Summary
Neste protocolo, descreveremos a síntese de vagens, phenyoxadiazolyl metil sulfona-baseado reagente para a ligação local-seletivo de cargas para os tióis de biomoléculas, especialmente de anticorpos. Além disso, descreveremos a síntese e caracterização de um quelante bifuncional PODS-rolamento e sua conjugação com um anticorpo de modelo.
Abstract
Maleimide-rolamento bifuncionais sondas têm sido empregadas há décadas para a modificação de local-seletiva de tióis em biomoléculas, especialmente de anticorpos. Ainda conjugados com base em maleimide exibem limitada estabilidade in vivo, porque a ligação Tioéter de grufo pode sofrer uma reação retrô-Michael. Isso, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação. Ambos estes processos podem produzir concentrações elevadas de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuíram a concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Em 2018, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de 'PODS' — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado. Temos claramente demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição muito superior desempenho in vivo em comparação com radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseada em maleimide conjugações. Neste protocolo, descreveremos a síntese de quatro etapas de vagens, a criação de uma variante de vagens-rolamento bifuncional do quelante onipresente DOTA (PODS-DOTA) e a conjugação de vagens-DOTA para o direcionamento de HER2-anticorpo Trastuzumabe.
Introduction
Radiofarmacêuticos químicos têm explorado a seletividade e especificidade dos anticorpos para biomarcadores da doença para ambos imagem nuclear e direcionados a radioterapia1. Abordagem de longe o mais comum para o radioativos de anticorpos baseia-se a penhora indiscriminada de radiolabeled grupos prostético ou radiometal quelantes de aminoácidos — mais frequentemente lisinas — dentro da estrutura da imunoglobulina ( Figura 1A)2. Enquanto esta estratégia é certamente eficaz, sua natureza aleatória, não-local-específica pode criar problemas. Especificamente, bioconjugation tradicionais abordagens produzem mal definidos e immunoconjugates heterogêneo composto por misturas de milhares de regioisomers diferentes, cada um com seu próprio conjunto de propriedades biológicas e farmacológicas3. Além disso, bioconjugation aleatório pode impedir a imunorreatividade dos anticorpos se a carga é acrescentada aos domínios de antígeno-ligando a imunoglobulina.
Ao longo dos anos, uma variedade de estratégias de bioconjugation site-specific e local-seletiva foram desenvolvidos a fim de abordar estes problemas4,5. A mais comum dessas abordagens depende a ligadura de sondas de maleimide-rolamento aos grupos sulfidrila das cisteínas (figura 1B). Anticorpos IgG1 contêm naturalmente 4 pontes de dissulfeto inter cadeia, vínculos que podem ser seletivamente reduzidos para render capaz de sofrer reações de adição de Michael com maleimides para formar grufo Tioéter ligações grátis tióis. O uso de tióis e maleimides é, certamente, uma melhoria em relação a métodos tradicionais e uma grande variedade de synthons de maleimide-rolamento e quelantes bifuncionais estão atualmente disponíveis. No entanto, é importante notar que esta metodologia tem sérias limitações também. Immunoconjugates baseada em maleimide apresentam estabilidade limitada em vivo, pois a ligação Tioéter pode sofrer uma reação retrô-Michael (Figura 2),6,7,8,9, 10. isto, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação (por exemplo, glutationa ou albumina). Ambos estes processos podem aumentar as concentrações de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuir as concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Vários reagentes thiol-reactivos alternativos foram desenvolvidos na tentativa de contornar esses problemas, incluindo tosylates, bromo e iodo-acetyls e vinil sulfonas11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. no entanto, todas essas abordagens têm limitações que têm dificultado a sua aplicação generalizada.
