Summary
Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.
Abstract
Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi'nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.
Introduction
Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95'i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3' te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5' e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.
Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11' den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.
Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.
Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.
Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı--dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yenidoğan fareler ile çalışmaları için lütfen yerel üniversite/Enstitü yönergeleri ileri hayvan bakımı programlar tarafından bakın ve kişinin kurumsal ve diğer uygun düzenlemeler için uygun. Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri UC San Diego kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve federal ve eyalet düzenlemelere uygun.
1. hazırlanması reaktifler
- 25 mL öncesi sindirim çözeltisihazırlamak: tripsin (0,5 mg/mL) ile birlikte HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Öncesi sindirim çözüm deneme günü olun.
Not: HBSS Ca2 + kullanmak için önemlidir ve Mg2 +, olarak Ca2 + ve Mg2 + myocyte kasılma ve yalıtım sırasında sonraki hücre ölümüne neden olur. - 30 mL collagenase sindirimarabelleği hazırlamak: HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +) arabellekte çözünmüş collagenase (0,8 mg/mL, yaklaşık 350 U/mL). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Collagenase sindirim çözüm deneme günü olun.
- Cardiomyocyte kültürortamının (büyüme medya) 500 mL hazırlamak: Mix DMEM 375 mL, M-199 125 mL, at serum 25 mL ve FBS 12,5 mL. % 1 penisilin ve % 1 streptomisin çözüm ile ek.
- Mitokondrial stres testi ortahazırlamak: DMEM yapmak 200 mL dayalı (DMEM NaHCO3, olmadan görmek Tablo reçetesi) stres testi orta 1 mM sodyum pyruvate, 2 mM L-glutamin ve 10 mM glikoz ve 2 mM Hepes ile desteklenmiştir.
Not: Orta 1 L DMEM ile sodyum pyruvate, L-glutamine, glikoz ve Hepes, steril, filler yapmak ve 4 ° c'saklamak Stres testi orta tahlil gününde diğer ayıraçlar ekleyerek hazırlayın. DMEM kullanarak NaHCO3 olmadan orta önemlidir. - PH 7.4 medyaya mitokondrial stres testi kullanım gününde ayarlayın. Kullanmadan önce 37 ° C sıcak ortama.
- Oligomycinhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
- FCCPhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
- Antimycin Ahazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
- Rotenonhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
Not: Tüm reaktifler ve çözümleri bu protokol için kullanılan Tablo 1' de listelenmiştir.
2. hasat ve Neonatal fareler (gün 1) üzerinden kalplerin öncesi sindirim
- Otoklav makas, pens ve sterilize etmek için Moria kaşıkla.
- Hücre kültür mahalle kısırlık için tüm adımları gerçekleştirin.
- Her şey bir 6-şey hücre kültür plaka için aliquot 5 mL HBSS (olmadan Ca+ 2, Mg2 +) de; Buza koyun. HBSS aliquot 10 mL 10 cm hücre kültür çanak içine.
- 20 mL 50 mL steril konik tüp içinde tripsin öncesi sindirim çözeltisi hazırlamak. Tüm çözümler buz üzerinde tutun.
- Hızlı bir şekilde % 70 etanol çözüm sterilizasyon için yenidoğan (0 gün) farelerde daldırma.
- Steril makas (düz) anestezi kullanarak pups başını kesmek ve göğüs göğüs boşluğu ve kalp erişmesine izin vermek için göğüs kemiği boyunca açın. (Şekil 1A)
Not: 1) P0 yenidoğan fareler yüksek hücre canlılık elde etmek için kullanmak için önemlidir. 2) bu ötenazi Yöntem ventilasyon NIH ve Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum yönergeleri 17uyarınca yasaktır. - Kalpler vücuttan bir iyi makas ve transfer hemen HBSS (Ca2 +, Mg2 +) içeren steril hücre kültür çanak içine extract (Şekil 1B).
- Kaldır herhangi bir kalıntı akciğer dokusu, daha büyük gemiler, vb (ve istenirse atria,). Kalpler nazik ajitasyon kullanarak HBSS solüsyonu içinde yıkayın.
- Her kalp ince bir makasla 8 parçalar halinde kesilmiş ve tüm kalp doku 6-şey hücre kültür plaka HBSS (Şekil 1 c ve 1 D) ile bir kuyuya forseps ile aktarın.
- Kalpleri bir Moria kaşık (Şekil 1 d) kullanarak HBSS ile dolu 6-şey plaka iyi iyi kalpleri aktararak yıkayın.
