Summary
在本议定书中, 我们将描述 pods 的合成, 这是一种基于苯氧二唑基甲基磺酸试剂的合成, 用于将货物选择性地附着在生物分子的硫醇中, 特别是抗体中。此外, 我们将描述含有 pod 的双官能螯合剂的合成和表征及其与模型抗体的结合。
Abstract
含锂双功能探针已被用于生物分子中硫醇的现场选择性修饰, 特别是抗体。然而, 基于马来酰亚胺的共轭在体内表现出有限的稳定性, 因为琥珀酰硫醚结合可以经历迈克尔的反性反应。当然, 这可能导致放射性有效载荷的释放或与流通中的带有硫醇的生物分子的交换。这两种过程都能在健康器官中产生较高的活性浓度, 并降低目标组织中的活性浓度, 从而降低影像学对比度, 降低治疗率。2018年, 我们报告了一种模块化、稳定且易于获得的苯氧基甲基磺酸试剂 (称为 "pods"), 作为基于硫醇的生物共轭平台。我们已经清楚地证明, 基于 pod 的位点选择性生物共轭可重现性和强大地创建均匀性, 明确定义, 高度免疫反应, 和高度稳定的放射免疫共轭。此外, 在大肠癌小鼠模型的临床前实验表明, 这些位点选择性标记的放射免疫共轭物在体内表现出的性能远远优于通过马来化症合成的放射性标记抗体共轭。在该协议中, 我们将描述 dods 的四步合成, 制备的双功能的 dods 轴承变种的无处不在的螯合物 dota (dods-dota), 以及 dods-dota 与 her2 靶向抗体 trastuzumab 的共轭。
Introduction
长期以来, 放射性药物化学家一直在利用疾病生物标志物抗体的选择性和特异性用于核成像和靶向放射治疗1。抗体的放射标记最常见的方法是基于放射性标记的假体群或放射性螯合剂不加区别地附着在免疫球蛋白结构中的氨基酸--通常是赖氨酸 (图 1a)2。虽然这种策略肯定是有效的, 但其随机的、非特定地点的性质会造成问题。具体而言, 传统的生物共轭方法产生定义差和异质性的免疫共轭, 由成千上万种不同的区域异构体的混合物组成, 每个物质具有自己的生物和药理特性集 3。此外, 如果将货物附加到免疫球蛋白的抗原结合域, 随机生物共轭会阻碍抗体的免疫反应。
多年来, 为解决这些问题, 制定了各种特定地点和场地选择性的生物结合战略4、5.其中最常见的方法是将含马来酰亚胺探针连接到半胱氨酸的磺基 (图 1b)。igg1 抗体自然含有4个链间二硫基桥, 这些连接可以选择性地减少, 产生自由的硫醇, 能够与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应, 形成琥珀酰硫醚键。与传统方法相比, 硫醇和马来酰亚胺的使用无疑是一种改进, 目前有各种各样的含苹果胺的合成器和双功能螯合剂。然而, 必须指出, 这种方法也有严重的局限性。基于马来酰的免疫共轭物在体内表现出有限的稳定性, 因为硫醚链可以经历迈克尔的反应 (图 2)6,7,8,9,10. 当然, 这可能导致放射性有效载荷的释放或与循环中的带有硫醇的生物分子 (例如谷胱甘肽或血清白蛋白) 的交换。这两种过程都可以增加健康器官中的活性浓度, 并降低目标组织中的活性浓度, 从而降低影像学对比度和治疗率。为了规避这些问题, 开发了几种替代硫醇反应试剂, 包括托基酸盐、溴化和碘乙酰, 以及11、12、13乙烯基磺酸.14,15,16,17. 然而, 所有这些办法都有其局限性, 妨碍了其广泛适用。
大约五年前, 斯克里普斯研究所已故卡洛斯·巴巴三世的实验室率先使用苯氧基二唑基甲基磺酸作为试剂, 有选择地与硫醇形成高度稳定的联系 (图1c 和图 3)18,19. 作者使用了一种含苯氧基甲基磺酸的荧光素变种来修饰几种抗体, 这些抗体设计成含有游离半胱氨酸残基, 最终产生的免疫共轭具有比类似的更高的稳定性。使用基于恶意的探测器创建的构造。看到这项很有前途的工作, 我们感到有些惊讶, 因为这项技术只在放射化学中很少使用, 还没有被用于双功能螯合剂或放射免疫共轭 20,21的合成.然而, 由于应用不足, 很快就开始变得更加有意义: 几次试图从 sigma-aldrich 采购试剂的努力, 结果收到了复杂的降解产物混合物, 并将所需化合物的 lt;15%。此外, 合成所报告的试剂本身也不是一个现实的选择, 因为公布的合成路线有些繁琐, 需要精密的有机化学设备, 而大多数放射化学和分子成像实验室--包括我们的实验室--根本不拥有。
