Summary
Le but du présent protocole est d’illustrer l’utilisation de souris néonatales cardiomyocytes comme système modèle pour examiner comment divers facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène au coeur.
Abstract
Mitochondries et métabolisme oxydatif sont essentiels pour maintenir la fonction du muscle cardiaque. Les recherches démontrent que le dysfonctionnement mitochondrial est un facteur important contribuant à la fonction cardiaque altérée trouvé dans l’insuffisance cardiaque. En revanche, restaurer la fonction mitochondriale défectueuse peut-être avoir des effets bénéfiques pour améliorer la fonction cardiaque au cœur défaillant. Par conséquent, étudier les mécanismes de régulation et d’identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale pourraient fournir insight qui pourrait servir à développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiaques. Ici, la respiration mitochondriale de myocytes cardiaques est analysée à l’aide d’un système de culture cellulaire unique. Tout d’abord, un protocole a été optimisé pour isoler rapidement et culture viabilité haute souris néonatales cardiomyocytes. Ensuite, un analyseur de flux extracellulaire format 96 puits sert à évaluer le taux de consommation d’oxygène de ces cardiomyocytes. Pour ce protocole, nous avons optimisé seeding conditions et démontré que taux de consommation de l’oxygène de cardiomyocytes souris néonatales peut être facilement évalué dans un analyseur de flux extracellulaire. Enfin, nous constatons que notre protocole peut être appliqué à une plus grande taille de culture et d’autres études, telles que la signalisation intracellulaire et contractiles fonctionnent analyse.
Introduction
Pour maintenir une fonction contractile cardiaque continue, cardiomyocytes doit maintenir un apport constant d’énergie cellulaire principalement sous la forme d’ATP1. Dans le coeur, environ 95 % de l’ATP est généré par les mitochondries, principalement par le biais de la phosphorylation oxydative, montrant que les mitochondries jouent un rôle de bioénergétique crucial dans la fonction cardiaque2,3. Soutenant cette notion est que le dérèglement de la fonction mitochondriale peut conduire à une cardiomyopathie et une insuffisance cardiaque4,5. À l’inverse, restaurer la fonction mitochondriale a été établi afin d’améliorer la fonction cardiaque de la défaillance cardiaque6,7. Par conséquent, étudier le mécanisme de bioénergétique mitochondriale et identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale dans les cardiomyocytes ne révéleront pas seulement les perspicacités mécanistes de la production énergétique cardiaque mais également pourraient fournir un aperçu qui mèneront au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies cardiaques,6,8.
Par rapport au coeur entier, qui contient un mélange de myocytes et non-myocytes9, cultures cardiomyocyte sont extrêmement pure, avec une contamination minimale des non-myocytes du cœur, comme les fibroblastes et les cellules endothéliales10. En outre, isolant les cardiomyocytes des chiots nouveau-nés permet de cultiver un grand nombre de cellules dans un peu de temps, par rapport à l’isolement de cellules coeurs adultes10,11. Plus important encore, cardiomyocytes adultes cultivés primaires de souris ont la survie à court temps (p. ex. 24 h) et en des temps plus longs points de différencient. La souris néonatales cardiomyocytes peut survivre et être manipulés pendant plus de 7 jours de culture, ce qui les rend idéaux pour tester les effets des médicaments composés et des manipulations génétiques sur la fonction des mitochondries dans les cardiomyocytes10. Bien sûr, il y a des différences biologiques importantes entre les cellules adultes et néonatales, mais la durée plus longue disponible pour la culture de cellules néonatales qui les rend appropriés pour différents types d’études, y compris ceux de la fonction mitochondriale.
A ce jour, primaire néonatale souris et rat cardiomyocytes cultivés ont servi comme modèles d’études cardiaques bioénergétique12,13. Ces dernières années, des études a utilisé un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) et évaluer la capacité oxydative dans souris et rat néonatal cardiomyocytes14,15. Alors que comparativement à des rats, la viabilité des cellules de souris néonatales cardiomyocytes est plus faible et a une plus grande variabilité16. Aussi, la possibilité d’étudier des cellules à partir des modèles de souris génétiquement modifiées rend le modèle de cellule de souris très important. Étant donné que les études de l’OCR sont tellement sensibles à la cellule le nombre et la densité de semis, élaboration d’un protocole simple, fiable et reproductible pour atteindre la viabilité et le rendement cellulaire compatible est nécessaire.
Nous rapportons ici un protocole optimisé qui a été développé qui utilise des cardiomyocytes néonatals cultivés de souris avec un analyseur de flux extracellulaire 96-puits-format pour l’analyse de l’OCR. Ce protocole augmente considérablement la reproductibilité du dosage. En outre, le protocole non seulement fournit un procédé nouveau et reproductible pour l’analyse de l’OCR, mais également pourrait être adapté à une culture de taille plus grande et à d’autres fins expérimentales, telles que celle qui peut être nécessaire d’étudier les fonctions myofibrillaires et intracellulaire voies de signalisation.
