각으로 잘라내어 HBSS (그림 1C 및 1d)와 6-잘 셀 문화 판의 한 잘에 집게와 모든 심 혼 직물을 전송.
- HBSS, 모리아 숟가락 (그림 1D)를 사용 하 여 가득 6 잘 플레이트에 마음 잘에서 우물을 전송 하 여 마음을 씻어.
참고: 전송 마음 잘에서 잘 하는 것은 피를 충분 하다. 혈액 효소 소화를 방해 하는 때문에, 그것은 HBSS로 마음을 세척 하 고 혈액을 제거 하는 것이 중요입니다. - 트립 신 (0.5 mg/mL) 20 mL를 포함 하는 원뿔 관으로 모리아 스푼으로 마음을 전송 및 4 ° C에서 4 h (그림 1E)에 대 한 부드러운 동요와 함께 품 어.
3. 준비 96 잘 문화 접시 (1 일)
- 코팅 액의 5 mL을 준비: PBS 0.5% 젤라틴 (압력솥 사용 하기 전에) 및 1 %fibronectin 솔루션 포함. (예: 5 mL 젤라틴 솔루션 플러스 fibronectin 솔루션의 50 µ L)
- 96-잘 셀 문화 플레이트의 각 음에 코팅 솔루션의 aliquot 50 µ L ( 재료의 표참조). 거품이 있으면, 거품 밖으로 빨 아 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 그들을 제거 합니다.
참고: 그것은 각 잘 코팅 솔루션의 모든 표면 영역을 커버 해야 합니다. - 매트릭스 코팅의 건조 수 있도록 1 시간 이상 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
- Cardiomyocytes 뿌리기 전에 어떤 잔여 코팅 솔루션을 발음.
4. 효소 소화와 세포 (주 1)의 도금
- 전 콜라 소화 솔루션 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
참고: 이 효율적인 효소 소화를 달성 하기 위해 중요 한 단계입니다. - 마음과 셀 문화 후드에 4 ° C에서 사전 소화 솔루션을 포함 하는 원뿔 튜브를 이동 합니다. (그림 1 층)
- 마음은 튜브의 맨 아래에 침 몰과 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 사전 소화 솔루션 제거 (절연 매체의 1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).
- 튜브에 HBSS의 10 mL를 추가 합니다. 다시 일시 중단 HBSS는 마음 2-3 회 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 트립 신에 밖으로 씻어. HBSS 발음 (1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).
- 마음으로 튜브에 미리 데워 진된 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. (그림 1G)
- 마음이 동요 하지 않고 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어 (1 소화).
- 1 소화 후 셀 문화 후드에 튜브를 이동 합니다. 부드럽게 다시 부드럽게 10 번 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 튜브 내 마음을 일시 중단 하 여 마음을 triturate. 이 분산 마음과 심장 조직에서 나올 셀 수 있게 됩니다. (그림 1 H)
참고: Cardiomyocytes 깨지기 때문에, 부드러운 분쇄는 높은 생존 능력을 달성 해야 합니다. - 소화 되지 않은 조직 싱크대, cardiomyocytes (약 9-10 mL) 새로운 원뿔 관에 농축 소화 솔루션 전송 및 즉시 콜라 소화 중지를 세포 배양의 동일한 금액을 추가 하자.
- 나머지 소화 되지 않은 심 혼 직물을 포함 하는 관으로 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
- 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 심 혼 직물의 튜브를 품 어 (2 소화).
- 4.7-4.8 절차를 반복 합니다.
참고: 여전히 훨씬 소화 되지 않은 조직의 경우, 소화 한 번 더 반복 합니다. 그러나, 대부분의 경우, 두 개의 소화 심장 조직에서 세포의 대부분을 분산에 충분 하다. - 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 멸 균 셀-스 트레이너 (100 µ m 나일론 메쉬)를 배치 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 스 트레이너를 미리 젖은 고 셀 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 십시오. (그림 1I)
- Cardiomyocytes 180 x g (그림 1J)에서 5 분을 포함 하는 원뿔 튜브 원심 세포 조직 파편을 포함 하 고 다시 세포 배양 (그림 1 L) 10 mL에 셀 펠 릿을 중단 것입니다 (그림 1 K), 상쾌한 발음
- 부드럽게 resuspend 셀과 10 cm 세포 문화 접시 (플라스틱 코팅의 어떤 유형도 없이)에 판 셀 및 셀 문화 인큐베이터 (1 사전 도금)에서 1 시간에 대 한 품 어 (그림 1 M). 이 중 도금 단계 비-cardiomyocytes, 섬유 아 세포와 내 피 세포, uncoated 세포 배양 접시에 같은 수 있습니다.
참고: 이 시점에서, cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. (그림 1N)입니다. - 1 h 부 화 후 부드럽게 접시 선동, 세척 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축) 10 cm 배양 접시에서 하 고 다시 반복 해 서 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 접시에 세포 배양 매체를 pipetting으로 셀을 일시 중단. 다음, 새로운 10 cm 세포 문화 접시 (어떤 코팅 없이 플라스틱)에 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축)을 전송 하 고 셀 문화 인큐베이터 (2 중 도금)에 추가 1 h에 대 한 품 어.
참고: 비 코팅 판에 연결 된 셀은 대부분 비 cardiomyocytes: 섬유 아 세포와 내 피 세포를 현미경 (그림 1O) 구상 될 수 있다. - 2 중 도금, 부드럽게 접시 선동, 10 cm 배양 접시에서 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes)을 씻어 후는 cardiomyocytes 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.
5. 셀과 셀 셀 96 잘 문화 접시 (1 일)으로 도금
- hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 셀 밀도 103 셀/잘 200 µ L (그림 1 P)의 마지막 볼륨에 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 x 10-30 사이 기질 코팅 96 잘 셀 문화 접시에 접시. 배경에 대 한 웰 스 A1, A12, H1, 및 H12 사용:이 웰 스 (셀)에 다른 우물으로 문화 매체의 200 µ L를 추가. 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
참고: 이 연구에서는 산소 소비는 10 x 103, 20 x 103또는 30 x 103 셀/잘 같은 다른 셀 밀도 사용 하 여 시험 되었다. (그림 2A)입니다. 또한, 위의 절연 직후 cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. 실행 가능한 세포 문화 16-24 h 이내 밖으로 평평 것입니다.
6. 산소 소비 분석 결과 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기 (주 2)를 사용 하 여
참고: 산소 소비 분석 결과 셀 도금 후에 1 일 실시 될 수 있습니다 이상. 신생아 cardiomyocytes 교양이 프로토콜 최대 7 일 이내에 살아남을 수 있는 사용 하 여 격리 게시.
- 플럭스 분석기 센서 카트리지 수 화 ( 재료의 표참조) 적어도 3 시간 동안, 하지만 이상적으로 분석 결과 전에 하루 종일. Calibrant 솔루션의 200 µ L를 추가 유틸리티 플레이트의 각 우물에 넣어 센서 카트리지 다시 유틸리티 접시에 ( 재료의 표참조)와 CO2 또는 O2 보충 없이 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 한 시간 분석 결과 전에 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 세포 배양을 변경 합니다. Cardiomyocytes는 약 합니다. 따라서, 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 미디어를 제거 하 고 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 200 µ L 셀을 두 번 세척. 두 번째 세척 후 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 175 µ L을 추가 하 고 37 ° C 배양 기 CO2 또는 O2 보충 없이 셀 문화.
- 집중된 테스트 화합물을 준비 합니다. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트, 3.0 mL 각 16 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 20 µ M로 테 논 및 20 µ M antimycin, 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 모두의 혼합을 준비 합니다.
참고: 각 화합물 농도 설명에서 테스트 되었습니다. 그러나, 자신의 실험실에서 각 화합물의 농도 titrating 필요 하다. - 멀티 채널 피 펫 (그림 1 분기)를 사용 하 여 센서 카트리지의 인젝터 포트를 각 화합물의 25 µ L를 로드 합니다. 볼륨 및 최종 농도 표 2에 설명 되어 있습니다.
- 세포 외 유출 분석 결과 프로토콜을 설정 합니다. 프로그램에서 설명 하는 표 3.
- 프로그램을 시작 합니다. 첫째, 캘리브레이션 (그림 1R) 용 기계로 센서 카트리지를 넣어. 교정 단계 완료 되 면 시험 접시에 대 한 calibrant를 교체 합니다.
참고: 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여, 우물과 각 화합물의 그룹 및 포트를 나타냅니다. - 원하는 경우, 분석 결과, 후 신중 하 게 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 분석 결과 매체를 삭제 하 고 셀 문화 microplate 단백질 분석 결과 사용 하 여 미래의 셀 정규화-20 ° C에서 저장 합니다.