针对这些障碍, 我们着手创建一种易于获取且高度稳定的苯氧基甲基磺酸试剂, 可通过坚固且合理、简单的合成路线获得。今年早些时候, 我们报告了一种模块化、稳定且易于获得的苯氧基甲基磺酸试剂 (称为 "pods"), 作为基于硫醇的生物共轭平台 (图1c 和图 3)22。peds 与 barbas 等人报告的试剂之间的主要区别是, 前者使用的是附着在苯氧基磺酸的苯胺环上, 而后者的特点是处于同一位置的苯酚 (图 4)。这一变化促进了更直接、更容易获得的合成路线, 以及--如果我们在商业上可获得的化合物方面的经验具有代表性--更稳定的最终试剂。在这项工作中, 我们还合成了一对含 pods 双功能螯合剂--pods-dfo 和 pods-chx-a '-dtpa--分别用于创建89zr 标记和177lu-taid 免疫共轭。正如我们将要讨论的, 我们已经证明, 基于 pod 的位选择生物共轭可重复和强大地创建均匀, 明确的, 高度免疫反应, 和高度稳定的放射免疫共轭。此外, 大肠癌小鼠模型的临床前实验表明, 与通过马来所合成的放射性标记抗体相比, 这些位点选择性标记的放射免疫共轭在体内表现出优越的性能。共轭。
这项工作的首要目标是促进创建定义明确、均匀、高度稳定和高度免疫反应的免疫共轭, 用于体外和体内应用。合成方法很简单, 几乎可以在任何实验室进行, 并且母 pds 试剂可以用大量不同的螯合剂、荧光剂或货物进行改性。在本协议和随附的视频中, 我们将描述简单的四步合成 peds (图 5);创建一个携带 dods 的 dota 变种, 这是一种广泛使用的螯合剂, 用于协调64cu、 68ga 、111 in、 177lu 和225ac (图 6);以及 dods-dota 与模型抗体 her2 靶向 igg1 trastuzumab 的生物结合 (图 7)。
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Protocol
1. 4-[5-(甲基硫磷)-1, 3, 4-恶二唑-2-基]-苯胺的合成 (1)
注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。
- 在10毫升圆形底瓶中, 溶解100毫克 (0.517 mmol, 1 当量) 5-(4-氨基苯基)-1, 3, 4-二亚唑-2-硫醇在3毫升甲醇。
- 在该溶液中, 加入360μl 的二异丙基乙胺 (dipea; 2.07 mmol; 4 当量; 无水) 和一个小磁搅拌杆。用橡胶塞子盖上烧瓶, 在室温下搅拌溶液10分钟。
- 使用1毫升玻璃注射器, 在橡胶塞子中戳一个孔, 并在这种混合物中快速添加 32μl (0.517 mmol, 1 当量) 的碘甲烷。让混合物在室温下反应45分钟。
注: 由于碘甲烷的潜在有害影响, 这种反应应在化学烟罩中进行。 - 将旋转蒸发器的水浴设置为40°c , 并慢慢降低压力, 去除溶剂以提供白色固体。
- 用分离漏斗用 0.1 m 碳酸钠的5毫升溶液将固体溶解在乙酸乙酯3毫升中至少三次。
注: 定期对紫外线灯下的水相进行现场测试;一旦灯下什么也看不见, 你就可以停止洗。 - 在分离漏斗中收集有机相, 用清水清洗, 直到水相的 ph 值达到 6.8-7.0 (使用 ph 纸)。
- 收集有机相, 加入硫酸镁, 去除任何水的痕迹。