Há cinco anos, o laboratório do falecido Carlos Barbas III no Scripps Research Institute foi pioneira no uso de sulfonas de metil phenyloxadiazolyl como reagentes para a formação seletiva de ligações altamente estáveis com tióis (Figura 1 e Figura 3) 18 , 19. os autores empregou uma variante de sulfona-rolamento de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína para modificar diversos anticorpos projetados para conter resíduos de cisteína livre, em última análise, produzindo immunoconjugates com maior estabilidade do que o análogo construções criadas usando sondas baseadas em maleimide. Ao ver este trabalho promissor, ficamos um pouco surpresos que esta tecnologia só tinha sido usada raramente em radioquímica e não tinha ainda sido usada em tudo na síntese de quelantes bifuncionais ou radioimmunoconjugates20,21 . Esta escassez de aplicativos, no entanto, logo começou a fazer mais sentido: várias tentativas de adquirir o reagente da Sigma-Aldrich resultaram no recebimento de misturas complexas de produtos de degradação com < 15% do composto desejado. Além disso, sintetizar o reagente relatado nos não era uma opção realista também, como a rota sintética publicada é um pouco complicada e requer equipamento sofisticado de química orgânica que mais radioquímica e imagem molecular laboratórios — incluindo a nossa — simplesmente não possuem.
Em resposta a esses obstáculos, nos propusemos a criar uma facilmente acessível e altamente estável phenyloxadiazolyl reagente de sulfona de metila que pode ser obtido através de uma rota sintética robusta e razoavelmente fáceis. No início deste ano, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de 'PODS' — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado (Figura 1 e Figura 3)22. A principal diferença entre cápsulas e o reagente relatado por Barbas, et al é que o antigo emprega um anel da anilina anexado para o agrupamento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl, enquanto este último dispõe de um fenol na mesma posição (Figura 4). Essa mudança facilita uma rota sintética mais simples e acessível, bem como — se nossa experiência com o composto comercialmente disponível é emblemática — um reagente final mais estável. Neste trabalho, nós também sintetizado um par de vagens-rolamento bifuncionais quelantes — PODS-DFO e vagens-CHX-A '-DTPA — para facilitar a criação de 89Zr - e 177Lu-rotulados radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos discutir, temos demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição superior desempenho in vivo comparado ao radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseado em maleimide conjugações.
O over-arching objetivo deste trabalho é facilitar a criação de immunoconjugates bem definidas, homogêneas, altamente estável e altamente immunoreactive para aplicações in vitro e in vivo. A abordagem sintética é bastante simples de ser realizada em quase qualquer laboratório, e o reagente de vagens do pai pode ser modificado com uma infinidade de diferentes quelantes, fluorophores ou cargas. No presente protocolo e o vídeo que acompanha, descreveremos a síntese simples, quatro etapas de vagens (Figura 5); a criação de uma variante de vagens-rolamento do DOTA, um quelante amplamente utilizado para a coordenação de 64Cu, 68Ga, 111, em 177Lu e 225Ac (Figura 6); e o bioconjugation de vagens-DOTA de um anticorpo de modelo, o Trastuzumabe HER2-direcionamento IgG1 (Figura 7).
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Protocol
1. a síntese de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: Devido à luz-sensibilidade do composto, mantenha todas as reacções em vasos de folha-cobertas.
- Em um 10 mL redondo balão de fundo, dissolver 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol em 3 mL de metanol.
- Para esta solução, adicionar 360 μL de diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 equivalentes; anidro) e uma barra de agitação magnética pequena. Cubra o frasco com uma rolha de borracha e agitar a solução durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Utilizando uma seringa de vidro de 1 mL, picar um buraco através da rolha de borracha e rapidamente adicionar 32 μL (0.517 mmol, 1 equivalente) de Iodometano para esta mistura. Permita que a mistura se reagir durante 45 minutos à temperatura ambiente.
Nota: Devido os potenciais efeitos nocivos de Iodometano, esta reação deve ser feita em uma coifa de química. - Definir o banho de água de um evaporador rotativo para 40 ° C e reduzir lentamente a pressão para remover o solvente para pagar um sólido branco.
- Dissolver o sólido em 3 mL de acetato de etilo e lave pelo menos três vezes com um 5 mL de solução de carbonato de sódio 0,1 M, usando um funil de separação.
Nota: Levar periodicamente local-testes da fase aquosa sob uma lâmpada UV; uma vez que nada é visto sob a lâmpada, você pode parar as lavagens. - Recolher a fase orgânica em um funil de separação e lave-o com água até que o pH da fase aquosa atinge 6,8-7,0 (usando papel de pH).
