Summary
Målet med denne protokol er at illustrere, hvordan du bruger musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i hjertet.
Abstract
Mitokondrier og oxidative metabolisme er afgørende for at opretholde hjerte muskelfunktion. Forskning har vist, at mitokondriel dysfunktion er en vigtig medvirkende faktor til nedsat hjertefunktion fundet i hjertesvigt. Derimod kan genoprette defekte mitokondrie funktion have gavnlige effekter til at forbedre hjertefunktion i svigtende hjerte. Derfor, at studere de reguleringsmekanismer og identificere roman regulatorer til mitokondrie funktion kunne give indsigt, som kunne bruges til at udvikle nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme. Her, er hjerte myocyte mitokondrie respiration analyseret ved hjælp af en unik celle kultur system. Først, en protokol er optimeret, så hurtigt isolere og kultur høj rentabilitet neonatal mus cardiomyocytes. Derefter, en 96-brønds format ekstracellulære flux analyzer bruges til at vurdere ilt forbrug på disse cardiomyocytes. For denne protokol, vi optimeret såning betingelser og demonstreret at neonatal mus cardiomyocytes ilt forbrugssats kan vurderes let i en ekstracellulære flux analyzer. Endelig, vi konstatere, at vores protokol kan anvendes til en større størrelse, kultur og andre undersøgelser, såsom intracellulær signalering og kontraktile fungere analyse.
Introduction
For at opretholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunktion, skal cardiomyocytes opretholde et konstant tilførsel af cellulære energi primært i form af ATP1. I hjertet, er ca. 95% af ATP genereret af mitokondrier, hovedsagelig gennem oxidativ fosforylering, viser, at mitokondrier spiller en afgørende bioenergetic rolle i hjertefunktion2,3. Støtte til dette begreb er der dysregulering af mitokondrie-funktionen kan føre til kardiomyopati og hjertesvigt4,5. Omvendt, genoprette mitokondrie funktion har vist at forbedre hjertefunktion af svigtende hjerte6,7. Derfor, at studere mekanismen af mitokondrie bioenergetik og identificere roman regulatorer af mitokondrie-funktionen i cardiomyocytes vil ikke kun afsløre mekanistiske indblik i hjertets energiproduktion men også kunne give indsigt, der vil føre til udvikling af nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme6,8.
I forhold til hele hjertet, som indeholder en blanding af myocytes og ikke-myocytes9, cardiomyocyte kulturer er meget ren, med minimal forurening af ikke-myocytes fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. Desuden isolerer cardiomyocytes fra neonatal pups muliggør dyrkning af et stort antal celler i en lille mængde af tid, sammenlignet med isolerende celler fra voksne hjerter10,11. Vigtigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse tid (f.eks. 24 h) og på længere tid punkter at differentiere. Neonatal mus cardiomyocytes kan overleve og manipuleres til op til 7 dage i kultur, hvilket gør dem ideelle til afprøvning af virkningerne af narkotika forbindelser og genmanipulation på funktionen af mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, der er væsentlige biologiske forskelle mellem de voksne og neonatal celler, men den længere varighed for kultur af neonatal celler gør dem velegnet til mange forskellige typer af undersøgelser, herunder de af mitokondrie funktion.
Til dato, har primære kulturperler neonatal mus og rotter cardiomyocytes været brugt som modeller til at undersøge hjertets bioenergetik12,13. I de seneste år brugt undersøgelser en ekstracellulære flux analyzer til at måle ilt forbrugssats (OCR) og evaluere oxidative kapacitet i mus og rotter neonatal cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, mus neonatal cardiomyocytes celle levedygtighed er lavere og har større variabilitet16. Også gør mulighed for at studere celler fra genetisk modificerede musemodeller musen celle model meget vigtigt. OCR undersøgelser er så følsomme over for celle nummer og såning tæthed, er udvikling af en reproducerbar, pålidelig og enkel protokol til at opnå ensartede celle udbytte og levedygtighed nødvendig.
Her rapporterer vi en optimeret protokol, der er blevet udviklet som bruger kulturperler mus neonatal cardiomyocytes sammen med en 96-brønd-format ekstracellulære flux analyzer for OCR analyse. Denne protokol øger reproducerbarhed af analysen. Derudover protokollen ikke kun giver en roman og reproducerbar metode til OCR analyse, men også kunne blive tilpasset til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, som den, der kan være behov for at undersøge myofibrillar funktioner og intracellulære signalering veje.