注: 硫酸镁应添加一个小铲子, 之后溶液应旋转。如果仍然看到干燥剂的细颗粒, 溶液是干燥的。如果没有, 添加少量的硫酸镁, 直到可以看到细颗粒。 - 使用中玻璃炸纸或滤纸过滤混合物。
- 使用旋转蒸发器蒸发挥发物, 该过程应产生所需的产品作为白色针头。
2. butyl[18-({4-[5-(甲基硫磷)-1, 3, 4-恶二唑-2-基] 苯叫做氨基)-15, 18-二氧基 4, 7, 10 三氧基-14-azaoctadicyl] 氨基甲酸酯 (2)
注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。
- 在25毫升圆形底瓶中, 溶解387毫克 (0.92 mmol, 1.0 当量) 的 nboc-n '-琥珀-4, 7, 10 三氧分析-1, 13-三苯胺在10毫升的二氯甲烷中。
- 对于此解决方案, 加入 480μl (2.76 mmol, 3 等效) 的 dimethylamino, 264 毫克 (1.38 mmol; 1.5 当量) n-乙基-n '-[3-(二甲胺) 丙基] 盐酸二酰亚胺 (edci), 200 毫克 (0.97 mmol, 1.1 当量) 1 。用玻璃塞子密封容器, 让反应在室温下搅拌5天。
注: 请注意二氯甲烷的蒸发。如果需要, 在整个一周内添加更多内容。 - 用1m 盐酸 (3 x 5 毫升) 溶液在分离漏斗中清洗混合物。
- 收集有机相, 并继续在分离漏斗中清洗, 首先使用 1 m na2co 3 (2 x 5 ml)的溶液, 然后用水 (3 x 5 ml)。
- 收集有机相并添加硫酸镁以去除任何水的痕迹 (参见步骤 1.7)。使用中玻璃炸纸或滤纸过滤混合物。
- 使用旋转蒸发器, 在降低压力的情况下去除挥发性溶剂, 以提供非白色固体。
- 将这种固体重新溶解在乙酸乙酯的10毫升中, 并通过逐渐 (例如, 一次2毫升) 添加30毫升的环已烷来沉淀产物。
- 用滤纸或中玻璃炸薯条过滤溶液, 使产品成为白色粉末。
3. butyl[18-({4-[5-(甲基磺基)-1, 3, 4-恶二唑-2-基] 苯基氨基)-15, 18-dix防-4, 7, 10-trioxa-14-azaoctadecyl] 氨基甲酸酯 (3)
注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。
- 在10毫升的圆底瓶中, 溶解30毫克 (0.05 mmol; 1 当量) 的2在4毫升的二氯甲烷中。
- 慢慢加入49毫克 (0.2 mmol; 4 当量) 的 70% m-氯苯甲酸到这种混合物, 并用玻璃塞覆盖反应容器。在室温下搅拌溶液过夜, 最终产生黄色混合物。
- 在分离漏斗中清洗黄色混合物, 首先用 0.1 m 溶液的 naoh (3 x 5 ml), 然后用水 (3 x 5 毫升)。
- 用硫酸镁干燥有机相, 并用中玻璃炸薯条或滤纸过滤混合物。
- 使用旋转蒸发器, 在降低压力下去除溶剂, 以获得作为苍白固体的产品。
4. 合成 n1-(3-{2-[2-[2-[2-[2-[2-[2----(3-氨基丙基) 乙氧基乙氧基]-乙氧基} 丙基)-n 4-{{5-(甲基磺基)-1, 3, 4-恶二唑-2-----琥珀酰 (ods)
- 在25毫升的圆底瓶中, 溶解30毫克的 3 在2.0 毫升的二氯甲烷。
- 加入400μl 的三氟乙酸, 用玻璃塞密封烧瓶。
- 在室温下搅拌反应混合物3小时。
- 使用旋转蒸发器, 在室温下在降低压力的情况下去除挥发物, 留下油性残留物。
- 将油性残留物溶解在7毫升的水中, 并使用分离漏斗, 用乙酸乙酯 (3 x 4 毫升) 清洗。保持水层。
- 对水层进行冻磨, 使其成为白色粉末。
注: ods 的摩尔吸收系数分别为 9, 900 和 12, 400 厘米-1 m-1.
5. dods-dota 的合成
- 在 1.5 ml 微离心管中, 将10毫克的 pods 溶解在300μl 的二甲基亚硫酸盐中 (0.018 mmol; 1 当量), 并添加26μl 的 n、n-二异丙基乙胺 (0.15 mmol; 8个当量)。
- 将15.2 毫克的 DOTA-Bn-NCS (0.02 mmol; 1.2 当量) 溶解在100μl 的二甲基亚硫醚中, 并将该溶液与步骤5.1 中的溶液结合使用。密封微离心管。
- 允许反应在室温下孵育一夜。
- 采用反相c18 高效液相色谱法纯化产品, 去除任何未反应的 DOTA-Bn-NCS。
注: 保留时间显然在很大程度上取决于每个实验室的 hplc 设备 (泵、柱、油管等), 在纯化之前应进行适当的控制。但是, 举一个例子, 如果使用的梯度为 5:95 mecn/2o (均为 0.1% tfa) 至 70:30 mecnn/2 o (均为 0.1% tfa) 超过 30分钟, 则使用半制备方法 19 x 250 mm c18列, 流量为 6 mm/min, dods、p-scn-bn-dota 和 dods-dota 的保留时间将分别为14.4、18.8 和19.6 分钟左右。所有这三种化合物都可以在254纳米的环境中进行监测。
6. dods-dota 与氨库珠单抗的生物结合
注: 对于此步骤, 我们从一个 16.4 mgml 库存解决方案开始。
- 在低蛋白结合 1.5 ml 微离心管中, 稀释曲舒马布库存溶液的 61μl (1 毫克; 6.67 nmol, 1 当量), 并含有859μl 的磷酸盐缓冲盐 (ph 7.4)。
- 在这种混合物中, 加入6.7μl 的新鲜制造的 10 mm 溶液中的 tcep在 h2o (66.7 nmol, 10 当量)。
- 在 dmso 中制备 1 mg/dota 溶液, 并将该 dods-dota 溶液的73μl 添加到反应混合物中 (66.67 nmol, 10个当量)。
- 密封微离心管, 在室温下孵育溶液2小时。
- 2小时后, 使用预包装的一次性尺寸排除脱盐柱纯化免疫共轭。
- 首先, 按照供应商的描述, 对尺寸排除柱进行平衡, 以去除储存过程中列中存在的任何防腐剂。一个典型的过程是用与柱体积相对应的 pbs 卷清洗柱 5次: 5 x 2.5 ml 的 pbs。
- 接下来, 将反应混合物加入到尺寸排除列中, 注意反应混合物的体积。
- 反应混合物进入柱后, 加入适量的 pbs, 使添加到柱中的溶液总量达到 2.5 ml。例如, 如果共轭反应导致总体积为 1.3 ml, 则需要在列中添加 1.2 ml 的额外 pbs。
- 最后, 以 pbs 2 毫升为洗脱剂对产品进行收集。
- 用离心过滤装置浓缩最终免疫共轭, 并采用 50 kda 分子量截止。
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Representative Results
该协议的前四个步骤----pods 的合成----被设计为具有鲁棒性和可靠性。5-(4-氨基苯基)-1, 3, 4-恶二唑-2-硫醇的分解和替代, 形成所需的硫醚产品, 仅45分钟后就能使硫醚的产率达到 gt;99%。其次, 通过标准的肽偶联过程, 实现了 1和 n-bc-n '-琥珀-4、7、10-三氧分析-1, 13 三苯胺的结扎, 从而以55% 的收率收集了产品 (2)。然后, 用广泛使用的氧化剂--m-氯前氧苯甲酸对2进行氧化。在洗涤步骤下, 3为苍白固体, 产率约为90%。最后, 按照标准程序, 采用双氯甲烷4:1 比: 三氟乙酸, 将叔丁基氧基碳基保护基团从3中去除。在水相的冻干后, 我们的产品--ped--被制成白色粉末, 收率为98%。通过薄层色谱法观察了反应的进展, 并通过1h-nmr、 13c-nmr 和 hrms-esi (表 1) 确认了每个产物的同一性。
peds 试剂的主要优点之一是其模块化。各种螯合剂、荧光剂、毒素或其他货物可以附加到化合物的吊坠胺上。在手边的协议中, 我们使用无处不在的螯合剂 dota (1, 4, 7, 10 四氮唑吡啶-1, 4, 7, 10 四乙酸) 作为具有代表性的有效载荷。当然, dota 已被广泛用于生物分子放射性药物, 作为放射性金属的螯合剂, 包括68ga、 64cu、 111in、90 y、 177lu 和225ac. 为此, 采用了 dota (p-scn-bn-dota) 的异硫氰酸酯----通过直接耦合条件, 并将其与 dods 的挂件胺耦合。然后采用反相 c18 高效液相色谱法纯化所产生的双功能螯合剂, 并分离出约75% 的收率。与其他前体一样, 反应的进展是通过薄层色谱法进行的, 产品的特性通过1h-nmr、 13c-nmr 和 hrms-esi 得到确认 (表 1)。
在协议的最后一步, 我们讨论了 dods-dota 与模型免疫球蛋白的位点选择性生物共轭, 即 her2 靶向抗体 trastuzumab。为此, 与还原剂 tcep [tris(2 羧基乙基) 磷化氢] 选择性地降低了抗体铰链区域的二硫连接。在这一还原步骤之后, 抗体在室温下与 dods-dota 孵育 2小时, 然后通过尺寸排除色谱进行纯化。在这种情况下, 纯化后的 d直至含 dat 免疫共轭获得约80% 的收率, maldi-tof 分析显示出 ~ 1.8 dta/mab 的标记 (dol)。一般来说, 我们发现10种 tcep 当量、10种 tods 试剂当量和2小时孵育足以产生具有 2 podsmab 的 dol 的免疫共轭 (表 2)。这一结果在一系列人类、人性化和嵌合的 igg1 抗体中保持一致;然而, 相同的条件产生免疫共轭与 dol 只有 ~ 1.5 时, 与小鼠 igg1 抗体。所有这些都表示, 研究人员应该优化这些反应条件, 以获得新的抗体和含有 pod 的货物。最后, 重要的是, 关于最终产品, 我们反复和可重复地发现, 基于 pod 的免疫共轭物表现出的免疫反应与使用随机或基于 maleimi 的类似结构相当或更好共轭策略。
图 1:使用 (a) 氨基反应性、(b) 含马来酰亚胺和 (c) 含 pod 货物的生物共轭示意图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:迈克尔添加一个具有硫醇的生物分子 (绿色) 和放射性核素携带的 maleimide (黄色), 形成放射性标记的生物共轭, 以及额外的反应, 放射性标记结构可以在存在内源性的存在带硫醇的分子 (粉红色)。rt = 室温。图在 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合器的许可下重印, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:peds 和硫醇之间的反应示意图。图在 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合器的许可下重印, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:barbas 等人第18、19号报告的 peds (a ) 以及 (b)试剂的结构请点击此处查看这一数字的更大版本.
图 5:peds 四步合成方案。图在 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合器的许可下重印, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:dods-dota 的合成方案。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:沙尿瘤与 dods-dota 的生物共轭方案。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8:采用 pod (89 zr-dfo-fod-fos-hua33) 和马来化 (89zr-dfo-mal-hua33) 生物共轭策略创建的 hua33 89 zr 标记放射免疫共轭物体内行为的比较. 注射 89 zr-dfo-fods-hua33 和89后携带 a33 抗原表达 sw1222 结直肠癌异种移植 (白色箭头) 的运动裸鼠的平面 (左) 和最大强度投影 (右) pet 图像zr-dfo-mal-hua33 (140μi, 60-65μg)。冠状切片与肿瘤的中心相交。图在 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合器的许可下重印, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9:采用 pod (89 zr-dfo-fod-fos-hua33) 和马来化 (89zr-dfo-mal-hua33) 生物共轭策略创建的 hua33 89 zr 标记放射免疫共轭物体内行为的比较. 对患有 a33抗原表达皮下 sw1222 的人的结直肠癌裸鼠施用 89 zr-fo-fo-fo-fo-fo-hua33 和89zr-dfo-mal-hua33 (30μci, 15-18μg) 后的生物分布数据。胃、小肠和大肠的值包括内容物。图在 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合器的许可下重印, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
| 复合 | 1h-nmr 移位 | 13c-nmr 转移 | 人力资源管理系统 | |||
| 1 | (500 mhz, cdcl 3) 7.79 (2h, d, j = 8.5 hz), 6.72 (2h, d, j = 8.5 hz), 4.04 (2h, br), 2.75 (3h, s) | (125 mhz, cdcl3) 166.3、166.3、14.9.7、128.5、114.8、1135、14。8 | m/z calcd 用于 [c9h9 n3 os +h]+: 208.0539;发现: 208.0539;-: 0.0 ppm | |||
| 2 | (500 mhz, cdcl3) 9.68 (1h, s)、7.91 (2h、d、j = 9.68 hz)、7.91 (2h、d、j = 8.5 hz)、6.82 (1h、s)、4.99 (1h, s)、3.70-3.45 (12h, m)、3.70 (2h、q、j = 6.0 hz)、3.70 (2h、q、j = 6.5 hz)、2.76 (3h, s)、2.76 (2h、m)、2.76 (2h), m), 1.80-1.70 (4h, m), 1.80 (9h, s) | (125 mhz, cdcl3) 172.6、172.6、165.8、165.8、156.2、141.8、127.7、119.6、119.6、79.2、79.2、79.2、79.2、70.1、69.6、38.8、38.5、38.8、38.8, 29.9、28.6、14。8 | m/z calcd 用于 [c28h43n5o8 s + na]+: 632.2725;发现: 632.2722;--0.47 ppm | |||
| 3个 | (500 mhz,cdcl 3) 9.99 (1h, s), 7.98 (2h, d, j = 9.99 hz), 7.98 (2h, d, j = 8.5 hz), 6.88 (1h, s)、4.99 (1h, s)、3.66-3.50 (15h, m)、3.66 (2h、q、j = 6.0 hz)、3.66 (2h、q、j = 6.5 hz)、2.71 (2h, m)、2.71 (2h, m), 1.80-1.70 (4h, m), 1.80 (9h, s) | (125 mhz, cdcl3) 172.6, 172.6, 166.5, 166.5, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 117/4, 79.1, 79.1, 79.1, 79.1, 70.9, 69.4, 38.8, 38.8, 38.8, 29.7, 28。4 | 姆贝兹 calcd 为 [c28h43n5o10s + h]+: 642.2803;发现: 642.2797;--0.93 ppm | |||