Not: İyi iyi kalpleri aktarma kan yıkamak için yeterli olacaktır. Kan ile enzimatik sindirim engelleyen beri kalpler HBSS ile yıkama ve kan kaldırmak önemlidir. - Kalpleri Moria kaşıkla tripsin (0,5 mg/mL) 20 mL içeren bir konik tüp içine aktarmak ve 4 h (Şekil 1E) için 4 ° C'de nazik ajitasyon ile kuluçkaya.
3. bir 96-şey kültür plaka (gün 1) hazırlayın
- 5 mL kaplama çözeltisi hazırlamak: % 0.5 jelatin (otoklav kullanmadan önce) ve % 1 fibronektin çözüm içeren PBS. (örneğin 5 mL jelatin çözüm artı 50 µL fibronektin çözüm)
- 96-şey hücre kültür plaka her kuyuya kaplama çözümün aliquot 50 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Kabarcıklar varsa, onları dışarı kabarcıklar emmeye 20 µL pipet kullanarak kaldırın.
Not: Her şey kaplama solüsyonu ile tüm yüzey alanı kapsayacak şekilde önemlidir. - 37 ° C hücre kültür kuluçka 1 h veya matris kaplama kurutma izin vermek için daha fazla plaka kuluçkaya.
- Herhangi bir kalıntı kaplama çözüm cardiomyocytes tohum önce Aspire edin.
4. enzimatik sindirim ve kaplama hücre (1 gün)
- Collagenase sindirim çözüm 37 ° C su banyosu içinde önceden ısıtmak.
Not: Bu verimli enzimatik sindirim elde etmek önemli bir adımdır bu. - Kalpleri ve 4 ° C ön sindirim çözümden bir hücre kültür hood için içeren konik tüp taşıyın. (Şekil 1F)
- Kalpleri ve lavabo tüp altına 10 mL serolojik pipet öncesi sindirim çözüm kaldırmak izin (yalıtım orta 1-2 mL tüp kalabilir).
- HBSS 10 mL tüp içine ekleyin. Kalpler HBSS ile 2 - 3 kez yeniden askıya bir 10 mL serolojik pipet kullanarak tripsin yıkamak için. HBSS Aspire edin (1-2 mL tüp kalabilir).
- Önceden ısıtılmış collagenase sindirim çözüm 10 mL yürekleri tüp içine ekleyin. (Şekil 1G)
- Ajitasyon olmadan 10 dk 37 ° C su banyosunda yürekleri tüp kuluçkaya (1 sindirim).
- 1 sindirim sonra hücre kültür hood için tüp taşıyın. Yavaşça kalpler yavaşça 10 kat 10 mL serolojik pipet kullanarak tüp içinde kalpleri yeniden askıya tarafından triturate. Bu dağıtmak için kalpleri ve kalp dokudan var olmak serbest bırakmak hücrelere izin verir. (Şekil 1 H)
Not: Cardiomyocytes kırılgan olduğundan, nazik toz yüksek canlılık elde etmek önemlidir. - Lavabo, sindirilmiş çözüm cardiomyocytes (yaklaşık 9-10 mL) için yeni bir konik tüp içinde zenginleştirilmiş aktarmak ve hemen collagenase sindirim durdurmak için hücre kültür ortamının eşit miktarda ekleyin sindirilmemiş doku izin.
- Kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüpe 10 mL collagenase sindirim çözeltisi ekleyin.
- 10 dk 37 ° C su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçkaya (2 sindirim).
- 4.7 ve 4,8 yordamı yineleyin.
Not: Hala çok sindirilmemiş doku, sindirim bir kez daha yineleyin. Ancak, çoğu durumda, iki kesimi hücrelerin çoğu kalp dokudan dağıtmak için yeterlidir. - Steril hücre süzgeç (100 µm naylon mesh) yeni bir steril 50 mL konik tüpü yerleştirin. 2-3 mL hücre kültür ortamının ile hücre süzgeç önceden ıslak ve hücre-süzgeç ile hücreleri geçirin. Hücre-süzgeç ile 2-3 mL hücre kültür ortamının durulayın. (Şekil 1I)
- Konik tüp cardiomyocytes 180 x g (Şekil 1J), 5 min için içeren santrifüj kapasitesi. Hücre doku artıkları içeren ve hücre Pelet 10 mL hücre kültür medya (Şekil 1 L) yeniden askıya süpernatant (Şekil 1 K), Aspire edin.