En particulier, ce protocole décrit une procédure d’une journée pour l’isolement et culture des cardiomyocytes de souris néonatales dans une plaque de culture de cellules de 96 puits. En outre, il décrit la procédure pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Toutes les solutions utilisées sont stériles ou filtré stérile. Tous les outils sont stérilisés à 75 % d’éthanol. Nous fournissons une Table des matières pour les différentes parties de la procédure. Pour la culture des cardiomyocytes, toutes les procédures et les mesures sont effectuées dans une hotte de culture cellulaire standard. Ce protocole est développé pour l’isolement des coeurs de souris néonatales d’une portée (environ 8-10 chiots). Toutefois, le protocole peut être également adapté pour isoler les cardiomyocytes provenant de plusieurs portées.
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Protocol
Pour travail avec souris néonatales, veuillez vous référer à l’ensemble de lignes directrices locales / l’Institut de l’Université de suite par les programmes de soins aux animaux et adhérer à son établissement ou des règlements appropriés. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par l’UC San Diego institutionnels et animalier utilisation Comité (IACUC) et se conformer aux règlements fédéraux et d’état.
1. préparation des réactifs
- Préparer 25 mL de solution de prédigestion: HBSS (sans Ca2 + , Mg2 +) additionné de la trypsine (0,5 mg/mL). Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. Font de prédigestion solution le jour de l’expérience.
Remarque : Il est essentiel d’utiliser HBSS sans Ca2 + et Mg2 +, comme Ca2 + et Mg2 + causera myocyte contraction et la mort cellulaire ultérieure lors de l’isolation. - Préparer 30 mL de tampon de digestion de collagénase: collagénase (0,8 mg/mL, environ 350 U/mL) dissoute dans un tampon HBSS (sans Ca2 + , Mg2 +). Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. Solution de digestion de collagénase effectuez le jour de l’expérience.
- Préparer 500 mL de cardiomyocyte milieux de culture (milieux de culture): mélanger 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de sérum de cheval et 12,5 mL de FBS. Compléter avec la pénicilline 1 % et 1 % solution de streptomycine.
- Préparer mitochondrial test d’effort moyen: faire 200 mL de DMEM base milieu de stress test (DMEM sans NaHCO3, voir la Table des matières) additionné de pyruvate de sodium 1 mM, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de glucose et 2 mM Hepes.
Remarque : Faire 1 L de milieu DMEM sans pyruvate de sodium, L-glutamine, de glucose et Hepes, déclarant stérile et stocker à 4 ° C. Préparer le milieu d’épreuve de stress le jour du test en ajoutant d’autres réactifs. À l’aide de DMEM moyen sans NaHCO3 est critique. - Ajuster le pH des médias mitochondrial stress test à 7.4 le jour d’utilisation. Médias chauds à 37 ° C avant utilisation.
- Préparer l’oligomycine: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
- Préparer le FCCP: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
- Préparer l’antimycine A: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
- Préparer la roténone: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
Remarque : Tous les réactifs et les solutions utilisées dans le présent protocole sont énumérées au tableau 1.
2. récolte et prédigestion des cœurs de souris néonatales (jour 1)
- Autoclave ciseaux, pinces et une cuillère de Moria pour stériliser.
- Exécutez toutes les étapes dans la hotte de culture cellulaire pour la stérilité.
- Aliquote 5 mL de HBSS (sans Ca2 +, Mg2 +) dans chaque puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits ; placer sur la glace. Aliquote 10 mL de HBSS dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm.
- Préparer 20 mL de solution de trypsine prédigestion dans un tube conique stérile de 50 mL. Garder toutes les solutions sur la glace.
- Tremper rapidement la souris nouveau-né (jour 0) dans la solution d’éthanol à 70 % pour la stérilisation.
- Décapiter des chiots avec des ciseaux stériles (tout droit) sans anesthésie et puis ouvrez le coffre le long du sternum pour permettre l’accès à la cage thoracique et le cœur. (Figure 1 a)
Remarque : 1) il est essentiel d’utiliser souris néonatales P0 pour atteindre la viabilité cellulaire élevée. 2) cette méthode d’euthanasie est autorisée pour les nouveau-nés conformément aux NIH et l’American Veterinary Medical Association directives 17. - Coeurs extrait le corps avec des ciseaux fins et transférer immédiatement dans la boîte de Petri stérile cellule contenant HBSS (sans Ca2 +, Mg2 +) (Figure 1 b).
- Supprimer n’importe quel tissu pulmonaire résiduelle, navires plus grands, etc. (et les oreillettes, si vous le souhaitez). Laver les coeurs dans la solution HBSS selon agitation douce.
- Couper chaque coeur avec une paire de ciseaux fine en 8 morceaux et transférer le tissu cardiaque tous avec une pince dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits avec HBSS (Figure 1 et D 1).
- Laver les coeurs en transférant les cœurs de puits à puits de la plaque 6 puits remplie de HBSS, à l’aide d’une cuillère de Moria (Figure 1).