- 단백질 함량을 측정 합니다. 50 µ L 표준 RIPA 세포 세포의 용 해 솔루션의 추가 ( 재료의 표참조). 완전 세포를 lyse을 30 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어. 새로운 투명 플랫 바닥 96 잘 시험 접시에 모든 자료를 전송 합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 분석 결과 BCA 단백질 농도 측정.
참고: 기질과 잘 코팅 각 잘에서 높은 단백질 농도에서 발생 합니다. 따라서, 실제 세포 단백질 농도를 배경 well(s) (셀)의 금액을 뺍니다. 셀에서 파생 된 단백질 농도 96 잘 문화 접시에서 낮습니다. 또한, 단백질 농도 잘 기질 코팅으로 인해 우물에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 셀 번호를 사용 하 여 OCR을 정상화 하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
설명 된 프로토콜을 사용 하 여 마음 하루 0 신생아 강아지에서 격리 했다. 5 x 105 셀/강아지 가져온, 그리고 cardiomyocytes 10 x 103, 20 x 103또는 잘/30 x 103 셀, 96 잘 접시 (그림 2A)에서 밀도에 씨를 뿌리고 있었다. 야간 문화, 후 cardiomyocytes 발견 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착 된 거의 연결 되지 않은 셀 (첨부 되지 않은 셀 계속 나타납니다으로 라운드 하 고 반짝이, spreadout는 건강 하 고, 연결 된 셀에 비해) 있었다 ( 그림 2A 그리고 B)입니다. 이 시점에서, 자발적 계약 cardiomyocytes 쉽게 볼 수 있었다. 30 x 103 셀/잘 시드 밀도 합류 시드 셀 확산 후에 1 일 보여주었다. 라운드 (죽은) 세포의 수는 매우 낮은 했다,이 결과 프로토콜 cardiomyocytes의 높은 세포 생존 능력을 제공 했다. Cardiomyocytes sarcomeric α-actinin,이 진술의 증거로 cardiomyocyte 특정 마커18 에 대 한 항 체와 immunostained 했다. 그림 2C같이 셀의 대부분 보여주는 cardiomyocyte 격리의 고 순도 α-actinin의 긍정적인 얼룩을 보여주었다.
하나의 전형적인 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트의 구조는 그림 3에 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 산소 소비 속도 (OCR)의 기준선 측정으로 시작합니다. 이것은 ATPase 억제 oligomycin의 주입에 의해 선행 된다. Oligomycin 사출 쇼는 OCR 전후 차이 ATP 생산에 연결. 다음, 연결을 푸는 에이전트 FCCP 최대 산소 소비 속도 측정을 주입 했다. 예비 호흡기 용량 기저 간의 차이 산출 될 수 있다 고 최대한 OCR. 마지막으로, 두 개의 전자 전송 복잡 한 억제제 (antimycin A와로 테 논)의 주입, 미토 콘 드리 아 호흡 완전히 중지, 그리고 OCR 최저 수준으로 감소. 이 수준에서 미토 콘 드리 아 활동을 차단 하 여 산소 소비는 비-미토 콘 드 리아. 기초 호흡, 양성자 누출, 그리고 최대한 호흡 비-미토 콘 드리 아 호흡 (antimycin A와로 테 논 존재 OCR) 및 기준선 측정, OCR oligomycin, 존재와에 OCR로 산출 될 수 있다는 FCCP의 각각.
이 연구에서는 OCR 분석 셀 격리 후 어느 날 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 수행 되었다. 또한, OCR, 3 시간 분석 결과, 이전에 혈 청 기아의 효과 테스트 하려면 셀 문화 미디어 일반 셀 문화 성장 미디어 혈 청, 또는 혈 청 하지 않고 변경 되었습니다. 실행 후 각 12까지 OCR 측정 데이터 1는 잘, 기록 유지 및 추가 분석에 대 한 스프레드시트에 수출 되었다. 신진 대사 특성은 다음과 같이 결정 했다.