Især beskriver denne protokol en endags-procedure for isolation og kultur af neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønd celle kultur plade. Derudover beskriver det procedure for at måle iltforbrug ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer. Alle løsninger bruges er sterile eller sterile filtreret. Alle værktøjer er steriliseret ved 75% ethanol. Vi leverer en Tabel af materialer til forskellige dele af proceduren. Til dyrkning af cardiomyocytes, udføres alle procedurer og trin i en standard celle kultur hætte. Denne protokol er udviklet til isolering af neonatal mus hjerter fra et kuld (ca 8-10 unger). Protokollen kan dog også være tilpasset til at isolere cardiomyocytes fra flere kuld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For arbejde med neonatal mus, henvises til lokale Universitetsinstitut retningslinjer sæt frem af dyrs pleje programmer og overholde ens institutionelle og andre relevante bestemmelser. Alle metoder, der beskrives i denne protokol er blevet godkendt af UC San Diego institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og overholde føderale og statslige regulativer.
1. forberedelse af reagenser
- Forberede 25 mL før fordøjelsen løsning: HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +) suppleret med trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisere den løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter og holde på køl indtil brug. Gør præ fordøjelsen løsning på dagen af forsøget.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge HBSS uden Ca2 + og Mg2 +, som Ca2 + og Mg2 + vil forårsage myocyte kontraktion og efterfølgende celledød i isolation. - Forberede 30 mL collagenase fordøjelsen buffer: collagenase (0,8 mg/mL, ca 350 U/mL) opløses i HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +) buffer. Sterilisere den løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter og holde på køl indtil brug. Gøre collagenase fordøjelsen løsning på dagen af forsøget.
- Forberede 500 mL af cardiomyocyte kultur medier (vækst medier): 375 mL af DMEM, 125 mL af M-199, 25 mL af hest serum og 12,5 mL FBS. Supplere med 1% penicillin og 1% streptomycin løsning.
- Forberede mitokondrie stresstest medium: gøre 200 mL af DMEM baseret stress test-mediet (DMEM uden NaHCO3, se Tabel af materialer) suppleret med 1 mM natrium pyruvat, 2 mM L-glutamin, og 10 mM glukose og 2 mM Hepes.
Bemærk: Gøre 1 L af medium med DMEM uden natrium pyruvat, L-glutamin, glucose og Hepes, filer steril, og gemme i 4 ° C. Forbered stress test-mediet på dag i analysen ved at tilføje andre reagenser. Ved hjælp af DMEM er medium uden NaHCO3 kritisk. - Justere pH af mitokondrie stresstest medier til 7.4 på dagen for brug. Varm medier til 37 ° C før brug.
- Forberede oligomycinets: forberede 5 mL af en 5 mM stamopløsning i DMSO og gøre 250 µL delprøver opbevares ved-20 ° C.
- Forberede FCCP: forberede 5 mL af en 5 mM stamopløsning i DMSO og gøre 250 µL delprøver opbevares ved-20 ° C.
- Forberede antimycin A: forberede 5 mL af en 5 mM stamopløsning i DMSO og gøre 250 µL delprøver opbevares ved-20 ° C.
- Forberede rotenon: forberede 5 mL af en 5 mM stamopløsning i DMSO og gøre 250 µL delprøver opbevares ved-20 ° C.
Bemærk: Alle reagenser og løsninger, der anvendes i denne protokol er angivet i tabel 1.
2. høst og pre fordøjelsen af hjerter fra Neonatal mus (dag 1)
- Autoklave saks, pincet og en Moria ske at sterilisere.
- Udføre alle trinene i celle kultur hood for sterilitet.
- Alikvot 5 mL af HBSS (uden Ca2 +, Mg2 +) til hvert hul i en 6-godt celle kultur plade; Anbring på is. Alikvot 10 mL af HBSS i en 10 cm celle kultur skål.
- Forberede 20 mL trypsin pre fordøjelsen løsning i et 50 mL sterilt koniske rør. Holde alle løsninger på is.
- Hurtigt dyppe nyfødte (dag 0) mus i 70% ethanol løsning for sterilisation.
- Hug hovedet af hvalpe ved hjælp af steril saks (lige) uden bedøvelse, og derefter åbne brystet langs brystbenet at give adgang til brysthulen og hjertet. (Figur 1A)
Bemærk: 1) det er vigtigt at bruge P0 neonatal mus til at opnå høj cellernes levedygtighed. 2) denne eutanasi metode er tilladt for nyfødte i henhold til NIH og Amerikaner Veterinary lægeundersøgelse forening retningslinjer 17. - Uddrag hjerter fra kroppen med et fin saks og overførsel straks i sterile celle kultur skål indeholdende HBSS (uden Ca2 +, Mg2 +) (figur 1B).
- Fjerne eventuelle resterende lungevæv, større fartøjer, etc. (og forkamre, hvis det ønskes). Vask hjerter i HBSS løsning ved hjælp af blide agitation.
- Skær hvert hjerte med et fin saks i 8 stykker og overføre alle hjertet væv med pincet i en brønd på en 6-godt celle kultur plade med HBSS (figur 1 c og 1 D).
- Vask hjerter ved at overføre hjerter fra godt til godt i 6-godt tallerken fyldt med HBSS, ved hjælp af en Moria skeen (fig. 1 d).