Remarque : Transférer les cœurs de puits à puits est suffisante pour laver le sang. Puisque le sang interfère avec la digestion enzymatique, il est important de laver les coeurs avec HBSS et enlever le sang. - Transférer les coeurs avec une cuillère de Moria dans un tube conique contenant 20 mL de trypsine (0,5 mg/mL) et incuber avec agitation modérée à 4° C pendant 4 h (Figure 1E).
3. préparer une microplaque 96 puits de Culture (jour 1)
- Préparer 5 mL de solution d’enrobage : PBS contenant 0,5 % de gélatine (autoclave avant utilisation) et la fibronectine solution à 1 %. (par exemple 5 mL de solution de gélatine plus 50 µL de solution de fibronectine)
- Aliquote 50 µL de solution d’enrobage dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits (voir Table des matières). Si les bulles sont présentes, supprimez-les à l’aide d’une pipette de 20 µL à sucer des bulles sur.
Remarque : Il est important de couvrir toute la surface de chaque puits avec solution d’enrobage. - Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C pendant 1 h ou plus pour permettre un séchage de l’enduit de la matrice.
- Aspirer toute solution de revêtement résiduel avant d’ensemencer les cardiomyocytes.
4. enzymatique Digestion et bordé de cellules (jour 1)
- Réchauffez la solution de digestion de collagénase dans un bain-marie à 37 ° C.
Remarque : Cette étape est importante pour réaliser une digestion enzymatique efficace. - Déplacer le tube conique contenant les cœurs et solution de prédigestion de 4 ° C pour une hotte de culture cellulaire. (Figure 1F)
- Laisser le cœur se déposent au fond du tube et enlever la solution de digestion préalable à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL (1 à 2 mL de milieu d’isolement peuvent rester dans le tube).
- Ajouter 10 mL de HBSS dans le tube. Remettre en suspension les coeurs avec HBSS 2 ou 3 fois pour laver la trypsine à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Aspirer HBSS (1 à 2 mL peuvent rester dans le tube).
- Ajouter 10 mL de solution de digestion de collagénase préchauffé dans le tube avec un cœur. (Figure 1)
- Incuber le tube avec un cœur dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min sans agitation (1er digestion).
- Après digestion 1er, déplacer le tube à la hotte de la culture cellulaire. Triturer doucement coeurs en re-suspendant les coeurs à l’intérieur du tube délicatement 10 fois en utilisant une pipette sérologique de 10 mL. Cela permettra aux coeurs de se disperser et les cellules qui sortira du tissu cardiaque. (Figure 1 H)
Remarque : Cardiomyocytes étant fragiles, douce trituration est importante de parvenir à la viabilité de haute. - Laissez les tissus non digérés couler, transvaser digérée solution enrichie dans les cardiomyocytes (environ 9 à 10 mL) dans un nouveau tube conique et immédiatement ajouter une quantité égale de milieux de culture cellulaire pour arrêter la digestion de collagénase.
- Ajouter 10 mL de solution de digestion de collagénase dans le tube contenant le tissu cardiaque non digérés restants.
- Incuber le tube avec le tissu cardiaque dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min (2ème digestion).
- Répétez la procédure 4.7 et 4.8.
Remarque : S’il y a encore beaucoup non digéré tissu, répéter une fois de plus la digestion. Toutefois, dans la plupart des cas, deux digestions sont assez pour disperser la plupart des cellules du tissu cardiaque. - Placer une cellule stérile-passoire (mailles de nylon de 100 µm) dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Pré mouillage le tamis cellulaire avec 2-3 mL de milieu de culture cellulaire et passer des cellules par l’intermédiaire de la cellule-crépine. Rincer la crépine-cellule avec 2-3 mL de milieu de culture cellulaire. (Figure 1I)
- Centrifuger conique tube contenant des cardiomyocytes pendant 5 min à 180 g (Figure 1J). Aspirer le surnageant (Figure 1 K), qui contiendra les débris tissulaires cellulaires et resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (Figure 1 L).
- Doucement remettre en suspension les cellules et les cellules de la plaque sur une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm (plastique sans n’importe quel type de revêtement) et incuber pendant 1 heure dans un incubateur de culture cellulaire (1er pré bordé) (Figure 1 M). Cette étape préalable de placage permet aux non-cardiomyocytes, tels que les fibroblastes et les cellules endothéliales, à adhérer au plat culture cellulaire non couché.
Remarque : À ce stade, cardiomyocytes sont généralement une forme ronde et être brillants sous le microscope. (Figure 1N). - Après l’incubation de 1 h, doucement agiter la plaque, laver les cellules non adhérentes (enrichis dans les cardiomyocytes) de la boîte de Petri de 10 cm et remettre en suspension les cellules en pipettant également à plusieurs reprises, le milieu de culture cellulaire sur le plat à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ensuite, transférer les cellules non adhérentes (enrichis dans les cardiomyocytes) dans une boîte de Petri de nouveau 10 cm cellule (plastique sans revêtement) et incuber pendant une 1 heure supplémentaire dans un incubateur de culture cellulaire (2ème pré bordé).