- Yavaşça hücreleri ve plaka hücreleri üzerine 10 cm hücre kültür çanak (plastik kaplama her türlü olmadan) resuspend ve bir hücre kültür kuluçka (1 ön kaplama) 1 h için kuluçkaya (Şekil 1 M). Bu ön kaplama adım sigara-cardiomyocytes, fibroblastlar ve kaplamasız hücre kültürü yemek için uymaları endotel hücreleri gibi sağlar.
Not: Bu noktada, cardiomyocytes genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. (Şekil 1N). - 1 h kuluçka sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) 10 cm kültür bulaşık yıkama ve hücreleri hücre kültür orta 10 mL serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde art arda pipetting tarafından yeniden askıya alma. Sonra bir yeni 10 cm hücre kültür çanak (plastik olmadan herhangi bir kaplama) içine yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) aktarmak ve bir hücre kültür kuluçka (2 ön kaplama) ek bir 1 h için kuluçkaya.
Not: Sigara kaplı plakasına eklemek hücrelerdir baskın sigara cardiomyocytes: fibroblast ve endotel hücreleri, mikroskop (Şekil 1O) altında görüntülenir. - 2 öncesi kaplama sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes) 10 cm kültür bulaşık yıkamak, sonra cardiomyocytes bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarın.
5. hücre sayımı ve hücreleri bir 96-şey hücre kültür plaka (gün 1) kaplama
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Hücreleri içine bir yoğunluk arasında 10-30 x 103 hücreleri/200 µL (Şekil 1 P) son bir hacim içinde bir çok kanallı pipet kullanarak iyi bir hücre dışı matriks kaplı 96-şey hücre kültür plaka plaka. Kuyu A1, A12, H1 ve H12 arka planı olarak kullanabilir: 200 µL kültür ortamının diğer kuyu bu Wells (hücreler) olarak ekleyin. 37 ° C hücre kültür kuluçka plaka kuluçkaya.
Not: Bu çalışmada, oksijen tüketimi farklı hücre yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi gibi kullanarak test edildi. (Şekil 2A). Ayrıca, yukarıdaki gibi cardiomyocytes hemen sonra yalıtım genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. Hücrelerin içinde 16-24 h kültürünün dümdüz.
6. oksijen tüketimi tahlil bir 96-iyi format hücre dışı akı Analyzer'ı (2 gün)
Not: Oksijen tüketimi tahlil hücreleri kaplama sonra bir gün dışarı taşınan veya daha sonra. Bu iletişim kuralı 7 gün yaşayabilir yenidoğan cardiomyocytes kültürlü kullanarak yalıtım sonrası.
- Akı analyzer sensör kartuş hidrat ( Tablo malzemelerigörmek) en az 3 saat ama ideal olarak tahlil önce tam bir gün için. Calibrant çözümün 200 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) yardımcı programı plaka her kuyuya, sensör kartuşu yardımcı programı tabağa koy ve 37 ° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan kuluçkaya.
- Hücre kültür medya bir saat önce tahlil mitokondri stres testi orta olarak değiştirin. Cardiomyocytes kırılgandır. Bu nedenle, yavaşça bir çok kanallı pipet kullanarak hücre kültür ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış mitokondrial stres testi medya 200 µL hücrelerle iki kez yıkayın. İkinci yıkama sonra önceden ısıtılmış mitokondri stres testi medya 175 µL ekleyin ve 37° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan hücreler kültür.
- Konsantre test bileşikler hazırlayın. Mitokondri stres testi için 3,0 mL her 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP ve 20 µM Rotenon ve 20 µM antimycin A, tüm mitokondrial stres testi ortamda karışımı hazırlayın.
Not: Her kampta açıklanan konsantrasyon test edilmiştir. Ancak, kişinin kendi laboratuvarında her bileşik toplama titrating gereklidir. - Her bileşik 25 µL sensör kartuş çok kanallı pipet (Şekil 1Ç) kullanarak enjektör bağlantı noktalarına yükleyin. Birim ve nihai toplama Tablo 2' de açıklanmıştır.
- Hücre dışı akı tahlil Protokolü ayarlayın. Program açıklandığı Tablo 3.
- Programı başlatın. İlk olarak, sensör kartuş kalibrasyon (Şekil 1R) için makine içine koymak. Kalibrasyon adım işlem tamamlandıktan sonra tahlil plaka için calibrant değiştirin.
Not: Üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanmanız, kuyu ve her bileşik grupları ve bağlantı noktası anlamına gelir. - İstenirse, tahlil sonra dikkatli bir şekilde bir çok kanallı pipet kullanarak tüm tahlil orta atmak ve hücre kültür Mikroplaka protein tahlil kullanarak gelecekteki hücre normalleştirme için-20 ° C'de depolayın.