| 豆荚 | (500 mhz, d 2H) 7.85 (2h, d, j = 9.0 hz)、7.85 (2h、d、j = 8.5 hz)、3.60-3.45 (15h, m), 3.60 (2h, t, j = 6.5 hz), 3.60 (2h, t, j = 6.5 hz), 3.60 (2h, t, j = 7.0 hz), 2.67 (2h, t, j = 6.5 hz), 2.67 (2h (2h, t, j = 6.5 hz), 1.87 (2h, qt, j = 6.5 hz), 1.87 (2h, qt, j = 6.5 hz) | (125 mhz, d2o) 174.5, 174.5, 166.8, 166.8, 142.2, 128.6, 12.3, 11.3, 16.4, 69.4, 69.4, 69.4, 69.4, 42.5, 37.6, 37.6, 37.6, 30.7, 28.2, 26。4 | 姆贝兹 calcd 为 [c23h35n5 o8 s +h]+: 554 2.2279;发现: 542.2281;-: 0.37 ppm | |||
| DODS-DOTAA | (600 mhz,dmso-d 6) 10.46 (1h, s), 9.74 (1h, bs), 8.04 (2h, d, j = 8.6 hz), 7.99 (1h, s)、7.99 (1h, t, j = 5.0 hz)、7.99 (2h, d = 6.5 hz)、7.99 (2h、d、j = 7.9 hz)、7.99 (2h、d、j = 7.1 hz)、4.35-2.41 (45h, m), 3.70 (3h, s), 1.76 (2h, q, j = 6.3 hz), 1.76 (2h, q, j = 6.5 hz) | (125 mhz, dmso-d6) 171.8, 171.8, 166.1、166.1、158.8、158.8、129.8、129.3、119.5、119.5、111.5、111.5、11.4、70.2、70.2、70.2、68.7、68.7、43.4、43.4、36.3、36.3、30.4、29.8、29。1 | 姆贝兹 calcd为[c47h68n10o 16s2+ h]+: 1093.4334;发现: 1093.4327;--0.64 ppm | |||
表 1.所述合成中间体以及 dods 和 dods-dota 的表征数据。
| 抗体 | 类型 | 常量区域 | 耗氧量比率: mab |
| 人血浆 igg | 人类 | 人 igg | 2.1±0。1 |
| 曲苏祖马布 | 人性化 | 人类 igg1 | 2.0±0。1 |
| hua33 | 人性化 | 人类 igg1 | 2.1±0。1 |
| 西妥昔单抗 | 嵌 合 | 人类 igg1 | 2.2±0。1 |
| 9.6 里的资产 | 小 鼠 | 小鼠 igg1 | 1.4±0。1 |
| 小鼠血浆 igg | 小 鼠 | 小鼠 igg | 1.5±0。1 |
表 2.与含 pod 荧光体结合后不同抗体的标记程度。值显示标准偏差。经 adumau、p.、davydova、m.、zeglis、b. m. thiol-reace 双功能螯合剂的许可重印表格, 用于创建具有更好稳定性的近选择性改性放射免疫共轭。生物共轭化学。29, 1364-1372 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。
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Discussion
在本报告中, 我们选择不包括任何用于放射性标记或体内实验的协议。我们的理由很简单。关于前者, 基于 pod 的免疫共轭体的放射性标记与使用其他生物共轭策略合成的免疫共轭的放射标记一点不同, 这些程序已在其他地方进行了全面的审查 2.关于后者, 临床前体内实验的具体细节 (即小鼠模型、剂量等) 可能因应用和抗体抗原系统的不同而有很大差异。