비-미토 콘 드리 아 호흡 = 평균 OCR (10, 11, 12)
기초 호흡 = OCR (1, 2, 3) 평균-평균 OCR (10, 11, 12)
ATP 생산 = OCR (1, 2, 3) 평균-평균 OCR (4, 5, 6)
양성자 누출 = OCR (4, 5, 6) 평균-평균 OCR (10, 11, 12)
최대한 호흡 = OCR (7, 8, 9) 평균-평균 OCR (10, 11, 12)
그림 4A같이 OCR 값 분석 쉽게 되었다, 하 고 주입 된 화합물의 효과 또한 분명 했다. 중요 한 것은, 변이 잘에서 잘 했다 표준 오차에 의해와 같이 작은. 셀에 증가 수 증가 기준 측정, Oligomycin, FCCP 치료 호흡에서 결과. 굶 어 혈 청 셀에 비해, OCR 성장 미디어 인 큐베이 팅 했다 분석 셀에 높은 했다. 기초 호흡으로 OCR 표시 됩니다 그림 4B같이 양성자 누출 (Oligo), 및 1 x 104 의 세포 당 최대 호흡 (FCCP). 10 x 103 셀 당 OCR를 20 K와 30 K의 시드 밀도에 셀/잘 10 K 셀/잘의 보다 높았다. 같이 그림 4C, 상대 OCR의 양성자 누출 (Oligo)와 최대 (FCCP) 성장 미디어와 혈 청 사이의 비슷한 값을 표시 기초 호흡, 상대적인 OCR을 표현 하 여 그룹을 굶 어. 이러한 결과 밀도 시드 미치지 않습니다 상대 양성자 누출 및 최대한 산화 용량 것이 좋습니다.
전반적으로,이 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes의 우수한 수확량 성공적으로 격리 되었고 경작. OCR는 세포 외 유출 분석기에서이 myocytes를 사용 하 여 평가 될 수 있다. 결과 또한 그 밀도 시드 크게 영향을 주지 않습니다 셀 수로 계산 하는 OCR 보여. 그러나, 짧은 기간 (3 h) 혈 청 기아 OCR 감소합니다. 정보는 다양 한 실험 조건 마우스 신생아 cardiomyocytes OCR을 테스트 하기 위한 유용 합니다.
그림 1: 격리와 하루 0 신생아 쥐에서 신생아 cardiomyocytes의 문화. (A) 신생아는 안락사와 심장 흉부에서 해 부. (B) 마음 (없이 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +) HBSS에 세척 된다. (C) 각 심장 8 조각으로 잘라. (D) 마음 가득한 HBSS 6 잘 플레이트 이동 됩니다. 마음은 잘에서 잘 전송에 모리아 숟가락을 사용 하 여 세척 된다. (E) 마음은 부드러운 동요와 4 ° C에서 트립 신 HBSS에 미리 소화. (F) Predigested 심장 조직 4 ° c.에 4 h 부 화 후 (G) 10 분 콜라 소화 후 조직 심장. (H) 콜라 심장 조직 triturated는 소화. (나) 격리 cardiomyocytes 셀 스 트레이너를 통해 필터링 했다. (J) Cardiomyocytes는 수송과 원심 분리에 의해. (K) 콜라와 문화 미디어 포부에 의해 제거 됩니다. (L) Cardiomyocytes는 신선한 문화 매체에서 다시 정지. (M) Cardiomyocytes 중 도금에 대 한 10 cm 플라스틱 접시에 교양. (N) A cardiomyocytes (라운드와 빛나는 셀) 사전 도금의 1 시간 후의 대표 이미지. (O) 후 중 도금 및 비 점착 cardiomyocytes, 나머지는 일반적으로 섬유 아 세포 세포와 내 피 세포의 제거 볼 수 있습니다. (P) cardiomyocytes 96 잘 접시에 도금. (Q) 시 약 주입 포트 센서 카트리지 로드. (R)는 세포 외 유출 분석기 기계로 퍼 팅 센서 카트리지. 눈금 막대 = 0.1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 세포 외 유출 분석기 96 잘 접시에 cardiomyocytes의 문화. (A) 시드 (위쪽 행) 또는 18 h 게시물 시드 (아래쪽 행) 후 즉시 표시 셀 밀도와 96 잘 접시에서 cardiomyocytes의 대표 이미지. (B) 높은 확대 이미지 셀 밀도의 10 x 103 셀/에 시드 cardiomyocytes 18 h 게시물의. (C) Cardiomyocytes (파란색) 반대로 sarcomeric α-actinin 항 체 (녹색)와 DAPI (핵 얼룩)로 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 0.1 m m. Immunostaining에 사용 되는 방법 우리의 이전 게시18에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트의 도식 적인 표현입니다. 기초, ATP 연결, 최대, 및 비-미토 콘 드리 아 호흡으로 예비 호흡기 용량 및 양성자 누출, bioenergetic 매개 변수를 해당 미토 콘 드 리아 이펙터와 추적에 설명 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 미토 콘 드리 아 스트레스 분석 결과. 신생아 마우스 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 (OCR, pMoles/min)의 (A) 대표 추적 에 제시 된 시간, oligomycin (올리고, 1 µ M), FCCP (800 nM), RAA (로 테 논, antimycin A, 1 µ M) 주입 했다. 각 측정에 대 한 평균 및 10 개인 우물의 의미 (SEM)의 표준 오차 제공 됩니다. (B) OCR 기초 호흡, 올리고 (양성자 누출), 그리고 FCCP (최대한 호흡) 10 x 103 셀 당으로 계산 됩니다. (C) OCR 기저 호흡을 기준으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 및 솔루션의 이름 | 준비 | 노트 |