- Protein içeriği ölçmek. Standart RIPA hücre lizis çözüm 50 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Plaka tam hücreleri parçalayıcı için 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Tüm malzeme için yeni bir açık düz dipli 96 iyi tahlil plaka aktarın.
- BCA tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek.
Not: Hücre dışı matriks ile iyi kaplama yüksek protein konsantrasyonu her iyi sonuçlanır. Bu nedenle, gerçek hücre protein konsantrasyonu almak için arka plan well(s) (hücre) tutarını çıkarmak. Hücrelerinden elde edilen protein konsantrasyonu bir 96-şey kültür tabağına düşüktür. Buna ek olarak, protein konsantrasyonu iyi iyi hücre dışı matriks kaplama nedeniyle farklı. Bu nedenle, OCR normalleştirmek için cep telefonu numarasını kullanarak önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalpleri gün 0 yenidoğan pups izole edildi. 5 x 105 hücreleri/yavru elde ve cardiomyocytes, yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi, 96 iyi tabak (Şekil 2A) numaralı seribaşı. Gecede kültür sonra cardiomyocytes bulundu iyi kaplı plastik yüzey için ekli vardı (ekli olmayan hücreleri hala görünür gibi yuvarlak ve parlak, dağılın olan sağlıklı, ekli hücreleri ile karşılaştırıldığında) çok az ekli olmayan hücreleri () Şekil 2A ve B). Bu noktada, kendiliğinden sözleşme cardiomyocytes kolayca görünür. 30 x 103 hücreleri/iyi bir tohum yoğunluğuna izdiham bir gün sonra tohum hücreleri yaymak gibi gösterdi. Yuvarlak (ölü) hücre sayısı çok düşük olduğu gibi bu sonuçlar protokol cardiomyocytes yüksek hücre canlılık verir gösterdi. Cardiomyocytes immunostained bir antikor sarcomeric α-Aktinin, bu deyim kanıtı olarak bir cardiomyocyte belirli işaret18 karşı ile vardı. Şekil 2Ciçinde gösterildiği gibi hücrelerin çoğu olumlu α-Aktinin cardiomyocyte yalıtım yüksek saflıkta gösterilen boyama gösterdi.
Bir tipik mitokondrial stres testi düzeninin Şekil 3' te gösterilmiştir. Mitokondrial stres testi oksijen tüketim oranını (OCR) temel ölçüsü ile başlar. Bu ATPaz engeller oligomycin enjeksiyonu ile takip ediyor. Fark öncesi ve sonrası oligomycin enjeksiyon gösterir OCR ATP üretimi için bağlı. O zaman, uncoupling Ajan FCCP maksimum oksijen tüketim oranını ölçmek için enjekte ettiler. Yedek solunum kapasitesi bazal arasındaki fark olarak hesaplanır ve maksimal OCR. Son olarak, iki elektron taşıma karmaşık inhibitörleri (antimycin A ve Rotenon) enjeksiyonu ile tamamen mitokondrial solunumu durur ve OCR için en düşük seviyesine azalır. Mitokondrial etkinlik, bu düzeyde engelleyerek oksijen tüketimi mitokondrial sigara. Bazal solunum, proton sızıntı ve maksimal Solunum Sigara mitokondrial solunum (antimycin A ve Rotenon varlığında OCR) ve temel ölçü, OCR oligomycin huzurunda ve OCR içinde arasındaki fark olarak hesaplanabilir FCCP, varlığı anılan sıraya göre.