Bemærk: Overføre hjerter fra godt til godt er nok til at vaske ud af blodet. Da blodet forstyrrer enzymatisk fordøjelsen er det vigtigt at vaske hjerter med HBSS og fjerne blod. - Overføre hjerter med en Moria skeen ind i en konisk rør indeholdende 20 mL trypsin (0,5 mg/mL) og inkuberes med blid agitation ved 4° C for 4 h (figur 1E).
3. Forbered en 96-og kultur plade (dag 1)
- Forberede 5 mL af belægning løsning: PBS indeholdende 0,5% gelatine (autoklave før brug) og 1% fibronektin løsning. (f.eks. 5 mL gelatine løsning plus 50 µL af fibronektin løsning)
- Alikvot 50 µL af belægning løsning i hver brønd i 96-brønd celle kultur plade (Se Tabel af materialer). Hvis bobler er til stede, skal du fjerne dem ved hjælp af en 20 µL pipette til at suge bobler ud.
Bemærk: Det er vigtigt at dække alle areal i hver brønd med belægning løsning. - Inkuber pladen i et 37 ° C celle kultur inkubator for 1 time eller mere for at give mulighed for tørring af matrix belægning.
- Opsug enhver resterende belægning løsning før såning cardiomyocytes.
4. Enzymatisk nedbrydning og klædningen af celler (dag 1)
- Pre varm collagenase fordøjelsen løsning i et 37 ° C vandbad.
Bemærk: Dette trin er vigtigt at opnå effektiv Enzymatisk nedbrydning. - Flytte den koniske rør indeholdende hjerter og pre fordøjelsen løsning fra 4 ° C til en celle kultur hætte. (Figur 1F)
- Lad hjerter synker til bunden af røret og fjerne præ fordøjelsen løsning ved hjælp af 10 mL serologisk pipette (1-2 mL af isolation medium kan forblive i røret).
- Der tilsættes 10 mL af HBSS ind i røret. Genopslæmmes hjerter med HBSS 2 - 3 gange at udviske trypsin ved hjælp af 10 mL serologisk pipette. Opsug HBSS (1-2 mL kan forblive i røret).
- Tilsættes 10 mL pre varmede collagenase fordøjelsen ind i røret med hjerter. (Figur 1 g)
- Inkuber tube med hjerter i et 37 ° C vandbad i 10 min uden ophidselse (1. fordøjelse).
- Efter 1. fordøjelse, flytte røret til celle kultur hætte. Forsigtigt hakkede hjerter ved igen at suspendere hjerter i røret forsigtigt 10 gange med 10 mL serologisk pipette. Dette vil tillade hjerter til at sprede og celler til at blive frigivet fra hjertet væv. (Figur 1 H)
Bemærk: Da cardiomyocytes er skrøbelige, er blid ændring vigtigt at opnå en høj rentabilitet. - Lad den ufordøjede væv synke, overføre fordøjede opløsning beriget med cardiomyocytes (ca. 9-10 mL) til en ny koniske rør og straks tilføje en lige stor del af celle kultur medier at stoppe collagenase fordøjelsen.
- Tilsættes 10 mL collagenase fordøjelsen ind i røret, der indeholder den resterende ufordøjet hjerte væv.
- Inkuber tube med hjerte væv i et 37 ° C vandbad i 10 min (2nd fordøjelsen).
- Gentag proceduren 4.7 og 4.8.
Bemærk: Hvis der er stadig meget ufordøjet væv, Gentag fordøjelsen endnu en gang. Men i de fleste tilfælde to digestions er nok til at sprede de fleste af cellerne fra hjertet væv. - Placer en steril celle-si (100 µm nylon mesh) i en ny steril 50 mL konisk slange. Pre våd celle si med 2-3 mL af celle kultur medier og passere celler gennem celle-si. Skyl celle-si med 2-3 mL af celle kultur medier. (Figur 1I)
- Der centrifugeres koniske rør indeholdende cardiomyocytes for 5 min på 180 x g (figur 1J). Opsug supernatanten (figur 1 K), som vil indeholde celle væv debris og genopslæmmes celle toerstoffet i 10 mL af celle kultur medier (figur 1 L).
- Forsigtigt resuspend celler og plade celler på en 10 cm celle kultur parabol (plast uden nogen form for belægning) og Inkuber i 1 time i en celle kultur inkubator (1st før plating) (figur 1 M). Trinnet før plating tillader ikke-cardiomyocytes, såsom fibroblaster og endotelceller, til at tiltræde ubestrøget cellekultur parabol.
Bemærk: På dette tidspunkt cardiomyocytes er typisk en rund form og vises skinnende under mikroskop. (Figur 1N). - Efter inkubationen 1 h forsigtigt agitere pladen, vaske ikke-tilhænger celler (beriget med cardiomyocytes) fra 10 cm kultur parabol, og genopslæmmes celler af gentagne gange pipettering cellekulturmedium over fadet ved hjælp af 10 mL serologisk pipette. Derefter, overføre ikke-tilhænger celler (beriget med cardiomyocytes) ind i en ny 10 cm celle kultur parabol (plast uden nogen belægning) og inkuberes i en yderligere 1 time i en celle kultur inkubator (2nd før plating).