Remarque : Les cellules qui s’attachent à la plaque non revêtues sont principalement non-cardiomyocytes : les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui peuvent être visualisées au microscope (Figure 1O). - Après la 2e avant électrodéposition, doucement agiter la plaque, laver les cellules non adhérentes (cardiomyocytes) de la boîte de Petri de 10 cm, puis transférer les cardiomyocytes dans un nouveau tube conique de 50 mL.
5. comptage des cellules et bordé dans une plaque de Culture cellulaire de 96 puits (jour 1)
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Les cellules de la plaque dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits matrice extracellulaire enduite à une densité comprise entre 10-30 x 103 cellules/puits à l’aide d’une pipette multi-canaux dans un volume final de 200 µL (Figure 1 P). Utiliser le puits A1, A12, H1 et H12 pour arrière-plan : ajouter 200 µL de milieu de culture comme les autres puits dans ces puits (pas de cellules). Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C cell culture.
Remarque : Dans cette étude, la consommation d’oxygène a été testée à l’aide de la densité des cellules différentes tels que 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 cellules par puits. (Figure 2 a). Aussi, comme ci-dessus, cardiomyocytes immédiatement après l’isolement sont généralement une forme ronde et être brillants sous le microscope. Cellules viables seront aplatissent au sein de 16 à 24 heures de culture.
6. test de consommation d’oxygène à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire format 96-puits (jour 2)
Remarque : Test de consommation d’oxygène peut être effectuée un jour après l’ensemencement les cellules ou version ultérieure. Néonatales cardiomyocytes cultivés à l’aide de ce protocole peut survivre jusqu'à 7 jours après isolement.
- Hydrater une cartouche de sonde d’analyseur de flux (voir Table des matières) pour au moins 3 heures, mais idéalement pour une journée complète, avant le dosage. Ajouter 200 µL de solution de degré (voir Table des matières) dans chaque puits de la plaque de l’utilitaire, replacez la cartouche de la sonde sur la plaque de l’utilitaire et incuber dans un incubateur à 37 ° C sans O2 supplémentation ou de CO2 .
- Milieux de culture cellulaire à changer au milieu de stress test de mitochondries une heure avant le dosage. Cardiomyocytes sont fragiles. Par conséquent, doucement enlever les milieux de culture cellulaire à l’aide d’une pipette multi-canaux et laver les cellules avec 200 µL de médias préchauffé mitochondrial stress test deux fois. Après le deuxième lavage, ajouter 175 µL de milieux d’essai de stress mitochondries préchauffé et culture les cellules dans un incubateur à 37 ° C sans O2 supplémentation ou de CO2 .
- Préparer des composés d’essai concentré. Pour le test de stress de mitochondries, préparer 3,0 mL de chacune des 16 µM l’oligomycine, 9 µM FCCP et un mélange de 20 µM roténone et 20 µM l’antimycine A, tous en milieu d’épreuve de stress mitochondrial.
Remarque : Chaque composé à la concentration décrite a été testé. Cependant, le titrage de la concentration de chaque composé dans son propre laboratoire est nécessaire. - Charger 25 µL de chaque composé dans les raccords d’injecteur de la cartouche de sonde à l’aide d’une pipette multicanaux (Figure 1 q). Le volume et la concentration finale sont décrites dans le tableau 2.
- Mettre en place le protocole d’analyse de flux extracellulaire. Le programme est décrit en tableau 3.
- Démarrez le programme. Tout d’abord, mettre la cartouche de sonde dans la machine pour l’étalonnage (Figure 1R). Remplacer le degré pour la plaque de test une fois terminée l’étape de calibrage.
Remarque : À l’aide du logiciel fourni par le fabricant, indiquent les groupes de puits et de chaque composé et le port. - Si vous le souhaitez, après l’essai, soigneusement jeter tous les milieu à l’aide d’une pipette multi-canaux et stocker la microplaque de culture cellulaire à-20 ° C pour la normalisation future cellule à dosage protéique.
- Mesurer la teneur en protéines. Ajouter 50 µL de solution étalon de lyse cellulaire RIPA (voir Table des matières). Incuber les plaques sur la glace pendant 30 min à entièrement lyser les cellules. Transférer tout le matériel pour une nouvelle plaque de fond clair plat 96 puits assay.
- Mesurer la concentration de protéines par dosage de la BCA selon le protocole du fabricant.
Remarque : Revêtement du puits avec matrice extracellulaire entraîne une concentration élevée en protéines dans chaque puits. Par conséquent, soustrayez le montant du puits de fond (pas de cellules) pour obtenir la concentration de protéines cellulaires réelles. La concentration de protéines dérivée de cellules est faible dans une plaque à 96 puits de culture. En outre, la concentration de protéines peut varier de puits à puits à cause du revêtement de la matrice extracellulaire. Par conséquent, en utilisant le nombre de cellules de normaliser l’OCR est suggéré.