Bu çalışmada, OCR analiz bir gün sonra hücre izolasyon 96-şey biçimi hücre dışı akı analyzer sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Buna ek olarak, OCR, üç saat önce tahlil, serum açlık etkisini test etmek için hücre kültür medya değiştirildi için normal hücre kültür büyüme ortamları ile serum ya da serum olmadan. Çalıştırdıktan sonra OCR ölçüm verileri 1 kadar 12 her biri için bir elektronik tabloya kayıt tutma ve daha fazla çözümleme için verildi. Metabolik özellikleri aşağıdaki gibi belirlenmiştir:
Sigara mitokondrial solunum ortalama OCR (10, 11, 12) =
Bazal solunum = OCR (1, 2, 3) ortalama-OCR (10, 11, 12) Ortalama
ATP üretimi = OCR (1, 2, 3) ortalama-OCR (4, 5, 6) Ortalama
Proton sızıntı = OCR (4, 5, 6) ortalama - OCR (10, 11, 12) Ortalama
Maksimal solunum = OCR (7, 8, 9) ortalama - OCR (10, 11, 12) Ortalama
Şekil 4Agörüldüğü gibi OCR değerlerini kolayca analiz edildi ve eklenen bileşikler etkileri de açık olduğunu. Önemlisi, varyasyon o şey standart hata tarafından gösterildiği gibi küçüktü. Artırmak hücre sayısı artan temel ölçüm, Oligomycin ve FCCP tedavi solunum sonuçlandı. Açlıktan serum hücrelere kıyasla, OCR büyüme medya ile inkübe analiz hücrelerdeki daha yüksek. Şekil 4B' de gösterildiği OCR bazal solunum gösterilir proton sızıntısı (Oligo) ve 1 x 104 hücre başına maksimal solunum (FCCP). OCR 10 x 103 hücre başına 20 K ve 30 K tohumlama dansitesi hücreler/iyi 10 K hücreler/iyi daha yüksek. Şekil 4 colarak gösterilen, OCR bazal solunum göreli göreli Proton OCR sızıntısı (Oligo) ve maksimal (FCCP) büyüme medya ve serum arasında benzer değerleri gösterir ifade ederek grupları aç. Bu sonuçlar yoğunluğu tohum göreli proton sızıntısı ve maksimal oksidatif kapasite etkilemez öneririz.
Genel olarak, bu iletişim kuralını kullanarak, fare yenidoğan cardiomyocytes mükemmel verim başarıyla izole kültürlü ve. OCR bir hücre dışı akı Çözümleyicisi'nde bu miyositler kullanarak tespit edilebilir. Sonuçlar da yoğunluk tohum önemli ölçüde cep numarası tarafından hesaplanan OCR etkileyeceğini gösterir. Ancak, kısa vadeli (3 h) serum açlık OCR azalır. Bilgi fare yenidoğan cardiomyocytes OCR çeşitli deneysel koşullar ile test etmek için kullanışlıdır.
Şekil 1: izolasyon ve neonatal cardiomyocytes gün 0 yeni doğan fareler gelen kültür. (A)yenidoğan bebeklerin euthanized ve kalp toraks disseke. (B) kalpleri HBSS içinde (Ca2 +, Mg2 +) yıkanır. (C) her kupa 8 parçaya kesilir. (D) kalpleri HBSS ile dolu bir 6-şey plaka taşınır. Kalpleri onlara iyi şey aktarmak için bir Moria kaşık kullanarak yıkanır. (E) kalpleri tripsin-HBSS içinde nazik ajitasyon ile 4 ° C'de önceden sindirilmiş. (F) Predigested 4 h kuluçka 4 ° C'de sonra doku kalp (G) kalp dokuları 10 dk collagenase sindirim sonra. (H) Collagenase kalp dokuları triturated sindirilmiş. (ben) göl kenarında cardiomyocytes bir hücre süzgeç aracılığıyla filtre. (J) Cardiomyocytes tarafından Santrifüjü pelleted. (K) Collagenase ve Kültür medya aspirasyon tarafından kaldırılır. (L) Cardiomyocytes taze kültür ortamında yeniden askıya alınmış. (M) Cardiomyocytes 10 cm Plastik tabak öncesi kaplama için kültürlü. (N) A cardiomyocytes (yuvarlak ve parlak hücreleri) öncesi kaplama 1s sonra temsilcisi görüntüsü. (Ön kaplama ve yapışık olmayan cardiomyocytes, genellikle fibroblast hücreleri ve endotel hücreleri kalan kaldırılması görünür olduktan sonraO). (P) cardiomyocytes bir 96-şey plaka kaplama. (Q) sensör kartuş enjeksiyon noktalarına reaktifler yükleniyor. (R) bir hücre dışı akı analyzer makinenin içine koyarak sensör kartuş. Ölçek çubuğu = 0,1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre dışı akı analyzer 96-şey plaka üzerinde cardiomyocytes kültür. (A)hemen sonra (üst satır) tohum veya 18 h mesaj (alt satır) tohum belirtilen hücrenin yoğunlukları ile 96-şey plakaları cardiomyocytes temsilcisi görüntülerini. (B) A daha yüksek