- Recolher a fase orgânica e adicionar sulfato de magnésio para eliminar quaisquer vestígios de água.
Nota: O sulfato de magnésio deve ser adicionado com uma espátula pequena, após o qual a solução deve ser rodada. Se as partículas finas do agente de secagem ainda são vistas, a solução é seca. Se não, adicione pequenas quantidades de sulfato de magnésio até partículas finas podem ser vistas. - Filtre a mistura usando um fritas de vidro médio ou papel de filtro.
- Evapore os voláteis usando um evaporador rotativo, um processo que deveria produzir o produto desejado como agulhas brancas.
2. a síntese de tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamato (2)
Nota: Devido à luz-sensibilidade do composto, mantenha todas as reacções em vasos de folha-cobertas.
- Em 25 mL de uma rodada de balão, dissolver 387 mg (0,92 mmol, 1,0 equivalente), de NBoc-n-Succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine, em 10 mL de diclorometano.
- Para esta solução, adicionar 480 μL (2.76 mmol, 3 equivalentes) de DIPEA, 264 mg (1.38 mmol; 1,5 equivalentes) de N-etil - n-[3-(dimetilamino) propil] carbodiimida cloridrato (EDCI) e 200 mg (0,97 mmol, 1,1 equivalentes) de 1. Selar o recipiente com uma tampa de vidro e deixe-a reação mexa por 5 dias à temperatura ambiente.
Nota: Esteja atento a evaporação de diclorometano. Se necessário, adicione mais durante toda a semana. - Lave a mistura em um funil de separação com uma solução de ácido clorídrico de 1 M (3 x 5 mL).
- Recolher a fase orgânica e continuar a lavá-la em um funil de separação, primeiro com uma solução de 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) e, em seguida, com água (3 x 5 mL).
- Recolher a fase orgânica e adicionar sulfato de magnésio para eliminar quaisquer vestígios de água (ver passo 1.7). Filtre a mistura usando um fritas de vidro médio ou papel de filtro.
- Usando um evaporador rotativo, remova os solventes voláteis sob pressão reduzida para pagar um sólido esbranquiçado.
- Dissolver novamente este sólido em 10 mL de acetato de etilo e precipitar o produto através da adição de gradual (por exemplo, 2 mL de cada vez) de 30 mL de ciclo-hexano.
- Filtre a solução com papel de filtro ou uma fritas de vidro médio para obter o produto como um pó branco.
3. a síntese de tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamato (3)
Nota: Devido à luz-sensibilidade do composto, mantenha todas as reacções em vasos de folha-cobertas.
- Em um balão de fundo redondo de 10 mL, dissolva 30 mg (0,05 mmol; 1 equivalente) de 2 em 4 mL de diclorometano.
- Lentamente adicione 49 mg (0,2 mmol; 4 equivalentes) do ácido m-chloroperbenzoic de 70% a esta mistura e cobrir o recipiente de reação com uma rolha de vidro. Agite a solução durante a noite à temperatura ambiente, em última análise, produzindo uma mistura de amarela.
- Lave a mistura de amarela em um funil de separação, primeiro com uma solução 0,1 M de NaOH (3 x 5 mL) e, em seguida, com água (3 x 5 mL).
- Seque a fase orgânica com sulfato de magnésio e filtrar a mistura usando um fritas de vidro médio ou papel de filtro.
- Usando um evaporador rotativo, remova os solventes sob pressão reduzida para obter o produto como um pálido sólido.
4. síntese de N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4- succinamide {4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenil} (PODS)
- Em 25 mL de uma rodada de balão, dissolver 30 mg de 3 em 2,0 mL de diclorometano.
- Adicionar 400 μL de ácido trifluoroacético e selar o balão com uma rolha de vidro.
- Agite a mistura de reação em temperatura ambiente por 3 horas.
- Usando um evaporador rotativo, remova os compostos voláteis sob pressão reduzida à temperatura ambiente, deixando um resíduo oleoso.
- Dissolver o resíduo oleoso em 7 mL de água e, usando um funil de separação, lavar com acetato de etila (3 x 4 mL). Mantenha a camada aquosa.