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Representative Results
En utilisant le protocole décrit, les coeurs ont été isolées de chiots nouveau-nés jour 0. 5 x 105 cellules/pup ont été obtenues, et les cardiomyocytes ont été injectées à des densités de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 cellules/puits, en plaques bien 96 (Figure 2 a). Après une culture, les cardiomyocytes trouvées bien attaché à la surface recouverte de plastique et il y avait très peu de cellules seules (les seules cellules apparaît toujours aussi rond et brillant, par rapport à des cellules saines, ci-joint qui sont spreadout) () Figure 2 a et B). À ce stade, cardiomyocytes spontanément contractants étaient facilement visibles. Une densité de semis de 30 x 103 cellules/puits a montré de confluence, un jour après le semis, car les cellules se propagent. Comme le nombre de rondes (mortes) était très faible, ces résultats ont montré que le protocole donne la viabilité cellulaire élevée des cardiomyocytes. Cardiomyocytes étaient immunomarquage avec un anticorps dirigé contre le sarcomère α-actinine, un marqueur spécifique de cardiomyocyte18 comme preuve de cette déclaration. Comme illustré à la Figure 2, la plupart des cellules ont montré une coloration positive de le α-actinine, montrant la grande pureté de l’isolement du cardiomyocyte.
Un schéma d’un test de stress mitochondrial typique est montré à la Figure 3. Le test de stress mitochondrial commence avec une mesure de base du taux de consommation d’oxygène (OCR). Il est suivi par l’injection de l’oligomycine, qui inhibe l’ATPase. La différence avant et après l’oligomycine injection montre l’OCR liées à la production d’ATP. Ensuite, l’agent découplante FCCP a été injecté pour mesurer le taux de consommation maximale d’oxygène. Rechange capacité respiratoire peut être calculée comme la différence entre la base et l’OCR maximale. Enfin, avec l’injection de deux inhibiteurs de complexes de transport d’électrons (l’antimycine A et la roténone), la respiration mitochondriale s’arrête complètement et OCR diminue à son plus bas niveau. En bloquant l’activité mitochondriale, à ce niveau, la consommation d’oxygène est non-mitochondriale. La respiration de base, fuite de protons et la respiration maximale peuvent être calculées comme la différence entre la respiration mitochondriale-non (OCR en présence de l’antimycine A et la roténone) et mesure de base, OCR en présence de l’oligomycine et OCR dans le présence de FCCP, respectivement.
Dans cette étude, les OCR analyse a été réalisée à l’aide d’un système d’analyseur de flux extracellulaire format 96 puits un jour après l’isolement cellulaire. En outre, pour tester l’effet de la privation de sérum sur roc, trois heures avant l’essai, les milieux de culture cellulaire ont été changés aux milieux de croissance de culture cellulaire ordinaire avec du sérum, ou sans le sérum. Après la course, les données de mesure OCR 1 jusqu'à 12 pour chaque bien, ont été exportées vers une feuille de calcul pour la tenue des dossiers et une analyse plus approfondie. Caractéristiques métaboliques ont été déterminés comme suit :
La respiration mitochondriale-non = OCR moyenne (10, 11, 12)
La respiration de base = moyenne OCR (1, 2, 3)-moyenne OCR (10, 11, 12)
La production d’ATP = moyenne OCR (1, 2, 3)-moyenne OCR (4, 5, 6)
Fuite de protons = moyenne OCR (4, 5, 6) - moyenne OCR (10, 11, 12)
La respiration maximale = moyenne OCR (7, 8, 9) - moyenne OCR (10, 11, 12)
Comme le montre la Figure 4 a, valeurs OCR ont été facilement analysés, et les effets des composés injectées étaient eux aussi évidents. Ce qui est important, la variation de puits à puits était faible comme le montre l’écart-type. Augmenter dans la cellule numéro a donné lieu à la mesure de référence accrue, l’Oligomycine et respiration FCCP traités. Par rapport aux cellules de sérum affamé, OCR était plus élevée dans les cellules analysées ont été incubées avec les milieux de culture. Comme le montre la Figure 4 b, OCR est présenté comme la respiration de base, fuite de protons (Oligo) et la respiration maximale (FCCP) par 1 x 104 cellules. OCR par 10 x 103 cellules était plus élevé dans la densité de semis de 20 K et 30 K cellules/puits que celui des cellules/puits de 10 K. Comme le montre la Figure 4, en exprimant les OCR par rapport à la respiration de base, la relative fuite de OCR de protons (Oligo) et maximale (FCCP) montrent des valeurs similaires entre les milieux de culture et sérum affamé groupes. Ces résultats suggèrent que la densité de semis n’affectent pas la capacité oxydative de proton relative fuite et maximale.
Dans l’ensemble, en utilisant ce protocole, avec d’excellents rendements de cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris ont été avec succès isolé et cultivé. OCR peut être évaluée à l’aide de ces myocytes dans un analyseur de flux extracellulaire. Les résultats montrent également que la densité de semis n’affectent pas significativement OCR calculée par le nombre de cellules. Cependant, la privation de sérum à court terme (3 h) diminue OCR. L’information est utile pour tester la souris néonatales cardiomyocytes OCR avec diverses conditions expérimentales.