büyütme resim 10 x 103 hücreleri/iyi bir hücre yoğunluğuna tohum cardiomyocytes 18 h yazının. Anti-sarcomeric α-Aktinin antikor (yeşil) ve DAPI (olarak nükleer bir leke) ile (C) Cardiomyocytes (mavi) lekeli. Ölçek çubuğu = 0,1 mm. İmmunostaining için kullanılan yöntemleri bizim önceki yayın18' bulunabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Mitokondrial stres testi şematik gösterimi. Bazal, ATP bağlantılı, maksimal ve sigara mitokondrial solunum yanı sıra yedek solunum kapasitesi ve Proton sızıntı, dahil olmak üzere Biyo-enerjetik parametreleri izleme ile ilgili mitokondriyal effectors ana hatlarıyla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: mitokondrial stres tahlil. (A)temsilcisi izlemeyi oksijen Tüketim oranları (OCR, pMoles/dak) yenidoğan fare cardiomyocytes. Belirtilen, kez, oligomycin (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), ve RAA (Rotenon ve antimycin A, 1 µM) enjekte. Her ölçüm için Ortalama ve standart hata 10 bireysel Wells ortalamaya (SEM) sunulmuştur. (B) OCR bazal solunum, Oligo (Proton kaçak) ve FCCP (maksimal solunum) 10 x 103 hücreleri başı olarak hesaplanır. (C) OCR bazal solunum göreli olarak ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif ve çözüm adı | Hazırlık | Notlar |
| Tripsin öncesi sindirim çözüm | HBSS (Ca2 + ve Mg2 +) olmadan tripsin geçiyoruz. Son 0,5 mg/mL bölgedir. 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. | Öncesi sindirim çözüm deneme günü olun. |
| Collagenase sindirim çözüm | HBSS (Ca2 + ve Mg2 +) olmadan tripsin geçiyoruz. Son 0,5 mg/mL bölgedir. 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. | Collagenase sindirim çözüm deneme günü olun. |
| Cardiomyocyte Kültür medya | DMEM, M-199 125 mL, at serum 25 mL ve FBS 12,5 mL Mix 375 mL. % 1 penisilin ve % 1 streptomisin çözüm ile ek. | Cardiomyocyte Kültür medya önce deney yapılabilir ve bir ay boyunca 4 ° C'de depolanmış. |
| Mitokondrial stres testi orta | İlk, yapmak 1 L orta DMEM olmadan ile herhangi bir sodyum pyruvate, L-glutamine, glikoz ve Hepes, sterilize etmek için filtre ve 4 ° C'de depolayın Tahlil günü, sodyum pyruvate, L-glutamine, glikoz ve Hepes ekleyin. PH 7.4 kullanmadan önce için ayarlamak (sterilizasyon gerekli değildir). | Takviyeleri için son konsantrasyonu takip: Sodyum pyruvate (1 mM), L-glutamine (2 mM), glikoz (10 mM) ve Hepes (2 mM) |
| Oligomycin hisse senedi | DMSO oligomycin geçiyoruz. İlk olarak, 5 mL stok çözeltisi hazırlamak. Bir kez oligomycin tamamen DMSO içinde çözülmüş, 250 µL aliquots yapmak, -20 ° C'de depolayın | Tahlil günü, kullanmak için bir aliquot almak. Birçok donma-çözülme çevrimleri kaçının. |
| FCCP hisse senedi | DMSO FCCP geçiyoruz. İlk olarak, 5 mL stok çözeltisi hazırlamak. Son konsantrasyonu 5 mm'dir. Bir kez FCCP tamamen DMSO içinde çözülmüş, 250 µL aliquots yapmak, -20 ° C'de depolayın | Tahlil günü, kullanmak için bir aliquot almak. Birçok donma-çözülme çevrimleri kaçının. |
| Antimycin A stok | DMSO antimycin A geçiyoruz. İlk olarak, 5 mL stok çözeltisi hazırlamak. Son konsantrasyonu 5 mm'dir. A tamamen DMSO, çözülmüş antimycin 250 µL aliquots yapınca,-20 ° C'de depolayın | Tahlil günü, kullanmak için bir aliquot almak. Birçok donma-çözülme çevrimleri kaçının. |
| Rotenon hisse senedi | DMSO Rotenon geçiyoruz. İlk olarak, 5 mL stok çözeltisi hazırlamak. Son konsantrasyonu 5 mm'dir. Bir kez Rotenon tamamen DMSO içinde çözülmüş, 250 µL aliquots yapmak, -20 ° C'de depolayın | Tahlil günü, kullanmak için bir aliquot almak. Birçok donma-çözülme çevrimleri kaçının. |
| Hücre kültür plaka kaplama çözümü | Öncelikle, 200 mL % 0.5 jelatin çözeltisi olun. PBS ve basınçlı kap içinde jelatin geçiyoruz. Deneme günü, fibronektin çözüm 50 µL kaplama çözüm yapmak için 5 mL jelatin çözümde ekleyin. | %0.5 jelatin çözüm oda sıcaklığında 2 aya kadar saklanabilir. |
Tablo 1: Reaktifler ve çözümleri.