| 트립 신 소화 사전 솔루션 | (없이 Ca2 +와 Mg2 +) HBSS 트립 신 분해. 최종 농도 0.5 mg/mL 이다. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. | 실험 당일 사전 소화 솔루션을 확인 합니다. |
| 콜라 소화 솔루션 | (없이 Ca2 +와 Mg2 +) HBSS 트립 신 분해. 최종 농도 0.5 mg/mL 이다. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. | 실험의 하루에 콜라 소화 솔루션을 확인 합니다. |
| Cardiomyocyte 문화 미디어 | DMEM의 375 mL, M-199의 125 mL, 말 혈 청의 25 mL 및 FBS의 12.5 mL를 혼합. 1% 페니실린과 1% 스 솔루션으로 보충. | Cardiomyocyte 문화 미디어 실험 전에 할 수 있다 고 한 달에 4 ° C에 저장 될. |
| 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 매체 | 먼저, 확인 1 L DMEM 없이 매체의 모든 나트륨 pyruvate, L-글루타민, 포도 당, 및 Hepes, 소독, 필터링 및 4 ° c.에 저장 분석 결과의 날, Hepes, 포도 당, L-글루타민, 나트륨 pyruvate를 추가 합니다. 사용 하기 전에 7.4에 pH를 조정 (살 균 필요 하지 않습니다). | 보충을 위한 최종 농도 다음과 같은: 나트륨 pyruvate (1mm), L-글루타민 (2mm), 포도 (10 m m), 및 Hepes (2 mM) |
| Oligomycin 주식 | DMSO에 oligomycin 디졸브. 첫째, 재고 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 일단 oligomycin 완전히 DMSO에 용 해, 250 µ L aliquots,-20 ° c.에 저장 | 분석 결과 하루에 사용 하 여 한 약 수를 가져가 라. 많은 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. |
| FCCP 주식 | FCCP DMSO에 녹. 첫째, 재고 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 최종 농도 5 m m 이다입니다. FCCP 완전히 DMSO에 용 해, 일단 250 µ L aliquots,-20 ° c.에 저장 | 분석 결과 하루에 사용 하 여 한 약 수를 가져가 라. 많은 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. |
| Antimycin A 주식 | DMSO에 antimycin A를 분해. 첫째, 재고 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 최종 농도 5 m m 이다입니다. 일단 A DMSO에 완전히 용 해 antimycin 250 µ L aliquots,-20 ° c.에 저장 | 분석 결과 하루에 사용 하 여 한 약 수를 가져가 라. 많은 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. |
| 로 테 논 주식 | 로 테 논 DMSO에 녹. 첫째, 재고 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 최종 농도 5 m m 이다입니다. 로 테 논은 DMSO에 완전히 녹아 있는, 일단 250 µ L aliquots,-20 ° c.에 저장 | 분석 결과 하루에 사용 하 여 한 약 수를 가져가 라. 많은 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. |
| 세포 배양 플레이트 코팅 솔루션 | 먼저, 0.5% 젤라틴 용액 200 mL 확인 합니다. PBS와 압력솥에 젤라틴 분해. 실험 당일, fibronectin 솔루션의 50 µ L 코팅 솔루션 5 mL 젤라틴 솔루션에 추가 합니다. | 0.5% 젤라틴 솔루션 최대 2 개월까지 실내 온도에 저장할 수 있습니다. |
표 1: 시 약 및 솔루션
| 사출 포트 | 화합물 및 농도 | 볼륨 실행 (µ l) 중 주입 | 최종 농도 분석 결과에 |
| A | 16 µ M oligomycin | 25 | 2 Μ M |
| B | 9 Μ M FCCP | 25 | 1 Μ M |
| C | 20 µ M로 테 논 (부패) 그리고 20 µ M antimycin A (AA) |
25 | 각각의 2 µ M |
표 2: 주입의 혼합물
| 단계 및 절차 | 측정 및 루프 |
| 교정 | - |
| 재래식 | - |
| 초기 측정 | 3 번: 혼합 3 분, 2 분을 대기, 3 분을 측정 |
| 주사 (Oligomycin) 포트 | - |
| 측정 | 3 번: 혼합 3 분, 2 분을 대기, 3 분을 측정 |
| 포트 B (FCCP) 주사 | - |
| 측정 | 3 번: 혼합 3 분, 2 분을 대기, 3 분을 측정 |
| 포트 C (RAA)을 주사 | - |
| 측정 | 3 번: 혼합 3 분, 2 분을 대기, 3 분을 측정 |
표 3: 세포 외 유출 분석기 프로그램입니다.