Figure 1 : isolement et culture des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris nouveau-nées jour 0. (A) chez les nouveau-nés sont euthanasiés, et le cœur est disséqué de la cage thoracique. (B) cœurs sont lavés dans HBSS (sans Ca2 +, Mg2 +). (C) chaque coeur est coupé en 8 morceaux. Coeurs (D) sont déplacés vers une plaque 6 puits remplie de HBSS. Cœurs sont lavés à l’aide d’une cuillère de Moria pour les transférer d’un puits à un puits. (E) cœurs sont pré-digéré en trypsine-HBSS à 4 ° C avec agitation douce. (F) Predigested coeur tissu après 4 h d’incubation à 4 ° C. (G) les tissus du coeur après digestion de collagénase de 10 min. (H) collagénase digéré coeur tissus sont triturés. (j’ai) isolé des cardiomyocytes ont été filtrés à travers un tamis de cellule. (J) Cardiomyocytes sont granulées par centrifugation. Collagénase (K) et milieux de culture sont enlevées par aspiration. (L) Cardiomyocytes sont remises en suspension dans un milieu de culture fraîche. (M) Cardiomyocytes sont cultivées dans un plat en plastique de 10 cm pour l’électrodéposition avant. (N) un image représentative des cardiomyocytes (cellules rondes et brillantes) après 1 h de placage à l’avant. (O) après un placage à l’avant, puis suppression des cardiomyocytes non adhérents, restant des cellules qui sont en général les fibroblastes et les cellules endothéliales sont visibles. (P) placage cardiomyocytes dans une plaque de 96 puits. (Q) chargement de réactifs dans les ports d’injection de cartouche de sonde. (R) cartouche de sonde de Putting dans une machine d’analyseur de flux extracellulaire. Echelle = 0,1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Culture de cardiomyocytes sur plaque à 96 puits analyseur flux extracellulaire. (A) les images représentatives des cardiomyocytes en plaques 96 puits avec des densités de cellule indiquée, immédiatement après l’ensemencement (ligne supérieure) ou 18 h post semis (rangée inférieure). (B) une image de grossissement supérieur de cardiomyocytes 18 h post semis à une densité cellulaire de 10 x 103 cellules/puits. Cardiomyocytes (C) ont été colorées avec les anticorps anti-sarcomère α-actinine (vert) et DAPI (comme une souillure nucléaire) (bleus). Echelle = 0,1 mm. Les méthodes utilisées pour immunostaining trouvera dans notre précédente publication18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Représentation schématique des mitochondries stress test. Paramètres bioénergétiques, y compris les noyaux, respiration liée à l’ATP, maximale et Non-mitochondrial ainsi que capacités respiratoires et fuite de protons, figurent sur la trace avec effecteurs mitochondriales correspondantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : test de stress Mitochondrial. (A) le traçage représentatif des taux de consommation d’oxygène (OCR, en pmol/min) de souris néonatales cardiomyocytes. À la fois, l’oligomycine (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), et on a injecté de RAA (roténone et l’antimycine A, 1 µM de chaque). Pour chaque mesure, la moyenne et l’écart-type de la moyenne (SEM) de 10 puits individuels est présenté. OCR (B) est calculé comme la respiration basale, Oligo (fuite de protons) et FCCP (respiration maximale) par 10 x 103 cellules. OCR (C) est exprimé par rapport à la respiration de base. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom du réactif et solution | Préparation | Notes |
| Solution de trypsine prédigestion | Dissoudre la trypsine dans HBSS (sans Ca2 + et Mg2 +). Concentration finale est de 0,5 mg/mL. Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. | Font de prédigestion solution le jour de l’expérience. |
| Solution de digestion de collagénase | Dissoudre la trypsine dans HBSS (sans Ca2 + et Mg2 +). Concentration finale est de 0,5 mg/mL. Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. | Solution de digestion de collagénase effectuez le jour de l’expérience. |
| Milieux de culture cardiomyocyte | Mélanger 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de sérum de cheval et 12,5 mL de FBS. Compléter avec la pénicilline 1 % et 1 % solution de streptomycine. | Milieux de culture des myocytes cardiaques peuvent être faite avant l’expérience et être conservé à 4 ° C pendant un mois. |
| Mitochondrial test d’effort moyen | Tout d’abord, faire 1 L de milieu DMEM sans n’importe quel pyruvate de sodium, L-glutamine, de glucose et Hepes, filtrer pour stériliser et stocker à 4 ° C. Le jour du test, ajouter le pyruvate de sodium, L-glutamine, de glucose et Hepes. Ajuster le pH à 7,4 avant utilisation (stérilisation n’est pas nécessaire). | Concentration finale des suppléments suivent : pyruvate de sodium (1 mM), L-glutamine (2 mM), glucose (10 mM) et Hepes (2 mM) |
| L’Oligomycine stock | Dissoudre l’oligomycine dans le DMSO. Tout d’abord, préparer les 5 mL de solution mère. Une fois que l’oligomycine est complètement dissoute dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits, conserver à-20 ° C. | Le jour du test, prendre une aliquote à utiliser. Éviter les nombreux cycles de gel-dégel. |
| Stock FCCP | Dissoudre le FCCP dans le DMSO. Tout d’abord, préparer les 5 mL de solution mère. Concentration finale est de 5 mM. Une fois que le FCCP est complètement dissoute dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits, conserver à-20 ° C. | Le jour du test, prendre une aliquote à utiliser. Éviter les nombreux cycles de gel-dégel. |
| Stock d’Antimycine A | Dissoudre l’antimycine A dans le DMSO. Tout d’abord, préparer les 5 mL de solution mère. Concentration finale est de 5 mM. Une fois l’antimycine A dissoudre dans le DMSO, font 250 µL d’extraits, conserver à-20 ° C. | Le jour du test, prendre une aliquote à utiliser. Éviter les nombreux cycles de gel-dégel. |
| Stock de roténone | Dissoudre la roténone dans le DMSO. Tout d’abord, préparer les 5 mL de solution mère. Concentration finale est de 5 mM. Une fois que la roténone est complètement dissoute dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits, conserver à-20 ° C. | Le jour du test, prendre une aliquote à utiliser. Éviter les nombreux cycles de gel-dégel. |
| Solution de revêtement plaque Cell culture | Tout d’abord, faire 200 mL de solution de gélatine de 0,5 %. Dissoudre la gélatine dans du PBS et autoclave. Le jour de l’expérience, ajouter 50 µL de solution de la fibronectine dans 5 mL de solution de gélatine pour faire la solution de revêtement. | 0,5 % gélatine solution peut être conservée à température ambiante pendant 2 mois. |
Tableau 1 : Réactifs et solutions.