Bemærk: Celler, der tillægger den ikke-belagt plade er overvejende ikke-cardiomyocytes: fibroblaster og endotelceller, som kan visualiseres under et mikroskop (figur 1O). - Efter 2 før plating, forsigtigt agitere pladen, vaske ikke-tilhænger celler (cardiomyocytes) fra 10 cm kultur parabol, derefter overføre cardiomyocytes ind i en ny 50 mL konisk rør.
5. tælle celler og Plating celler ind i en 96-brønd celle kultur plade (dag 1)
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Plade cellerne i en ekstracellulære matrix belagt 96-brønd celle kultur plade med en tæthed mellem 10-30 x 103 celler/brønd ved hjælp af en multi-kanal afpipetteres i en endelige mængden af 200 µL (figur 1 P). Bruge wells A1, A12, H1 og H12 baggrund: tilføje 200 µL af næringssubstratet som andre brønde i disse brønde (ingen celler). Inkuber pladen i et 37 ° C celle kultur inkubator.
Bemærk: I denne undersøgelse, blev iltforbrug testet ved hjælp af forskellige celle tætheder som 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/brønd. (Figur 2A). Også, som nævnt ovenfor, cardiomyocytes umiddelbart efter isolation er typisk en rund form og vises skinnende under mikroskop. Levedygtige celler vil flade ud i 16-24 h af kultur.
6. ilt forbrug Assay med en 96-brønd-format ekstracellulære Flux Analyzer (dag 2)
Bemærk: Ilt forbrug assay kan foretages dagen efter plating cellerne eller senere. Neonatal cardiomyocytes kulturperler ved hjælp af denne protokol kan overleve op til 7 dage post isolation.
- Hydrat en flux analyzer sensor patron (Se Tabel af materialer) i mindst 3 timer, men ideelt for en hel dag, før analysen. Tilføje 200 µL af kalibratoren løsning (Se Tabel af materialer) i hver brønden af nytte plade, sætte sensor patron tilbage på nytte tallerken, og Inkuber i et 37 ° C inkubator uden CO2 eller O2 tilskud.
- Ændre celle Kulturmedier til mitokondrier stresstest medium en time inden analysen. Cardiomyocytes er skrøbelige. Derfor, forsigtigt fjerne celle Kulturmedier ved hjælp af en multi-kanal pipette og vaske cellerne med 200 µL af pre varmede mitokondrie stresstest medier to gange. Efter andet vask, tilføje 175 µL af pre varmede mitokondrier stresstest medier og kultur cellerne i et 37 ° C inkubator uden CO2 eller O2 tilskud.
- Forberede koncentreret test forbindelser. Mitokondrier stresstest, forberede 3,0 mL af 16 µM oligomycinets, 9 µM FCCP og en blanding af 20 µM rotenon og 20 µM antimycin A, alle i mitokondrie stress test-mediet.
Bemærk: Hver sammensatte på koncentrationen beskrevet er blevet testet. Det er dog nødvendigt at tilsætningen koncentrationen af hvert stof i ens eget laboratorium. - Læg 25 µL af hver sammensatte i injektoren porte af sensor patronen ved hjælp af en multikanalpipette (figur 1Q). Volumen og endelige koncentration er beskrevet i tabel 2.
- Opsætning af ekstracellulære flux assay protokol. Programmet er beskrevet i tabel 3.
- Starte programmet. Første, sætte sensor patronen ind i maskinen til kalibrering (figur 1R). Erstatte kalibratoren for assay plade, når kalibrering skridt er gjort.
Bemærk: Ved hjælp af softwaren, der leveres af producenten, angive grupper af brønde og hver sammensatte og port. - Hvis det ønskes, efter analysen, omhyggeligt kassere alle assay medium ved hjælp af en multi-kanal pipette og gemme celle kultur mikrotiterplade ved-20 ° C for fremtidige celle normalisering ved hjælp af protein assay.
- Måle proteinindhold. Tilsæt 50 µL af standard RIPA celle lysis løsning (Se Tabel af materialer). Inkuber plade på isen for 30 min til helt lyse celler. Overføre alle materiale til en ny klar flad bund 96 godt assay plade.
- Måle proteinkoncentration af BCA assay efter producentens protokol.