- Lyophilize a camada aquosa para pagar vagens como um pó branco.
Nota: Os coeficientes de absorção molar para sachês em 298 e 280 nm são 9.900 e 12.400 cm-1M-1, respectivamente.
5. a síntese de vagens-DOTA
- Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, dissolver em 300 μL de dimetil sulfóxido (0,018 mmol; 1 equivalente) de 10 mg de vagens e adicionar 26 μL de N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8 equivalentes).
- Dissolver 15,2 mg de DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1,2 equivalentes) em 100 μL de Dimetilsulfóxido e combinar esta solução com a solução da etapa 5.1. Feche o tubo de microcentrifugadora.
- Permitir que a reação a incubar durante uma noite em temperatura ambiente.
- Purifica o produto usando reverso-fase C18 HPLC cromatografia para remover qualquer DOTA-Bn-NCS não tenha reagido.
Nota: Tempos de retenção são obviamente altamente dependentes do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), e controles apropriados devem ser executados antes da purificação. No entanto, apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos com 0,1% TFA) para 70:30 MeCN/H2O (ambos com 0,1% TFA) são utilizados mais de 30 min, uma coluna de18 semipreparativa 19 x 250 mm C e uma vazão de 6 mL/min , Vagens, p-SCN-Bn-DOTA e DOTA-vagens terão tempos de retenção de 14,4, 18,8 e 19,6 min, respectivamente. Todos os três compostos podem ser monitorados em 254 nm.
6. o bioconjugation de vagens-DOTA de Trastuzumabe
Nota: Para esta etapa, iniciamos com uma solução stock de 16,4 mg/mL de trastuzumab.
- Em um tubo de microcentrifugadora baixa proteína ligação 1,5 mL, dilua 61 μL da solução estoque de trastuzumab (1mg; 6,67 nmol, 1 equivalente) com 859 μL de tampão fosfato solução salina (pH 7,4).
- A esta mistura, adicione 6.7 μL de 10mm recém-feitos solução do TCEP em H2O (66,7 nmol, 10 equivalentes).
- Preparar uma solução de 1 mg/mL de vagens-DOTA em DMSO e adicionar 73 μL desta solução de vagens-DOTA a mistura de reacção (66.67 nmol, 10 equivalentes).
- Selar o microcentrifuga tubo e incubar a solução por 2 horas a temperatura ambiente.
- Depois de 2 horas, purifica o immunoconjugate usando uma coluna do desalting exclusão de tamanho descartáveis pré-embalados.
- Primeiro, equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, conforme descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Um procedimento típico envolve a coluna 5 vezes com um volume de PBS que corresponde ao volume da coluna de lavagem: 5 x 2,5 mL de PBS.
- Em seguida, adicione a mistura de reação à coluna de exclusão de tamanho, observando o volume da mistura de reação.
- Após a mistura de reação entrou a coluna, adicionar uma quantidade adequada de PBS para trazer o volume total da solução adicionado à coluna de 2,5 mL. Por exemplo, se a reação de conjugação resultou em um volume total de 1,3 mL, 1,2 mL de PBS adicional precisa ser adicionado à coluna.
- Finalmente, recolha o produto usando 2 mL de PBS como eluente.
- Concentre-se no final immunoconjugate com unidades de filtragem centrífuga com um corte de peso molecular 50 kDa.
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Representative Results
As quatro primeiras etapas deste protocolo — a síntese de vagens — ter sido projetado para ser robusto e confiável. A deprotonação e substituição de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol para formar o produto desejado Tioéter proporciona o Tioéter em > 99% de rendimento após apenas 45 minutos. Em seguida, a ligadura entre 1 e N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine foi conseguida através de um peptídeo padrão procedimento de acoplamento, resultando na coleção do produto (2) com 55% de rendimento. Em seguida, a oxidação de 2 foi realizada usando ácido m-chloroperoxybenzoic, um oxidante amplamente utilizado. Seguindo os passos de lavagem, 3 foi obtido como um sólido pálido com ~ 90% de rendimento. Finalmente, a eliminação do grupo tert-butyloxycarbonyl protegendo de 3 foi feita de acordo com os procedimentos padrão, usando uma proporção de 4:1 de ácido dichloromethane:trifluoroacetic. Após a liofilização da fase aquosa, nosso produto — PODS — obteve-se como um pó branco com 98% de rendimento. Seguiu-se o progresso da reação através de cromatografia em camada fina, e a identidade de cada produto foi confirmada via 1H-NMR, 13C-NMR e HRMS-ESI (tabela 1).
