साइट-चुनिंदा संशोधित इम्यूनोकॉन्जूगेट्स के निर्माण के लिए थिओल-रिएक्टिव अभिकर्मकों का संश्लेषण और जैवसंयुग्मन
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम फली के संश्लेषण का वर्णन करेंगे, एक phenyoxadiazolyl मिथाइल सल्फोने-आधारित अभिकर्मक के लिए कार्गोस की साइट चयनात्मक लगाव biomolecules के thiols, विशेष रूप से एंटीबॉडी. इसके अलावा, हम संश्लेषण और एक फली असर एक मॉडल एंटीबॉडी के लिए द्वि-क्रियात्मक chelator और इसके विकार के लक्षण वर्णन करेंगे ।
Abstract
maleimide असर bifunctional जांच जैव अणु, विशेष रूप से एंटीबॉडी में thiols के साइट चयनात्मक संशोधन के लिए दशकों के लिए नियोजित किया गया है । अभी तक maleimide आधारित संयुग्मों vivo में सीमित स्थिरता प्रदर्शन क्योंकि succinimidyl थायोएथर लिंकेज एक रेट्रो माइकल प्रतिक्रिया से गुजरना कर सकते हैं । यह, ज़ाहिर है, रेडियोधर्मी पेलोड की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं या संचलन में thiol असर जैव अणुओं के साथ इसके आदान-प्रदान. इन प्रक्रियाओं के दोनों स्वस्थ अंगों में ऊंचा गतिविधि सांद्रता उत्पादन के रूप में अच्छी तरह से लक्ष्य के ऊतकों में गतिविधि सांद्रता घटी हुई, कम इमेजिंग कंट्रास्ट और कम चिकित्सीय अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं । २०१८ में, हम एक मॉड्यूलर, स्थिर, और आसानी से सुलभ phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone अभिकर्मक के निर्माण की सूचना दी ‘ फली ‘-thiol आधारित bioconjugations के लिए एक मंच के रूप में । हम स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि फली आधारित साइट चयनात्मक bioconjugations पुनरुद्भूत और robustly समरूप बनाने, अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक immunoreactive, और अत्यधिक स्थिर radioimmunoconjugates । इसके अलावा, कोलोरेक्टल कैंसर के murine मॉडल में पूर्व नैदानिक प्रयोगों से पता चला है कि इन साइट-चुनिंदा radioimmunoconjugates प्रदर्शित अब तक प्रदर्शन में बेहतर radiolabeled के माध्यम से संश्लेषित एंटीबॉडी की तुलना में वीवो कार्यक्षमता में सुपीरियर-आधारित conjugations. इस प्रोटोकॉल में, हम फली के चार कदम संश्लेषण का वर्णन करेंगे, सर्वव्यापी चेल्टर dota (फली-dota) के एक bifunctional फली-असर संस्करण का निर्माण, और HER2 के लिए फली-dota के विकार-एंटीबॉडी trastuzumab लक्ष्यीकरण ।
Introduction
रेडियोहारमास्यूटिकल कैमिस्टों ने लंबे समय से दोनों परमाणु इमेजिंग और लक्षित रेडियोथेरेपी1के लिए बीमारी के बायोमार्कर के लिए एंटीबॉडी की चयनात्मकता और विशिष्टता का दोहन किया है । दूर और दूर एंटीबॉडी के रेडियोलालिंग के लिए सबसे आम दृष्टिकोण रेडियोलेबल कृत्रिम समूहों या रेडियोमेट्रियल chelators के अमीनो एसिड के अंधाधुंध लगाव पर predicated है-सबसे अक्सर lysines-इम्युनोग्लोबुलिन की संरचना के भीतर ( चित्र 1a)2. हालांकि यह रणनीति निश्चित रूप से प्रभावी है, इसके यादृच्छिक, गैर-साइट-विशिष्ट प्रकृति समस्याएं पैदा कर सकती हैं । विशेष रूप से, पारंपरिक bioconjugation दृष्टिकोण खराब परिभाषित और विषम immunoconjugates अलग regioisomers के हजारों के मिश्रण से बना है, जैविक और औषधीय गुण3के अपने स्वयं के सेट के साथ प्रत्येक का उत्पादन । इसके अलावा, अगर कार्गो इम्युनोग्लोबुलिन के एंटीजेन-बाइंडिंग डोमेन में जोड़ा जाता है, तो यादृच्छिक जैवसंयुग्मन एंटीबॉडी के इम्यूनोएक्टिविटी में बाधा उत्पन्न कर सकता है ।