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Discussion
이 연구에서 우리는 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 경작에 대 한 간단한 프로토콜을 설립 했다. 사용 하 여 이러한 cardiomyocytes, 우리는 또한 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 산소 소비 속도 측정 하는 조건을 최적화. 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 얼마나 다양 한 요인이 그대로 기관 측정 될 것 이다 가까운 심장의 주 작업 세포에 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 있습니다. 우리의 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜16,18에 다릅니다. 첫째, 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 출생 시 즉시만 새끼는 다른 프로토콜16,19에 일반적으로 사용 되는 나이 (P3에 P0 새끼), 3 일 일 0에서에서 사람 대신 (예: P0)를 사용. 둘째, 실험의 시간을 최소화 하려면 마음 했다만 미리 소화 4 h에 대 한 트립 신으로. 또한, 절차를 간단 하 게 하 고 재현 가능한 결과 달성, 우리는 설명 된 대로 최소 개수의 단계, 고용. 예를 들어 우리의 프로토콜 버퍼 PBS, HBSS의 두 종류와 세포 배양에의 한 유형을 사용 하 여 그리고 콜라 소화 하는 동안 동요를 고용 하지 않습니다.
신생아 마우스 cardiomyocytes OCR 분석 결과의 재현성에 대 한 중요 한의 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, P0 신생아 강아지를 사용 하 여와 같은 날에 트립 신 사전 소화와 콜라 소화를 수행이 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 중요 합니다. 둘째, 콜라 소화 하는 동안 그것은 권장 하지 않습니다 37 ° C 물 욕조에 심장 조직의 선동 하. 동요는 많은 프로토콜에서 건의 된다, 비록 우리는 P0 마음은 콜라에 의해 소화 쉽게 필요 하지 않습니다 발견. 마지막으로, 부드럽게 심장 조직의 분쇄는 cardiomyocytes 콜라 소화 후 해리에 중대 하다.
우리는 또한 동일한 프로토콜을 사용 하 여 p 1과 P2 강아지 심장 조직에서 myocytes 테스트. 그러나, 이러한 오래 된 심장 샘플에 대 한 우리 trypsin 사전 소화 하룻밤 충분 한 셀 생산량 (데이터 표시 되지 않음)를 달성 하기 위해 수행 해야 하는 발견. 또한, P1 및 P2 cardiomyocytes의 세포 생존 능력 60%, 그 다른 출판 연구16비슷한 약 했다. 이러한 결과 P0 심근 세포 외 매트릭스의 trypsin 사전 소화, 더 높은 세포 생존 능력에 결과 대 한 짧은 시간을 수 있게 하 고 이러한 젊은 마음에서 생성 하는 더 오래 된 마음 보다 상대적으로 낮은 금액은 건의 한다.