Uma das principais vantagens do reagente vagens é sua modularidade. Uma variedade de quelantes, fluorophores, toxinas ou outras cargas pode ser acrescentada a amina de pingente do composto. O protocolo em mãos, estamos usando o onipresente quelante DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-etilenodiaminotetracético) como uma carga representativa. DOTA, é claro, tem sido utilizado em uma ampla gama de produtos radiofarmacêuticos biomolecular como um quelante para radiometals incluindo 68Ga, 64Cu, 111, em 90Y, 177Lu e 225Ac. Para este fim, uma variante de isotiocianato-rolamento do DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) foi empregado e acoplado à amina de pingente de vagens através de condições de acoplamento direto. O quelante bifuncional resultante foi então purificado através de fase reversa C18 HPLC e isolado em ~ 75% de rendimento. Como com os outros precursores, seguiu-se o progresso da reação através de cromatografia em camada fina, e a identidade do produto foi confirmada via 1H-NMR, 13C-NMR e HRMS-ESI (tabela 1).
Na etapa final do protocolo, discutimos o bioconjugation site-seletiva de vagens-DOTA de uma imunoglobulina de modelo, o Trastuzumabe HER2-direcionamento de anticorpo. Para este efeito, as ligações de bissulfeto de região de dobradiça do anticorpo são seletivamente reduzidas com o agente redutor TCEP [tris(2-carboxyethyl) fosfina]. Após esta etapa de redução, o anticorpo é incubado com vagens-DOTA para 2 h à temperatura ambiente e posteriormente purificado através de cromatografia de exclusão. Neste caso, o immunoconjugate purificado, DOTA-rolamento foi obtido com ~ 80% de rendimento, e MALDI-ToF análise revelou um grau de rotulagem (DOL) de ~1.8 DOTA/mAb. De um modo geral, achamos que 10 equivalentes do TCEP, 10 equivalentes de reagente de vagens e uma incubação de 2 h são suficientes para produzir um immunoconjugate com um DOL de 2 cápsulas/mAb (tabela 2). Este resultado permanece consistente em toda uma gama de anticorpos de IgG1 quiméricoes humanos e humanizados; no entanto, as mesmas condições produzem immunoconjugates com um DOL de apenas ~1.5 ao trabalhar com anticorpos de IgG1 murino. Tudo isto dito, pesquisadores devem otimizar a estas condições de reação para novos anticorpos e cargas de vagens-rolamento. Finalmente e importante, com relação ao produto final, repetidamente e reproducibly encontramos que immunoconjugates baseados em vagens apresentam immunoreactivities iguais ou melhores do que construções análogas criadas usando aleatório ou baseados em maleimide estratégias de conjugação.