Bemærk: Belægning godt med ekstracellulære matrix resulterer i en høj proteinkoncentration i hver brønd. Derfor trække beløb for baggrunden brønd(e) (ingen celler) at få faktiske celle proteinkoncentration. Proteinkoncentration stammer fra celler er lav i en 96-og kultur plade. Derudover kan proteinkoncentration variere fra godt at nå på grund af ekstracellulære matrix belægning. Derfor, ved hjælp af celle nummer til at normalisere OCR er foreslået.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen beskrevet, blev hjerter isoleret fra dag 0 neonatal unger. 5 x 105 celler/hvalp blev indhentet, og cardiomyocytes var seedet ved tætheder af 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/brønd, i 96 godt plader (figur 2A). Efter overnatning kultur, cardiomyocytes blev fundet godt vedlagte belagt plastic overflade, og der var meget få ikke-tilknyttede celler (løstliggende cellerne vises stadig som runde og skinnende, i forhold til de sunde, tilknyttede celler, der er spreadout) () Figur 2A og B). På dette tidspunkt var spontant ordregivende cardiomyocytes let synlige. En seeding tæthed af 30 x 103 celler/brønd viste sammenløbet én dag efter såning som cellerne spredes. Da antallet af runde (døde) celler var meget lav, viste disse resultater, at protokollen giver høj cellernes levedygtighed af cardiomyocytes. Cardiomyocytes blev immunostained med et antistof mod sarcomeric α-actinin, en cardiomyocyte specifikke markør18 som bevis for denne erklæring. Som vist i figur 2 c, viste de fleste af celler positiv farvning af α-actinin viser den høje renhed af cardiomyocyte isolation.
En ordning af en typisk mitokondrie stresstest er vist i figur 3. Mitokondrie stresstesten starter med en baseline måling af ilt forbrugssats (OCR). Dette efterfølges af indsprøjtning af oligomycinets, som hæmmer ATPase. Forskel før og efter oligomycinets injektion viser OCR knyttet til ATP produktion. Derefter, den frakobling agent FCCP blev sprøjtet til at måle maksimale oxygen forbrugssats. Ekstra respiratorisk kapacitet kan beregnes som forskellen mellem basal og maksimal OCR. Endelig, med indsprøjtning af to elektron transport kompleks hæmmere (antimycin A og rotenon), mitokondrie respiration stopper helt, og OCR falder til det laveste niveau. Ved at blokere mitokondrie-aktivitet, på dette niveau, er iltforbrug ikke-mitokondrie. Basal respiration, proton lækage og maksimal åndedræt kan beregnes som forskellen mellem ikke-mitokondrie respiration (OCR antimycin A og rotenon) og basismåling, OCR i overværelse af oligomycinets og OCR i den tilstedeværelsen af FCCP, henholdsvis.
I denne undersøgelse, blev OCR analyse udført ved hjælp af en 96-brønds format ekstracellulære flux analyzer system en dag efter celle isolation. Derudover for at teste effekten af serum sult på OCR, tre timer før analysen, celle Kulturmedier blev ændret til regelmæssig celle kultur vækst medier med serum eller uden serum. Efter flugt, blev OCR måledata 1 indtil 12 for hver godt, eksporteret til et regneark til registrering og yderligere analyse. Metaboliske egenskaber blev fastsat som følger:
Non-mitokondrie respiration = gennemsnitlige OCR (10, 11, 12)
Basal respiration = gennemsnitlig OCR (1, 2, 3)-gennemsnitlig OCR (10, 11, 12)
ATP produktion = gennemsnitlig OCR (1, 2, 3)-gennemsnitlig OCR (4, 5, 6)
Proton lækage = gennemsnitlig OCR (4, 5, 6) - gennemsnitlig OCR (10, 11, 12)
Maksimal respiration = gennemsnitlig OCR (7, 8, 9) - gennemsnitlig OCR (10, 11, 12)
Som vist i figur 4A, OCR værdier blev let analyseret, og virkningerne af injicerede forbindelser blev også indlysende. Vigtigere, variation fra godt til brønden var lille, som det fremgår af standardafvigelsen. Stigning i celle nummer resulteret i øget basismåling, oligomycinets og FCCP-behandlet respiration. I forhold til serum hungrende celler, var OCR højere i cellerne analyseres, der havde været inkuberet med vækst medier. Som vist i figur 4B, OCR er vist som basal respiration, proton lækage (Oligo) og maksimal respiration (FCCP) pr. 1 x 104 celler. OCR pr. 10 x 103 celler var højere i seeding tæthed af 20 K og 30 K celler/brønd end for 10 K celler/brønd. Som vist i figur 4 c, sultet ved at udtrykke OCR i forhold til basal respiration, den relative OCR af Proton lækage (Oligo) og maksimal (FCCP) viser lignende værdier mellem vækst medier og serum grupper. Disse resultater tyder på, at såning tæthed ikke påvirker den relative proton lækage og maksimal oxidative kapacitet.
Samlet, ved hjælp af denne protokol, fremragende udbyttet af mus neonatal cardiomyocytes blev isoleret og kulturperler. OCR kan vurderes ved hjælp af disse myocytes i en ekstracellulære flux analyzer. Resultaterne viser også, at såning tæthed ikke væsentligt påvirker OCR beregnet af celle nummer. Dog falder kort sigt (3 h) serum sult OCR. Oplysningerne er nyttige til at teste mus neonatal cardiomyocytes OCR med forskellige forsøgsbetingelser.