세포 외 유출 (XF) 분석 세포에 고립 된 미토 콘 드리 아20,21bioenergetic 기능을 측정 하는 중요 하 고 인기 있는 방법 되고있다. 날짜 하려면, 연구의 수는 쥐 신생아 cardiomyocytes 사용 하 고 산소 소비, 애질런트 XF24 시스템22,,2324 를 사용 하 여 측정. 쥐 세포 일반적으로 더 높은 세포 생존 능력 및 마우스 심장 myocytes 여기 공부 비교 분석 결과 재현성에 아마 마우스에서 파생 된 셀, 반대로 쥐 세포를 사용 하 여 이러한 연구 수행 했다. 유전자 변형된 동물 마우스 라인에서 생성 된 주로, 그 우리가이 원고에 대해 마우스 신생아 cardiomyocytes bioenergetic 기능을 분석 하기 위한 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 연구 기회를 제공 합니다. 마우스 심장 myocytes에서 미토 콘 드 리아 기능입니다. 이 메서드는 새로운 또는 기존의 유전자 조작 마우스 라인25,26를 사용 하 여에, bioenergetic 규제에 대 한 새로운 메커니즘을 이해로 이어질 수 데이터를 더 쉽게 번역 될 수 있다.
이 연구에서 우리 OCR에 휴대폰 번호와 밀도의 영향을 테스트 했습니다. 그림 4B같이 OCR와 10 x 103, 20 x 103, 30 x 103 셀/음, 우물에서 측정 유사 했다. 도금 30 x 103 셀/잘 뿌리기 후 1 일 이내 confluent 잘 생산, 30 x 103 셀/잘 OCR 분석 결과 대 한 96 잘 접시 10 x 103 사이 세포를 분할 하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도 우리는 혈 청 기아 3 h OCR을 감소 발견. 성장 요인 분해를 활성화 하 고 산소 소비27증가 알려져 있습니다. 그것은 또한 성장 요인 전반적인 향상 알려졌다 세포 활동과 cardiomyocytes3,28의 수축. Cardiomyocyte 수축 ATP 세대2, 산소 소비에 따라 달라 집니다이 필요 합니다. 따라서, 이러한 데이터는 혈 청 기아 cardiomyocytes의 비활성화를 통해 산소 소비를 감소 것이 좋습니다. 것이 좋습니다 자신의 실험 설정에서 OCR에 혈 청 기아의 효과 테스트.
앞에서 언급 했 듯이, 미토 콘 드리 아 심장 기능에 주요 역할을 재생 합니다. 따라서, 새로운 레 귤 레이 터와 산화 물질 대사를 조절 하는 진학 심장 마비 치료를 위한 비 발한 치료 목표를 식별 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 이후 96 잘 형식 테스트 조건 24 잘 형식에 비해 더 큰 수를 테스트 하는 기능에 대 한 제공,이 프로토콜 또한 cardiomyocytes29에에서 소설 bioenergetic 레 귤 레이 터를 식별 하는 데 높은 처리량 화면에 쉽게 적응 될 수 있습니다. . 따라서, 유전자와 우리의 프로토콜을 결합 하 여 미토 콘 드리 아 돌연변이30, 흥미로운 연구 화면에 OCR에 화합물 또는 cDNA 라이브러리의 효과를 제공할 수 있는 것 들을 같은 신생아 cardiomyocytes 조작 야생-타입 vs. -결함 metabolically cardiomyocytes.
우리는 신생아 및 성인 cardiomyocytes 많은 다른 특성 및 신진 대사 기능31, 포도 당 및 지방산 대사 효소32식 수준을 포함 하 여 것입니다. 따라서, 이상적인 체 외 배양된 cardiomyocytes를 사용 하 여 그대로 심장의 모델 시스템으로 서, 그것은 것 하나 그들의 산화 능력을 비교할 수 있도록 추가 성인 cardiomyocytes에 OCR를 효율적으로 분석 하는 프로토콜을 개발 하는 것이 중요 하 고 신생아 cardiomyocytes와 특성입니다. 미래 연구는 성인 심장 myocytes를 사용 하 여 재현 시스템에이 방법론에 맞게 추진 될 필요 합니다.
요약, 우리는 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비를 분석 하기 위한 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜을 표시 됩니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리 수 성공적으로 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 문화 하 고 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여이 OCR 분석 결과 수행. 우리의 프로토콜 제공 높은 생존 능력 및 중요 한 것은, 일관 되 게 재현할 결과. 현재의 연구는 주로 산소 소비와 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트에 초점을 맞추고, 비록 지방산 산화 및 분해 cardiomyocytes에 분석 하는 프로토콜을 쉽게 적응 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 모든 로스 연구소 및 머피 연구소 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 심 혼 협회 (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806)와 R.S.R. 버지니아 가치 (BX003260)에 의해 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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