Figura 1: Ilustração esquemática de bioconjugations usando o (A) (B) amina reativos, maleimide-rolamento e as cargas (C) PODS-rolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A adição de Michael de uma biomolécula thiol-rolamento (verde) e um radionuclídeo-rolamento maleimide (amarelo) para formar um bioconjugate radiolabeled, bem como as reações adicionais a construção radiolabeled pode sofrer na presença endógena moléculas de Thiol-rolamento (rosa). RT = temperatura ambiente. Figura reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema da reação entre PODS e um tiol. Figura reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A estrutura de vagens (A) , bem como (B) o reagente relatado por Barbas, et al.18,19clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquema da síntese quatro etapas de vagens. Figura reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Esquema da síntese de vagens-DOTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Esquema da bioconjugation de Trastuzumabe com vagens-DOTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Comparação do comportamento in vivo de 89radioimmunoconjugates Zr-rotulado de huA33 criado usando baseado em vagens (89Zr-DFO-PODS-huA33) e estratégias de bioconjugation baseada em maleimide (89Zr-DFO-mal-huA33). Planar (à esquerda) e imagens de PET de projeção (à direita) de intensidade máxima de camundongos modelo A33 antígeno-expressando SW1222 câncer colorretal xenografts (seta branca) após a injeção de 89Zr-DFO-PODS-huA33 e 89 do rolamento ZR-DFO-mal-huA33 (µCi 140, 60-65 µ g). As fatias coronais cruzam o centro dos tumores. Figura reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Comparação do comportamento in vivo de 89radioimmunoconjugates Zr-rotulado de huA33 criado usando baseado em vagens (89Zr-DFO-PODS-huA33) e estratégias de bioconjugation baseada em maleimide (89Zr-DFO-mal-huA33). Dados de biodistribuição após a administração de 89Zr-DFO-PODS-huA33 e 89Zr-DFO-mal-huA33 (µCi 30, 15-18 µ g) de camundongos modelo rolamento A33 antígeno-expressando subcutâneos xenografts SW1222 humana de cancro colo-rectal. Os valores para o estômago, intestino delgado e intestino grosso incluem conteúdo. Figura reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto | 1 H-NMR turnos | 13 C-NMR turnos | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, br s), 2,75 (3h, s) | (125 MHz, CDCl3) 166.3 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113.5, 14,8 | m/z calculado para [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; encontrado: 208.0539; Δ: 0.0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,82 (1H, s), 4,99 (1H, s), 3.70-3,45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = 6,0 Hz), 3.20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2,76 (3h, s), 2,71 (2H, m), 2,63 (2h m), 1,70-1,80 (4 H, m), 1,42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141,8, 127,7, 1.19.6, 118,6, 79,2, 70.6, 70,5, 70,3, 70.1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 | m/z calculado para [C28H43N5O8S + nd]+: 632.2725; encontrado: 632.2722; Δ:-0,470 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6,0 Hz), 3.20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2,71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1,70-1,80 (4H, m), 1,43 (9H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171,5, 166.5, 161,6, 156.1, 143.4, 128,7, 1.19.6, 116,4, 79.1, 70,5, 70,4, 70,2, 70,0, 69,4, 43.0, 38,8, 38,4, 33,2, 31,3, 29,7, 28,4 | m/z Calculado por [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; encontrado: 642.2797; Δ:-0,930 ppm | |||
| VAGENS | (500 MHz, O D2) 7.85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7.55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3.60-3,45 (15 H, m), 3,45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2,67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2.54 (2h t, J = 6,5 Hz), 1.87 (H 2, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (H 2, qt, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, O D2) 174,5, 173,2, 166,8, 161.4, 142.2, 128,6, 120.3, 116.6, 69,4, 69,4, 69,3, 69.2, 68,2, 68,2, 42,5, 37,6, 36,2, 31,9, 30.7, 28,2, 26,4 | m/z Calculado para [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; encontrado: 542.2281; Δ: 0,37 ppm | |||
| VAGENS-DOTA | (600 MHz, DMSO-d6) 10,46 (1 H, s), 9,74 (1h, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7.99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7,24 (2 H, d, J = 7,1 Hz), 4.35-2,41 (45 H, m) , 3.70 (3h, s), 1,76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, DMSO-d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162,2, 158,8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119,5, 118,5, 116,5, 116,4, 70,2, 70.1, 70,0, 68,7, 68,5, 43,4, 41,8, 36,3, 32,2, 30,4, 29,8, 29,1 | m/z Calculado para [C47H68N10Ó16S2+ H]+: 1093.4334; encontrado: 1093.4327; Δ:-0,640 ppm | |||
Tabela 1. Dados de caracterização para os intermediários sintéticos descreveram assim como vagens e vagens-DOTA.
| Anticorpo | Tipo | Região constante | Proporção de vagens: mAb |
| Plasma humano IgG | Humana | IgG humano | 2,1 ± 0.1 |
| Trastuzumabe | Humanizado | IgG1 humana | 2,0 ± 0.1 |
| huA33 | Humanizado | IgG1 humana | 2,1 ± 0.1 |
| Cetuximab | Quimérico | IgG1 humana | 2.2 ± 0.1 |
| AR 9.6 | Murino | IgG1 murino | 1.4 ± 0.1 |
| Plasma de mouse IgG | Murino | IgG murino | 1,5 ± 0.1 |
Tabela 2. Grau de rotulagem de diferentes anticorpos após conjugação com um fluoróforo PODS-rolamento. Os valores são mostrados os desvios-padrão. Tabela reimpressa com permissão da Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. de quelantes Thiol-reativos bifuncionais para a criação de Site-seletivamente modificado Radioimmunoconjugates com estabilidade melhorada. Bioconjugate química. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.