Figur 1: Isolation og kultur af neonatal cardiomyocytes fra dag 0 nyfødte mus. (A) nyfødte er aflivet, og hjertet er dissekeret fra brystkassen. (B) hjerter er vasket i HBSS (uden Ca2 +, Mg2 +). (C) hvert hjerte er skåret i 8 stykker. (D) hjerter er flyttet til en 6-godt tallerken fyldt med HBSS. Hjerter er vasket ved hjælp af en Moria ske for at overføre dem fra godt til godt. (E) hjerter er præ-fordøjet i Trypsin-HBSS ved 4 ° C med blid agitation. (F) Predigested hjerte væv efter 4 h inkubation ved 4 ° C. (G) hjerte væv efter 10 min collagenase fordøjelsen. (H) Collagenase fordøjet hjerte væv er triturated. (jeg) isoleret cardiomyocytes blev filtreret gennem en celle si. (J) Cardiomyocytes er pelleted ved centrifugering. (K) Collagenase og kultur medier er fjernet ved aspiration. (L) Cardiomyocytes er igen suspenderet i frisk næringssubstratet. (M) Cardiomyocytes er kulturperler i en 10 cm plastik skål til før plating. (N) A repræsentativt billede af cardiomyocytes (runde og skinnende celler) efter 1 h af før plating. (O) efter før plating og derefter fjernelse af ikke-tilhænger cardiomyocytes, resterende celler, der er typisk fibroblaster og endotelceller er synlige. (P) Plating cardiomyocytes til en 96-brønd plade. (Q) indlæsning reagenser til injektion porte af sensor patron. (R) Putting sensor patron i en ekstracellulære flux analyzer maskine. Skalalinjen = 0,1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kultur af cardiomyocytes på ekstracellulære flux analyzer 96-brønd plade. (A) repræsentative billeder af cardiomyocytes i 96-brønd plader med angivne celle tætheder, straks efter såning (øverste række) eller 18 h post såning (nederste række). (B) en højere forstørrelse billede af cardiomyocytes 18 h post såning med en celle tæthed på 10 x 103 celler/brønd. (C) Cardiomyocytes var plettet med anti-sarcomeric α-actinin antistof (grøn) og DAPI (som en nuklear plet) (blå). Skalalinjen = 0.1 mm. Metoderne til immunfarvning kan findes i vores tidligere publikation18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk fremstilling af mitokondrie stresstest. Bioenergetic parametre, herunder Basal, ATP-linked, maksimal og Non-mitokondrie åndedræt samt respiratoriske ekstrakapacitet og Proton lækage, er skitseret på spor med tilsvarende mitokondrie effektorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mitokondrie stress assay. (A) repræsentative sporing af ilt forbrug satser (OCR, i pMoles/min) i neonatal mus cardiomyocytes. På de angivne tidspunkter, oligomycinets (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), og RAA (rotenon og antimycin A, 1 µM) blev injiceret. For hver måling, er middelværdi og standardafvigelse af middelværdi (SEM) på 10 individuelle brønde præsenteret. (B) OCR beregnes som Basal respiration, Oligo (Proton lækage) og FCCP (maksimal respiration) pr. 10 x 103 celler. (C) OCR er udtrykt i forhold til basal respiration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn af reagens og løsning | Forberedelse | Noter |
| Trypsin pre fordøjelsen løsning | Opløse trypsin i HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +). Endelige koncentrationen er 0,5 mg/mL. Sterilisere den løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter og holde på køl indtil brug. | Gør præ fordøjelsen løsning på dagen af forsøget. |
| Collagenase fordøjelsen løsning | Opløse trypsin i HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +). Endelige koncentrationen er 0,5 mg/mL. Sterilisere den løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter og holde på køl indtil brug. | Gøre collagenase fordøjelsen løsning på dagen af forsøget. |
| Cardiomyocyte medier | Mix 375 mL DMEM, 125 mL af M-199, 25 mL af hest serum og 12,5 mL FBS. Supplere med 1% penicillin og 1% streptomycin løsning. | Cardiomyocyte Kulturmedier kan gøres før eksperimentet og opbevares ved 4 ° C for en måned. |
| Mitokondrie stresstest medium | Først, gør 1 L af medium med DMEM uden nogen natrium pyruvat, L-glutamin, glucose og Hepes, filtrere for at sterilisere og opbevares ved 4 ° C. På dagen for assay, tilføje natrium pyruvat, L-glutamin, glucose og Hepes. Justere pH til 7.4 før brug (Sterilisation er ikke påkrævet). | Endelig koncentration for kosttilskud er følgende: natrium pyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), glukose (10 mM) og Hepes (2 mM) |
| Oligomycinets materiel | Opløs oligomycinets i DMSO. Først, forberede 5 mL af stamopløsningen. Når oligomycinets er helt opløst i DMSO, gøre 250 µL delprøver, opbevares ved-20 ° C. | På dagen for assay, tage en alikvot at bruge. Undgå mange fryse-tø cykler. |