इन समस्याओं के समाधान के लिए इन वर्षों में, साइट-विशिष्ट और साइट-चयनात्मक जैवसंयुग्मन रणनीतियों का एक प्रकार विकसित किया गया है,4,5। इन दृष्टिकोणों में से सबसे आम है-साइस्टीन्स (चित्रा 1b) के सल्फहाइडरिल समूहों के लिए maleimide असर जांच के बंधाव पर निर्भर करता है । IgG1 एंटीबॉडी स्वाभाविक रूप से 4 अंतर-चेन डिसल्फाइड पुलों, लिंकेज कि चुनिंदा करने के लिए मुफ्त के लिए maleimidyl थायोईथर बांड फार्म के साथ माइकल इसके अलावा प्रतिक्रियाओं के दौर से गुजर करने में सक्षम thiols उपज को कम किया जा सकता है शामिल हैं । thiols और maleimides का उपयोग निश्चित रूप से पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार है, और maleimides असर synthons की एक विस्तृत विविधता और bifunctional chelators वर्तमान में उपलब्ध हैं । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इस पद्धति के रूप में अच्छी तरह से गंभीर सीमाएं हैं । maleimide आधारित immunoconjugates विवो में सीमित स्थिरता प्रदर्शन क्योंकि थायोएथर लिंकेज एक रेट्रो माइकल प्रतिक्रिया से गुजरना कर सकते हैं (चित्रा 2)6,7,8,9, 10. यह, ज़ाहिर है, रेडियोधर्मी पेलोड की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं या संचलन में थियोल असर जैव अणुओं के साथ इसके आदान-प्रदान (जैसे, ग्लूटाथिओन या सीरम एल्ब्युमिन). इन प्रक्रियाओं के दोनों स्वस्थ अंगों में गतिविधि सांद्रता बढ़ाने के साथ ही लक्ष्य के ऊतकों में गतिविधि सांद्रता में कमी, कम इमेजिंग कंट्रास्ट और कम चिकित्सीय अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं । कई वैकल्पिक thiol-प्रतिक्रियाशील अभिकर्मकों tosylates, bromo सहित इन मुद्दों को दरकिनार करने के प्रयास में विकसित किया गया है-और iodo-acetyls, और vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. हालांकि, इन सभी दृष्टिकोणों में ऐसी सीमाएं हैं जो उनके व्यापक अनुप्रयोग में बाधा डालती हैं ।
के बारे में पांच साल पहले, scripps अनुसंधान संस्थान में स्वर्गीय कार्लोस बारबास III की प्रयोगशाला thiols साथ अत्यधिक स्थिर संपर्क के चयनात्मक गठन के लिए अभिकर्मकों के रूप में phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfones के उपयोग का बीड़ा उठाया है (चित्रा 1c और चित्रा 3) 18 , 19. लेखकों को एक phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone-असर fluorescein के संस्करण के लिए कई मुक्त सिस्टीन अवशेषों को शामिल करने के लिए इंजीनियर एंटीबॉडी को संशोधित करने के लिए नियोजित, अंततः अनुरूप से उच्च स्थिरता के साथ immunoconjugates का उत्पादन maleimide आधारित जांच का उपयोग कर बनाया constructs । इस होनहार काम को देखने पर, हम कुछ हद तक हैरान थे कि इस तकनीक केवल रेडियोकैमिस्ट्री में शायद ही इस्तेमाल किया गया था और अभी तक नहीं किया गया था सब पर bifunctional चेल्टरों या radioimmunoconjugates के संश्लेषण में इस्तेमाल20,21 . आवेदनों की यह कमी, तथापि, जल्द ही अधिक समझ बनाने के लिए शुरू किया: सिग्मा से अभिकर्मक की खरीद में कई प्रयास-aldrich वांछित यौगिक के < 15% के साथ क्षरण उत्पादों के जटिल मिश्रण की प्राप्ति में हुई । इसके अलावा, रिपोर्ट अभिकर्मक सिंथेसाइज़िंग खुद को एक यथार्थवादी विकल्प भी नहीं था, के रूप में प्रकाशित सिंथेटिक मार्ग कुछ हद तक बोझिल है और परिष्कृत कार्बनिक रसायन विज्ञान उपकरण की आवश्यकता है कि ज्यादातर रेडियोकेमिस्ट्री और आणविक इमेजिंग प्रयोगशालाओं-हमारे सहित-बस अधिकारी नहीं है ।
इन बाधाओं के जवाब में, हम एक मजबूत और यथोचित सतही सिंथेटिक मार्ग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि एक आसानी से सुलभ और अत्यधिक स्थिर phenyloxadiazolyl मिथाइल सल्फोने अभिकर्मक बनाने के लिए बाहर सेट. इस साल के शुरू में, हम एक मॉड्यूलर, स्थिर, और आसानी से सुलभ phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone अभिकर्मक के निर्माण की सूचना दी ‘-डब ‘ फली-thiol आधारित bioconjugations के लिए एक मंच के रूप में (चित्रा 1c और चित्रा 3)22। फली और अभिकर्मक के बीच प्रमुख अंतर बारबास द्वारा रिपोर्ट, एट अल. यह है कि पूर्व में एक ऐनिलीन अंगूठी को रोजगार phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone मोइटी से जुड़ी, जबकि उत्तरार्द्ध एक ही स्थिति में एक phenol सुविधाएँ (चित्रा 4). यह परिवर्तन एक अधिक सरल और सुलभ सिंथेटिक मार्ग के रूप में अच्छी तरह से की सुविधा-अगर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यौगिक के साथ हमारा अनुभव द्योतक है-एक अधिक स्थिर अंतिम अभिकर्मक । इस काम में, हम भी फली की एक जोड़ी संश्लेषित-बिकार्यात्मक chelators असर-फली-dfo और फली-chx-‘ ‘-dtpa- ८९zr के निर्माण की सुविधा के लिए-और १७७Lu-लेबल radioimmunoconjugates, क्रमशः । जैसा कि हम चर्चा करेंगे, हम का प्रदर्शन किया है कि फली आधारित साइट चयनात्मक bioconjugations पुनरुद्भूत और robustly समरूप, अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक immunoreactive, और अत्यधिक स्थिर radioimmunoconjugates बनाने । इसके अलावा, कोलोरेक्टल कैंसर के murine मॉडल में पूर्व नैदानिक प्रयोगों से पता चला है कि इन साइट-चुनिंदा radioimmunoconjugates प्रदर्शन में बेहतर लेबल radiolabeled के माध्यम से संश्लेषित एंटीबॉडी की तुलना में विवो कार्यक्षमता conjugations.
इस काम का ओवर-आर्चिंग लक्ष्य के लिए अच्छी तरह से परिभाषित, सजातीय, अत्यधिक स्थिर है, और इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में के लिए अत्यधिक immunoreactive immunoconjugates के निर्माण की सुविधा है । सिंथेटिक दृष्टिकोण काफी सरल है लगभग किसी भी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने के लिए, और माता पिता फली अभिकर्मक विभिन्न chelators के एक बहुतायत के साथ संशोधित किया जा सकता है, fluorophores, या कारगो. इस प्रोटोकॉल और साथ में वीडियो, हम फली के सरल, चार कदम संश्लेषण का वर्णन करेंगे (चित्रा 5); dota, ६४घन, ६८Ga, १११में, १७७Lu, और २२५एसी (चित्रा 6) के समंवय के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया chelator के एक फली-असर संस्करण का निर्माण; और फली-dota के एक मॉडल एंटीबॉडी को bioconjugation, HER2-लक्ष्यीकरण IgG1 trastuzumab (चित्रा 7) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, हमने रेडियोलाब्लिंग के लिए या vivo प्रयोग में किसी प्रोटोकॉल को शामिल नहीं करने के लिए चुना है । हमारे कारण स्पष्ट हैं । पूर्व के संबंध में, एक फली के रेडियोलाबलिंग-immunoconjugate आधारित एक immunoconjugate अन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने सहायक बातचीत के लिए डॉ साईं किरण शर्मा का शुक्रिया अदा ।
Materials
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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