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Discussion
Neste relatório, decidimos não incluir quaisquer protocolos para experimentação radioativos ou in vivo. Nossos motivos são simples. No que diz respeito ao primeiro, o radioativos de uma immunoconjugate baseada em vagens não difere em tudo isso de um immunoconjugate sintetizado usando outras estratégias bioconjugation, e esses procedimentos têm sido exaustivamente analisado em outro lugar2 . No que diz respeito a último, as especificidades de pré-clínicos experimentos in vivo (i.e., modelos de rato, doses, etc.) podem variar amplamente de acordo com o aplicativo e o sistema de anticorpo/antigénio.
Nossas investigações anteriores com 89Zr-rotulado variantes de huA33 fornecem uma ilustração convincente das vantagens do bioconjugations baseado em vagens. HuA33 é um anticorpo IgG1 humanizado que tem como alvo o antígeno A33, uma glicoproteína transmembrana expressado em > 95% dos cancros colo-rectais23,24. No nosso manuscrito anterior22, relatamos a síntese de 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate usando os dois PODS e maleimide-estratégias baseadas em bioconjugation. Os dois radiolabeled anticorpos — 89Zr-DFO-PODS-huA33 e 89Zr-DFO-mal-huA33 — foram produzidos na imunorreatividade, pureza, atividade de especificidade e rendimento quase idêntico. Criticamente, no entanto, os dois radioimmunoconjugates exibiu estabilidades dramaticamente diferentes no soro humano: após incubação durante sete dias a 37 ° C, 89Zr-DFO-PODS-huA33 permaneceu 86 ± 1% intacta, enquanto seu primo maleimide-baseado era apenas 61 ± 5% intacto. Imagens de PET in vivo e biodistribuição experimentos em camundongos modelo rolamento A33 antígeno-expressando SW1222 humano câncer colorretal xenografts revelou austeros diferenças no comportamento in vivo das duas radioimmunoconjugates (Figura 8 e Figura 9). Tanto 89Zr-DFO-PODS-huA33 e 89Zr-DFO-mal-huA33 produzem concentrações de alta atividade no tecido do tumor: 56,4 ± 6.9%ID/g e 49,6 ± 9.3%ID/g, respectivamente, 48 h após a administração. No entanto, a radioimmunoconjugate baseada em maleimide produzido significativamente altas concentrações de actividade em tecidos saudáveis do que o agente baseado em vagens. Por exemplo, 89Zr-DFO-mal-huA33 produzidas concentrações de atividade de 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 e 0,4 ± 12,2% ID/g nos rins, fígado e ossos, respectivamente, no pós-injeção de 120h, valores que excedam drasticamente as concentrações de atividade produzido por 89Zr-DFO-PODS-huA33 nos mesmos tecidos (1,4 ± 0.1, 1,2 ± 0,3 e 4,3 ± 0,6% ID/g). Com efeito, 89Zr-DFO-PODS-huA33 produzidas concentrações de actividade em todos os tecidos não-alvo (exceto o intestino grosso) no pós-injeção de 120h em comparação com 89Zr-DFO-mal-huA33. Como resultado, as proporções de concentração de atividade do tumor-para-órgão para 89Zr-DFO-PODS-huA33 são geralmente superiores aos de 89Zr-DFO-mal-huA33; em particular, o tumor-de-fígado, tumor-para-baço, tumor-para-renal e concentração de atividade do tumor-de-osso rácios são quase o dobro para o immunoconjugate baseada em vagens em comparação com seu primo maleimide-derivado. Considerando que a principal diferença entre os dois radioimmunoconjugates era o identificador de bioconjugation do quelante, o aumento da estabilidade da ligação PODS-tiol é quase certamente responsável por este desempenho melhorado em vivo.