| Enjeksiyon bağlantı noktası | Bileşikler ve konsantrasyon | Çalıştır sırasında (µl) enjekte birimi | Tahlil son konsantrasyon |
| A | 16 µM oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | 20 µM Rotenon (Rot) ve 20 µM antimycin A (AA) |
25 | Her 2 µM |
Tablo 2: Enjeksiyon karışımları.
| Adımlar ve yordamlar | Ölçümleri ve döngüler |
| Kalibrasyon | - |
| Denge | - |
| Temel ölçüm | 3 kez: 3 min Mix, 2 dk bekle, 3 dk ölçmek |
| Enjekte (Oligomycin) bağlantı noktası | - |
| Ölçümleri | 3 kez: 3 min Mix, 2 dk bekle, 3 dk ölçmek |
| Bağlantı noktası B (FCCP) enjekte | - |
| Ölçümleri | 3 kez: 3 min Mix, 2 dk bekle, 3 dk ölçmek |
| Bağlantı noktası C (RAA) enjekte | - |
| Ölçümleri | 3 kez: 3 min Mix, 2 dk bekle, 3 dk ölçmek |
Tablo 3: Hücre dışı akı analyzer programı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önce yayımlanmış protokolleri16,18farklı iletişim kuralıdır. İlk olarak, yüksek canlılık elde etmek sadece yavruları doğumda hemen olabilir olanlar gün sıfır üç gün (P0 P3 için sersemler) çağın diğer protokolleri16,19' sık kullanılan yerine (yani P0) kullanılır. İkinci olarak, deneme süresini en aza indirmek için kalpleri sadece 4 h için tripsin ile önceden sindirilmiş. Buna ek olarak, yordamı kolaylaştırmak ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için en az birkaç adım, belirtildiği gibi çalıştırmaya başladık. Örneğin, bizim iletişim kuralı arabellekleri, PBS ve HBSS sadece iki tip ve tek bir hücre kültür medya türünü kullanır ve ajitasyon collagenase sindirim sırasında istihdam değil.
OCR tahlil tekrarlanabilirlik için önemlidir, yenidoğan fare cardiomyocytes yüksek canlılık elde etmek için birkaç kritik nokta vardır. İlk olarak, P0 yeni doğan yavruların kullanarak ve tripsin öncesi sindirim ve collagenase sindirim aynı gün gerçekleştirme yüksek canlılık elde etmek için önemlidir. İkinci olarak, collagenase sindirim sırasında bu 37 ° C su banyosu kalp dokusunda kışkırtmak için tavsiye edilmez. Ajitasyon birçok iletişim kuralları'nda tavsiye edilir olsa da, bu P0 kalpler collagenase tarafından sindirilir olun kolay olarak gerekli değildir bulundu. Son olarak, yavaşça kalp doku triturating cardiomyocytes sonra collagenase sindirim ayırmak için çok önemlidir.
Biz de miyositler dokusundan P1 ve P2 yavru kalp, aynı iletişim kuralını kullanarak test ettik. Ancak, bu büyük kalp örnekler için bulduk tripsin öncesi sindirim gecede yeterli hücre verimleri (veri gösterilmez) ulaşmak için gerçekleştirmek gereklidir. Buna ek olarak, hücre canlılığı P1 ve P2 cardiomyocytes için % 60'ı, benzer çalışmaları16yayınlandı diğer civarındaydı. Bu sonuçlar P0 Miyokardiyum hücre dışı matriks nispeten daha düşük miktarlarda yüksek hücre canlılığı kaynaklanan tripsin öncesi sindirim için kısa süreleri ve bu genç kalpleri verimleri bu büyük kalpler, daha sahip olduğunu düşündürmektedir.
Ekstrasellüler akı (XF) analiz Biyo-enerjetik işlev hücre ve izole mitokondri20,21ölçmek için önemli ve popüler bir yöntem haline gelmiştir. Bugüne kadar bir dizi çalışmalar sıçan yenidoğan cardiomyocytes kullanılan ve oksijen tüketimi, bir AGILENT XF24 sistem22,23,24 kullanılarak ölçülür. Fare hücreleri fare kaynaklı hücreler yerine kullanarak bu çalışmalar büyük olasılıkla gerçekleştirilen gibi fare hücreleri genellikle daha yüksek hücre canlılığı ve tahlil tekrarlanabilirlik, burada okudu fare kardiyak miyositler karşılaştırıldığında. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar özellikle fare satırlarında oluşturulmuş olan göz önüne alındığında, basit ve tekrarlanabilir bir protokol olarak bu el yazması görüşmek fare yenidoğan cardiomyocytes, Biyo-enerjetik işlevinde analiz etmek için çalışma fırsatı sağlar fare kardiyak miyositler mitokondriyal işlev. Bu yöntem daha kolay yeni veya varolan genetik olarak manipüle fare çizgiler25,26kullanarak kalp, Biyo-enerjetik Yönetmelikte için yeni mekanizmalar anlamak için neden olabilir veri için tercüme edilebilir.
Bu çalışmada, hücre sayısı ve yoğunluğu OCR üzerindeki etkisini test ettik. Şekil 4B' de gösterildiği Wells ile 10 x 103, 20 x 103ve 30 x 103 hücreleri/iyi, ölçülen OCR benzer. 30 x 103 hücreleri/iyi kaplama konfluent iyi tohum sonra bir gün içinde üretilen verilen bu hücreler arasında 10 x 103 -30 x 103 hücreleri/iyi OCR tahlil için bir 96-şey plaka yarma öneririz. İlginç bir şekilde bulduk 3 h serum açlık OCR azalmıştır. Büyüme faktörleri glikoliz etkinleştirmek ve oksijen tüketimi27artış olduğu bilinmektedir. Ayrıca büyüme faktörleri genel olarak geliştirmek bildirildi hücresel hareketlilik ve cardiomyocytes3,28daralma. Cardiomyocyte kasılma oksijen tüketime değişiyor ATP üretimi2, gerektirir. Bu nedenle, bu verileri serum açlık cardiomyocytes inactivation ile oksijen tüketimini azaltır göstermektedir. Biz kendi deneysel ayarında OCR serum açlık etkisini test tavsiye ederim.
Belirtildiği gibi mitokondri kalp işlevinde önemli rol oynarlar. Bu nedenle, roman düzenleyiciler ve oksidatif metabolizma düzenleyen yolları tanımlama kalp yetmezliği tedavisinde yeni tedavi hedefleri tanımlamak için bir yol sağlayabilir. 96 iyi biçimi için daha büyük bir sayı 24 iyi biçimine göre koşulları test test etmek yeteneği sağlar, bu iletişim kuralını da kolayca adapte cardiomyocytes29 roman Biyo-enerjetik düzenleyiciler tanımlamak için bir yüksek üretilen iş ekran olabilir . Böylece, bizim iletişim kuralıyla genetik olarak birleştirerek manipüle olanlar da mitokondrial mutasyonlar30var, OCR içinde kimyasal bileşikler veya cDNA kütüphaneler, etkileri ekran için ilginç çalışmaları sağlayabilir gibi yenidoğan cardiomyocytes vahşi-type vs. metabolik olarak kusurlu cardiomyocytes.
Yenidoğan ve yetişkin cardiomyocytes birçok farklı özellikleri ve metabolik işlevleri31glikoz ve yağ asidi metabolik enzimler32ifade düzeyleri de dahil olmak üzere, sahip olduğu. Bu nedenle, ideal olarak tüp bebek kültürlü cardiomyocytes olduğu gibi kalp modeli sistemi olarak kullanmak için bu bir oksidatif kapasite karşılaştırmak böylece OCR yetişkin cardiomyocytes içinde etkili bir şekilde analiz etmek için bir protokol daha fazla geliştirmek önemli olacağını ve Yenidoğan cardiomyocytes ile özellikleri. Gelecekteki çalışmalar bu metodoloji yetişkin kardiyak miyositler kullanarak bir tekrarlanabilir sistemine adapte takip gerekir.
Özet olarak, oksijen tüketimi birincil kültürlü fare yenidoğan fare cardiomyocytes kullanarak analiz etmek için basit ve tekrarlanabilir bir iletişim kuralı gösteriyoruz. Bu iletişim kuralını kullanarak, başarılı bir şekilde izole ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür gelip bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer sistemi kullanarak bu OCR tahlil gerçekleştirmek. Bizim iletişim kuralı yüksek canlılık verir ve önemlisi, sürekli tekrarlanabilir sonuçlar. Çalışmada özellikle oksijen tüketimi ve mitokondrial stres testi üzerine odaklanmıştır, ancak protokol kolayca yağ asidi oksidasyon ve cardiomyocytes glikoliz çözümlemek için adapte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