我们之前对89个zr 标记的 hua33 变种进行的调查为基于 pod 的生物共轭的优势提供了一个令人信服的例证。hua33 是一种人性化的 igg1 抗体, 针对的是 a33 抗原, 这是一种在23,24结直肠癌中表达 gt;95% 的跨膜糖蛋白。在我们以前的手稿22中, 我们报告了使用 pod和顺因基生物共轭策略合成 89 zr-dfo-hua33 放射免疫共轭的过程。这两种放射性标记抗体--89 zr-dfo-fo-fos-hua33 和89zr-dfo-mal-hua33--在产量、纯度、特异性活性和免疫反应性方面都得到了制备。然而, 关键的是, 这两种放射免疫共轭物在人血清中表现出截然不同的稳定性: 在37°c 孵育7天后, 89zl-dfo-fo-fos-hua33 保持86±1% 的不变, 而其基于放射所的表兄弟仅为61±5%完整。在体内 pet 成像和生物分布实验中, 携带 a33 抗原表达 sw1222 的人类结直肠癌异种移植的耳液裸鼠体内行为存在明显差异 (图 8和图 9)。89zr-dfo-fo-fos-hua33 和89zr-fo-mal-hua33 在肿瘤组织中产生高活性浓度: 5 5.6±6. nitegn 和 49.6±9.3ocite-idp, 给药48小时后。然而, 马来基辐射免疫共轭在健康组织中产生的活性浓度明显高于基于 pod 的药物。例如, 89zh-fo-mal-hua33 在注射后120小时的肾脏、肝脏和骨骼中产生的活性浓度分别为3.1±0.5、2.7±0.4 和 12.2±0.4% idp, 其数值大大超过活性浓度由 89zhr-dfo-tods-hua33 在相同的组织 (1.4±0.1、1.2±0.3 和 4.4±0.6% id/g) 中产生。事实上, 89zhr-fo-podos-hua33 在注射后120小时的所有非目标组织 (大肠除外) 中产生的活性浓度较低, 而 zr-dfo-mal-hua33 为89。因此, 89zr-fo-fo-fo-dods-hua33 的肿瘤与器官活性浓度比普遍优于 89zr-dfo-mal-hua33;特别是与顺丁烯源性表兄弟相比, 基于 pod 的免疫共轭的肿瘤对肝脏、肿瘤对脾脏、肿瘤对肾和肿瘤与骨活性的浓度比几乎是倍。考虑到两种辐射免疫共轭之间的主要区别是螯合剂的生物共轭手柄, PODS-thiol 连杆机构的稳定性增强几乎可以肯定是导致这种在体内性能提高的原因。
从更广泛的角度来看, 抗体内探针与赖氨酸的非位点选择性生物共轭无疑是一种简单而简单的抗体修饰方法。然而, 在免疫球蛋白结构中分布的多个赖氨酸的存在意味着不可能对生物结合的精确部位或程度进行控制2。因此, 这种随机策略通常会产生定义不清和高度异质性的免疫共轭, 如果在抗原结合域3内发生结扎, 免疫反应可能会降低.现场选择性生物共轭方法的好处已经反复说明了辐射免疫共轭和抗体药物共轭 8,14,25, 26, 27,28,29,30。简而言之, 与传统方法相比, 现场选择性生物共轭策略不仅能产生更明确、更均匀的免疫共轭, 还能产生成像剂、放射免疫疗法和增强体内性能的 adc。然而, 与其他场地选择性修改策略相比, 基于 pod 的结扎在哪里？一般来说, 抗体的位点选择性修饰方法可分为四类: (1) 半胱氨酸残留量的结扎, (2) 重链糖类的操作, (3) 化学酶转化, (4) 使用基因工程4,5。当然, 这种分类系统并不完善, 有些方法 (例如, 用酶修改重链糖类) 不可避免地符合两类。每种策略都有其优点和缺点。基于基因工程的方法提供了对共轭部位的精细控制, 但它们复杂而昂贵, 分别为31、32、33。重链糖类的氧化耦合价格低廉, 而且简单, 但它们有可能对 34、35、36、37的免疫球蛋白的结构完整性造成氧化损伤 ,38。
硫醇生物共轭 (包括 peds) 的主要优点是其简单性和模块化。另一方面, 它们的主要局限性来自于抗体中存在多种硫醇, 这种特性降低了对共轭部位的控制程度和每个抗体的修改次数。从这个意义上说, 以硫醇为基础的结扎和抗体的结合, 已被基因工程, 拥有免费的半胱氨酸残留物是一个特别有吸引力的方法。正如我们所指出的, 马来酰亚胺基硫醇结扎的另一个局限性是琥珀酸基硫醚键在体内的逆行-迈克尔添加的敏感性。然而, 关键的是, 使用 pads 废除了这一问题。
在我们结束发言之前, 必须指出, 清洁行动计划技术的紧急性质可能会造成其自身的一系列障碍。例如, 目前没有 (目前) 商业上可以买到含有 pod 的双功能螯合剂, 也没有关于基于 pod 的免疫共轭物的临床药理学、毒理学或免疫原性的数据。然而, 我们认为, 基于 podes 的生物共轭有可能从根本上改变免疫结合物在实验室和临床合成的方式。目前, 我们只将这一化学技术应用于用于核成像和放射免疫治疗的放射免疫共轭材料的开发, 但对这种方法在构建抗体药物共轭物和放射免疫结合剂方面的效用进行了研究。其他生物分子药物目前正在进行中。最后, 我们真诚地希望, 该协议--特别是我们开发的简单化学--将有助于促进苯氧基二唑基甲基磺酸用于磺基共轭和刺激领域的转变。更稳定、更可靠的替代品。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢赛柯兰夏尔马博士的有益对话。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S.
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E.
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
