Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.
Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi’nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.
Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95’i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3‘ te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5‘ e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.
Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11‘ den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.
Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.
Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.
Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı–dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.
Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önc…
The authors have nothing to disclose.
Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir
Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |