Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Sommario

In questo protocollo, descriveremo la sintesi di cialde, un reagente basati su solfone metil phenyoxadiazolyl per il fissaggio dei carichi sito selettivo i tioli di biomolecole, in particolare gli anticorpi. Inoltre, descriveremo la sintesi e la caratterizzazione di un chelante bifunzionale baccelli-cuscinetto e la sua coniugazione di un anticorpo di modello.

Abstract

Sonde bifunzionale maleimide-cuscinetto sono state impiegate per decenni per la modifica sito-selettiva di tioli in biomolecole, soprattutto gli anticorpi. Ancora basato su maleimide coniugati visualizzazione limitata stabilità in vivo perché il sollevatore thioether succinimidyl possa subire una reazione di retrò-Michael. Questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione. Entrambi questi processi può produrre concentrazioni di attività elevati in organi sani come pure in diminuzione di concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Nel 2018, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato 'Baccelli' — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-basato. Abbiamo chiaramente dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo molto superiore in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni. In questo protocollo, descriveremo la sintesi di quattro fasi di baccelli, la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto bifunzionale dell'onnipresente chelante DOTA (cialde-DOTA) e la coniugazione di baccelli-DOTA per il targeting per HER2 anticorpo trastuzumab.

Introduzione

Radiofarmaci chimici lungo hanno sfruttato la selettività e specificità degli anticorpi per biomarcatori della malattia per entrambi imaging nucleare e mirata radioterapia¹. Gran lunga il più comune approccio per la radiomarcatura di anticorpi si basa sull'attacco indiscriminato di radiomarcato gruppi prostetici o radiometal chelatori agli aminoacidi — più spesso lisine — all'interno della struttura dell'immunoglobulina ( Figura 1A)². Mentre questa strategia è certamente efficace, la sua natura casuale, non sito specifico può creare problemi. In particolare, gli approcci tradizionali bioconj....

Protocollo

1. la sintesi di 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Nota: A causa della sensibilità alla luce del composto, tenere tutte le reazioni nei vasi coperti di stagnola.

1. In 10 mL di un pallone, sciogliere 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL di metanolo.
2. Per questa soluzione, aggiungere 360 μL di diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenti; anidro) e una piccola ancoretta magnetica. Coprire il recipiente con un tappo di gomma e agitare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Utilizzando una siringa di vetro da 1 mL, poke un buco....

Risultati

I primi quattro passaggi del presente protocollo — la sintesi dei baccelli — sono stati progettati per essere robusti ed affidabili. La deprotonazione e sostituzione di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol per formare il prodotto desiderato thioether permette il thioether in > 99% di rendimento dopo appena 45 minuti. Successivamente, la legatura tra 1 e N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine è stata realizzata via un peptide standard procedura di a.......

Discussione

In questo rapporto, abbiamo scelto di non includere eventuali protocolli per la sperimentazione radiolabeling o in vivo. Le ragioni sono semplici. Per quanto riguarda i primi, la radiomarcatura di un immunoconjugate basato su cialde non differisce affatto da quella di un immunoconjugate sintetizzati utilizzando altre strategie bioconjugation, e queste procedure sono state completamente recensione altrove² . Per quanto riguarda quest'ultimo, le specifiche di preclinici esperimenti in vivo (cioè, mo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-(4-amminofenil)-1,3,4-ossadiazolo-2-tiolo	Sigma-Aldrich	675024
1,5 mL Provetta microcentrifuga LoBind	Eppendorf	925000090
1,5 mL Provetta microcentrifuga	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Unità filtrante centrifuga	EMD Millipore
Cicloesano	Fisher Scientific	C556-4
Diclorometano	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropiletilamina	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimetilsolfossido	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Acetato di etile	Fisher Scientific	E145 4
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144-500
Iodometano	Sigma-Aldrich	289566-100G
Solfato di magnesio	Acros Organics	413485000
acido m-cloroperbenzoico	Sigma-Aldrich	273031
Metanolo	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′- succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediammina	Sigma-Aldrich	671401	Negozio a -80 C
N-etil-N′- [3- (dimetilammino)propil] carbodiimmide cloridrato	Sigma-Aldrich	3450
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P5493 10	&volte; Concentrazione
p-SCN-Bn-DOTA	Macrociclici	B-205	Conservare a -80 ° C
Sephadex G-25 in colonne di desalinizzazione PD-10	GE Healthcare	17085101
Carbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S7795
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Trietilammina	Fisher Scientific	AC157911000
Acido trifluoroacetico	Fisher Scientific	A116-50

EN300000141G