| FCCP materiel | Opløs FCCP i DMSO. Først, forberede 5 mL af stamopløsningen. Endelig koncentration er 5 mM. Når FCCP er helt opløst i DMSO, gøre 250 µL delprøver, opbevares ved-20 ° C. | På dagen for assay, tage en alikvot at bruge. Undgå mange fryse-tø cykler. |
| Antimycin A materiel | Opløs antimycin A i DMSO. Først, forberede 5 mL af stamopløsningen. Endelig koncentration er 5 mM. Når antimycin A er helt opløst i DMSO, 250 µL delprøver, opbevares ved-20 ° C. | På dagen for assay, tage en alikvot at bruge. Undgå mange fryse-tø cykler. |
| Rotenon lager | Opløse rotenon i DMSO. Først, forberede 5 mL af stamopløsningen. Endelig koncentration er 5 mM. Når rotenon er helt opløst i DMSO, gøre 250 µL delprøver, opbevares ved-20 ° C. | På dagen for assay, tage en alikvot at bruge. Undgå mange fryse-tø cykler. |
| Celle kultur plade belægning løsning | Du skal først 200 mL 0,5% gelatine løsning. Opløses gelatine i PBS og autoklave. På dagen for eksperiment, skal du tilføje 50 µL af fibronektin løsning i 5 mL gelatine løsning at gøre belægning løsning. | 0,5% gelatine opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 måneder. |
Tabel 1: Reagenser og løsninger.
| Injektion Port | Forbindelser og koncentration | Volumen injiceres under kørsel (µl) | Endelige koncentration i analysen |
| A | 16 µM oligomycinets | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | 20 µM rotenon (Rot) og 20 µM antimycin A (AA) |
25 | 2 µM af hver |
Tabel 2: Injektion blandinger.
| Foranstaltninger og procedurer | Målinger og sløjfer |
| Kalibrering | - |
| Ækvilibrering | - |
| Basismåling | 3 gange: Bland 3 min, vente 2 min, måle 3 min |
| Injicere Port en (oligomycinets) | - |
| Målinger | 3 gange: Bland 3 min, vente 2 min, måle 3 min |
| Injicere Port B (FCCP) | - |
| Målinger | 3 gange: Bland 3 min, vente 2 min, måle 3 min |
| Injicere Port C (RAA) | - |
| Målinger | 3 gange: Bland 3 min, vente 2 min, måle 3 min |
Tabel 3: Ekstracellulære flux analyzer program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse, har vi etableret en enkel protokol til isolering og dyrkning mus neonatal cardiomyocytes. Ved hjælp af disse cardiomyocytes, optimeret vi også betingelser at måle ilt forbrugshastigheden ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gør det muligt at bruge musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i de vigtigste arbejde celler i hjertet, beslægtet med hvad vil blive målt i intakt organ. Vores protokol er forskellig fra tidligere publicerede protokoller16,18. Først, for at opnå høj rentabilitet, eneste pups straks ved fødslen er brugt (dvs. P0), i stedet for dem fra dage nul til tre dage med alder (P0 til P3 unger), som er almindeligt anvendt i andre protokoller16,19. For det andet, for at minimere tid af eksperimentet, hjerter blev kun pre fordøjes med trypsin for 4 h. Hertil kommer, at gøre proceduren enkel og opnå reproducerbare resultater, ansat vi et minimalt antal trin, som beskrevet. For eksempel vores protokol bruger kun to typer af buffere, PBS og HBSS, og kun én type celle kultur medier, og anvender ikke agitation under collagenase fordøjelsen.
For at opnå høj rentabilitet af neonatal mus cardiomyocytes, hvilket er vigtigt for reproducerbarhed af OCR-analysen, er der flere kritiske punkter. Første, brug af P0 nyfødte unger og udfører trypsin pre fordøjelse og collagenase fordøjelsen på den samme dag er afgørende at opnå en høj rentabilitet. For det andet under collagenase fordøjelsen, er det ikke anbefales at agitere hjertet væv i 37 ° C vandbad. Selv om agitation er foreslået i mange protokoller, fandt vi, det ikke er nødvendigt, da P0 hjerter er let at blive fordøjet af collagenase. Endelig er forsigtigt triturating hjerte væv kritisk at adskille cardiomyocytes efter collagenase fordøjelsen.
Vi har også testet myocytes fra P1 og P2 pup hjerte væv, ved hjælp af den samme protokol. For disse ældre hjerte prøver fandt vi imidlertid er det nødvendigt at udføre trypsin pre fordøjelsen natten over for at opnå tilstrækkelig celle udbytter (data ikke vist). Desuden var cellernes levedygtighed for P1 og P2 cardiomyocytes omkring 60%, svarende til at i andre offentliggjort undersøgelser16. Disse resultater tyder på, at P0 myokardiet har relativt lavere mængder af ekstracellulære matrix end ældre hjerter, som giver mulighed for kortere gange for trypsin pre fordøjelsen, hvilket resulterer i højere cellernes levedygtighed og udbytter fra disse yngre hjerter.