Tendo uma visão mais ampla, o bioconjugation não-site-seletivo de sondas de lisinas dentro de anticorpos é, reconhecidamente, uma abordagem simples e fáceis para a modificação de anticorpos. No entanto, a presença de várias lisinas distribuído em toda a estrutura de imunoglobulinas significa que é impossível exercer controle sobre o local exato ou grau de bioconjugation2. Como resultado, esta estratégia aleatória produz muitas vezes mal definidos e immunoconjugates altamente heterogêneos que podem exibir diminuiu imunorreatividade se ligadura ocorre dentro de domínios o antígeno-ligando3. Os benefícios de abordagens local-seletiva para bioconjugation tem sido ilustrados repetidamente para ambos radioimmunoconjugates e droga-anticorpo cojugado8,14,25,26, 27,28,29,30. Em suma, não só bioconjugation site-seletiva estratégias produzem mais bem definida e homogênea immunoconjugates do que as metodologias tradicionais, também criam imagens agentes, radioimmunotherapeutics e ADCs com desempenho melhorado em vivo. No entanto, onde baseado em vagens ligadura coloco em comparação a outras estratégias de modificação local-seletiva? De um modo geral, as abordagens para a modificação de local-seletiva de anticorpos podem ser classificadas em quatro categorias: (1) ligadura de resíduos de cisteína, (2) a manipulação dos cadeia pesada os glicanos e transformações (3) chemoenzymatic (4) a utilização de engenharia genética4,5. Claro, este sistema de classificação não é perfeito, e algumas abordagens (por exemplo, a modificação de com enzimas, os glicanos a cadeia pesada), inevitavelmente, qualificar-se para duas categorias. Cada estratégia tem suas próprias vantagens e desvantagens. Abordagens baseadas em engenharia genética fornecem requintado controle sobre o site de conjugação, no entanto, são complexos e caros31,32,33. Acoplamentos oxidativos do cadeia pesada os glicanos são baratos e simples, no entanto, correm o risco de danos oxidativos para a integridade estrutural da imunoglobulina34,35,36,37 ,38.
A vantagem principal de thiol-baseado bioconjugations — vagens incluídas — é a sua simplicidade e modularidade. Sua principal limitação, por outro lado, decorre da presença de tióis múltiplas dentro de um anticorpo, uma característica que reduz o grau de controle sobre o site tanto de conjugação e o número de modificações por anticorpos. Neste sentido, a combinação de ligadura thiol-baseado e anticorpos que tem sido geneticamente projetados para possuir a resíduos de cisteína livre é uma abordagem particularmente atraente. Como já observamos, outra limitação de ligadura tiol baseada em maleimide é a susceptibilidade da ligação Tioéter grufo para retro-Michael adições em vivo. Ainda criticamente, o uso de PODS revoga este problema.
Antes de concluir, é importante observar que a natureza emergente da tecnologia vagens pode criar seu próprio conjunto de obstáculos. Por exemplo, não quelantes bifuncionais PODS-rolamento (atualmente) são comercialmente disponíveis e não há dados abordando a farmacologia clínica, toxicologia ou imunogenicidade de immunoconjugates baseado em vagens. No entanto, acreditamos que bioconjugations baseados em vagens têm o potencial de mudar fundamentalmente a maneira de immunoconjugates são sintetizados em laboratório e clínica. Neste momento, temos apenas aplicado esta tecnologia química para o desenvolvimento de radioimmunoconjugates para imagem nuclear e radioimmunotherapy, embora investigações sobre a utilidade desta abordagem para a construção de droga-anticorpo cojugado e outros medicamentos biomolecular estão em andamento. No final, esperamos sinceramente que este protocolo — e particularmente a química fácil e simples que nós desenvolvemos — ajudará a promover o uso de sulfonas de metil phenyloxadiazolyl baseados em sulfidrila conjugações e estimular uma mudança no campo de maleimides a alternativas mais estáveis e mais confiáveis.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. Sai Kiran Sharma conversas úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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