| Orifice d’injection | Composés et concentration | Volume injecté au cours de l’exécution (µl) | Concentration finale dans le dosage |
| A | Oligomycine 16 µM | 25 | 2 ΜM |
| B | FCCP 9 ΜM | 25 | 1 ΜM |
| C | Roténone 20 µM (Rot) et 20 µM l’antimycine A (AA) |
25 | 2 µM de chacun |
Tableau 2 : Mélanges d’Injection.
| Étapes et procédures | Mesures et boucles |
| Calibration | - |
| Équilibration | - |
| Mesure de référence | 3 fois : mélanger 3 min, attendre 2 min, 3 min de mesurer |
| Injecter un (Oligomycine) le Port | - |
| Mesures | 3 fois : mélanger 3 min, attendre 2 min, 3 min de mesurer |
| Injecter le Port B (FCCP) | - |
| Mesures | 3 fois : mélanger 3 min, attendre 2 min, 3 min de mesurer |
| Injecter le Port C (RAA) | - |
| Mesures | 3 fois : mélanger 3 min, attendre 2 min, 3 min de mesurer |
Tableau 3 : Programme analyseur de flux extracellulaire.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons établi un protocole simple pour isoler et à cultiver des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris. En utilisant ces cardiomyocytes, nous avons également optimisé les conditions pour mesurer le taux de consommation d’oxygène à l’aide d’un système d’analyseur de flux extracellulaire. Le protocole permet d’utiliser des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris comme système modèle pour examiner la façon dont les différents facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène dans les cellules de travail principal du cœur, semblable à ce qui pourrait être mesuré dans l’organe intact. Notre protocole est différent de protocoles précédemment publiés16,18. Tout d’abord, pour parvenir à la viabilité élevée, seuls petits immédiatement à la naissance sont utilisées (c'est-à-dire P0), au lieu de celles de zéro à trois jours d’âge (chiots de P0 à P3), qui sont couramment utilisés dans les autres protocoles16,19. En second lieu, pour réduire le temps de l’expérience, coeurs seulement ont préalablement macérés avec la trypsine pendant 4 h. En outre, pour simplifier la procédure et obtenir des résultats reproductibles, nous avons utilisé un nombre minimum d’étapes, comme indiqué. Par exemple, notre protocole utilise seulement deux types de tampons, PBS et HBSS et qu’un seul type de milieux de culture cellulaire et n’emploie pas d’agitation pendant la digestion de collagénase.
Pour atteindre la grande viabilité des cardiomyocytes souris néonatales, ce qui est importants pour la reproductibilité du test de l’OCR, il y a plusieurs points critiques. Tout d’abord, à l’aide de nouveau-nés P0 et effectuant la prédigestion de la trypsine et de la digestion de collagénase le jour même sont essentielle pour parvenir à la viabilité de haute. En second lieu, lors de la digestion de collagénase, il n’est pas recommandé d’agiter le tissu cardiaque dans le bain-marie à 37 ° C. Bien que l’agitation est suggérée dans de nombreux protocoles, nous avons constaté que ce n’est pas nécessaire car P0 coeurs sont faciles à être digérées par la collagénase. Enfin, trituration doucement le tissu cardiaque est essentiel de dissocier les cardiomyocytes après digestion de collagénase.
Nous avons également testé myocytes des tissus cardiaques chiot de P1 et P2, utilisant le même protocole. Toutefois, pour ces exemples de cœur plus âgés, nous avons trouvé qu'il est nécessaire d’effectuer la trypsine prédigestion pendant la nuit pour atteindre des rendements suffisant de cellule (données non présentées). En outre, la viabilité des cellules pour P1 et P2 cardiomyocytes avoisinait les 60 %, semblable à ce que dans d’autres études16a publié. Ces résultats suggèrent que le myocarde P0 a relativement plus faibles quantités de matrice extracellulaire que les coeurs plus âgés, qui permet à des temps plus courts de prédigestion trypsine, ayant pour résultat la viabilité cellulaire plus élevée et les rendements de ces jeunes cœurs.