Ekstracellulære flux (XF) analyse er blevet en stor og populær metode til at måle bioenergetic funktion i celler og isolerede mitochondrier20,21. Til dato, en række undersøgelser anvendes rotte neonatal cardiomyocytes og målt iltforbruget, ved hjælp af en Agilent XF24 system22,23,24 . Disse undersøgelser ved hjælp af rotte celler i modsætning til mus-afledte celler, blev sandsynligvis udført som rotte celler har generelt højere cellernes levedygtighed og analysen reproducerbarhed, i forhold til den mus hjerte myocytes studerede her. Eftersom genetisk modificerede dyr, der primært er genereret i mus linjer, giver en enkel og reproducerbare protokol til at analysere bioenergetic funktion i mus neonatale cardiomyocytes, som vi diskuterer i dette manuskript, muligheder for at studere mitokondrie-funktionen i mus hjerte myocytes. Denne metode kan være mere let kan oversættes til data, der kan føre til at forstå nye mekanismer for bioenergetic forordning i hjertet, ved hjælp af nye eller eksisterende genetisk manipulerede mus linjer25,26.
I denne undersøgelse, vi har testet effekten af cell antal og tætheden på OCR. Som vist i figur 4B, var OCR målt i brønde med 10 x 103, 20 x 103og 30 x 103 celler/brønd, ens. Eftersom plating 30 x 103 celler/brønd produceret en sammenflydende godt inden for én dag efter såning, anbefaler vi opdele celler mellem 30 x 103 celler/brønd i en 96-brønd plade til OCR assay 10 x 10,3 . Vi fandt interessant 3 h af serum sult faldt OCR. Vækstfaktorer er kendt for at aktivere glykolyse og øge ilt forbrug27. Blev det også rapporteret, at vækst faktorer øge samlede cellulær aktivitet og sammentrækning af cardiomyocytes3,28. Cardiomyocyte sammentrækning kræver ATP generation2, der afhænger af forbrug af ilt. Derfor, disse data tyder på, at serum sult falder iltforbrug gennem inaktivering af cardiomyocytes. Vi vil anbefale, teste effekten af serum sult på OCR i ens egne eksperimentelle indstilling.
Som nævnt, spiller mitokondrier vigtige roller i hjertefunktion. Derfor, at identificere roman regulatorer og veje regulering oxidative metabolisme kunne give et middel til at identificere nye terapeutiske mål for behandling af hjertesvigt. Da en 96 godt format giver muligheden for at afprøve et større antal test vilkår i forhold til en 24 godt format, kunne denne protokol også let tilpasses til en høj overførselshastighed skærmen for at identificere roman bioenergetic lovgivere i cardiomyocytes29 . Således, ved at kombinere vores protokol med genetisk manipuleret neonatal cardiomyocytes, såsom dem, der har mitokondrie mutationer30, kunne give interessante undersøgelser til at screene virkningerne af kemiske forbindelser eller cDNA-biblioteker, på OCR i Wild-type vs. metabolisk defekte cardiomyocytes.
Vi er klar over, at neonatal og voksne cardiomyocytes har mange forskellige karakteristika og metaboliske funktioner31, herunder udtryk niveauer af glucose og fedtsyre metaboliske enzymer32. Ideelt til at bruge in vitro-kulturperler cardiomyocytes som en modelsystem af det intakte hjerte, det ville derfor være vigtigt at udvikle en protokol for effektivt at analysere OCR i voksen cardiomyocytes, således at man kunne sammenligne deres oxidative kapacitet og egenskaber med neonatal cardiomyocytes. Fremtidige undersøgelser skal gennemføres for at tilpasse denne metode til en reproducerbar system ved hjælp af voksne hjerte myocytes.
Sammenfattende viser vi en simpel og reproducerbar protokol til at analysere forbrug af ilt ved hjælp af primære kulturperler mus neonatal mus cardiomyocytes. Ved hjælp af denne protokol, kunne vi med held isolere og kultur mus neonatal cardiomyocytes og udføre denne OCR analyse ved hjælp af en 96-brønds format ekstracellulære flux analyzer system. Vores protokol giver høj rentabilitet og vigtigere, konsekvent reproducerbare resultater. Selv om den nuværende undersøgelse er primært fokuseret på iltforbrug og en mitokondrie stresstest, kunne protokollen tilpasses nemt for at analysere fedtsyre oxidation og glykolyse i cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbejde støttes af American Heart Association (14SDG17790005) til YC NIH (HL115933, HL127806) og VA Merit (BX003260) til R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T.
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S.
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