Analyse de flux extracellulaire (XF) est devenue une méthode importante et populaire pour évaluer la fonction bioénergétique dans les cellules et les mitochondries isolées20,21. A ce jour, un certain nombre d’études utilisés rat néonatal cardiomyocytes et mesuré la consommation d’oxygène, à l’aide d’un système de Agilent XF2422,23,24 . Ces études utilisant des cellules de rat par opposition aux cellules dérivées de la souris, ont été effectuées sans doute comme les cellules de rat ont généralement la viabilité cellulaire plus élevée et la reproductibilité de l’essai, par rapport aux souris les myocytes cardiaques étudiés ici. Étant donné que les animaux génétiquement modifiés ont principalement été générées dans les lignées de souris, un protocole simple et reproductible pour l’analyse bioénergétique fonction dans les cardiomyocytes neonatal de souris, alors que nous discutons dans ce manuscrit, offre la possibilité d’étudier fonction mitochondriale dans les myocytes cardiaques de souris. Cette méthode peut se traduire plus facilement aux données qui peuvent conduire à la compréhension de nouveaux mécanismes de règlement bioénergétique au cœur, à l’aide de nouveaux ou existants de souris génétiquement manipulées lignes25,26.
Dans cette étude, nous avons testé l’effet du nombre de cellules et de la densité sur l’OCR. Comme le montre la Figure 4 b, OCR mesurée dans les puits avec 10 x 103, 20 x 103et 30 x 103 cellules/puits, était similaire. Étant donné que le placage 30 x 103 cellules/puits produit un puits confluent dans la journée après l’ensemencement, il est recommandé de fractionnement de cellules entre 10 x 103 30 x 103 cellules/puits dans une plaque à 96 puits, pour le dosage de l’OCR. Fait intéressant, nous avons trouvé 3 h de sérum ont diminué l’OCR. Facteurs de croissance sont connus pour activer glycolyse et augmenter la consommation de l’oxygène27. Il a également été signalé que les facteurs de croissance augmenter globalement l’activité cellulaire et la contraction des cardiomyocytes3,28. Cardiomyocyte contraction nécessite ATP génération2, qui dépend de la consommation d’oxygène. Par conséquent, ces données suggèrent que le sérum diminue la consommation d’oxygène par inactivation des cardiomyocytes. Nous vous recommandons de tester l’effet de la privation de sérum sur OCR dans son propre cadre expérimental.
Comme mentionné, les mitochondries jouent un rôle clé dans la fonction cardiaque. Par conséquent, identifier les nouveaux régulateurs et les voies de régulation du métabolisme oxydatif pourrait fournir un moyen d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’insuffisance cardiaque. Un format 96 puits prévoyant la possibilité de tester un grand nombre d’essais par rapport à un format de 24 puits, ce protocole pourrait également être facilement adapté à un écran à haut débit pour l’identification des nouveaux régulateurs bioénergétiques dans les cardiomyocytes29 . Ainsi, en combinant notre protocole avec génétiquement manipulé des cardiomyocytes néonatales, telles que celles qui ont des mutations mitochondriales30, pourrait fournir des études intéressantes pour les effets des composés chimiques ou de banques d’ADNc, sur OCR dans l’écran cardiomyocytes métaboliquement défectueux sauvage vs. .
Nous sommes conscients que les cardiomyocytes néonatals et adultes ont beaucoup de différentes caractéristiques et de fonctions métaboliques31, y compris les niveaux d’expression de glucose et acides gras, enzymes métaboliques32. Par conséquent, idéalement pour utiliser les cardiomyocytes cultivés in vitro comme un système modèle de coeur intact, il serait important de développer un protocole pour analyser efficacement les OCR dans les cardiomyocytes adultes, afin qu’on pourrait comparer leur capacité oxydative et caractéristiques avec des cardiomyocytes néonatales. Futures études devront être poursuivies pour adapter cette méthode à un système reproductible à l’aide de myocytes cardiaques adultes.
En résumé, nous montrent un protocole simple et reproductible permettant d’analyser la consommation d’oxygène à l’aide des cardiomyocytes cultivés primaires de souris souris néonatales. En utilisant ce protocole, nous pourrions avec succès isoler et culture souris néonatales cardiomyocytes et effectuer ce dosage d’OCR à l’aide d’un système d’analyseur de flux extracellulaire format 96 puits. Notre protocole donne grande viabilité et, surtout, des résultats toujours reproductibles. Bien que la présente étude se concentre principalement sur la consommation d’oxygène et une épreuve d’effort mitochondriale, le protocole pourrait être facilement adapté pour analyser l’oxydation des acides gras et la glycolyse dans les cardiomyocytes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres de laboratoire de Murphy et laboratoire de Ross. Ce travail est soutenu par les American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) et VA du mérite (BX003260) à R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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