Summary
In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.
Abstract
Maleimide-Lager bifunktionelle Sonden sind seit Jahrzehnten für die Website-gezielte Modifizierung der Thiole in Biomolekülen, insbesondere Antikörper eingesetzt worden. Noch angezeigt Maleimide-basierte Konjugate begrenzten Stabilität in-vivo, da Succinimidyl-Thioether-Gestänge eine Retro-Michael-Reaktion unterzogen werden kann. Dies, führt natürlich zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf. Beide Prozesse können erhöhte Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe produzieren sowie Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte gesunken. Wir berichteten im Jahr 2018, die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt "PODS" – als Plattform für Thiol-basierten Bioconjugations. Wir haben klar gezeigt, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung weit überlegen in-vivo-Leistung im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen. In diesem Protokoll werden wir die vier-Stufen-Synthese von Hülsen, die Schaffung einer bifunktionelle Hülsen tragenden Variante des allgegenwärtigen Chelator DOTA (PODS-DOTA) und die Konjugation des PODS-DOTA, die HER2-targeting Antikörper Trastuzumab beschreiben.
Introduction
Radiopharmazeutischen Chemiker haben lange ausgenutzt, die Selektivität und Spezifität der Antikörper nach Biomarkern der Krankheit für die beiden nuklearen Bildgebung und gezielte Strahlentherapie1. Abstand der häufigste Ansatz für die enzymatische Antikörper gründet sich auf die wahllose Befestigung des radioaktiven prosthetischen Gruppen oder Radiometal Chelatoren an Aminosäuren – meist Lysines – innerhalb der Struktur von Immunglobulin ( Abbildung 1A)2. Während diese Strategie sicherlich wirksam ist, kann naturgemäß zufällige, nicht-Site-spezifische Probleme verursachen. Insbesondere traditionelle Biokonjugaten Ansätze zu produzieren, schlecht definiert und heterogenen Immunokonjugate bestehend aus Mischungen von Tausenden von verschiedenen Regioisomeren, jeweils mit einem eigenen Satz von biologischen und pharmakologischen Eigenschaften3. Darüber hinaus kann zufällige Biokonjugaten Immunoreactivity von Antikörpern behindern, wenn die Ladung an der Immunglobulin Antigen-bindenden Domänen angehängt wird.
Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von standortspezifischen und Website-selektive Biokonjugaten Strategien wurden entwickelt, um diese Probleme4,5ansprechen. Die häufigste dieser Ansätze stützt sich auf die Unterbindung der Maleimide tragenden Sonden, um die Sulfhydryl-Gruppen von Cysteine (Abbildung 1 b). IgG1-Antikörper enthalten von Natur aus 4 Inter Kette Disulfidbrücken, Verbindungen, die gezielt reduziert werden können, um in der Lage, Michael Hinzufügung Reaktionen mit Maleimides Succinimidyl Thioether Anleihen bilden derzeit kostenlos Thiole zu erbringen. Die Verwendung von Thiole und Maleimides ist sicherlich eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden und eine Vielzahl von Maleimide tragenden Synthone und bifunktionelle Chelatoren sind derzeit verfügbar. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Methode auch gravierende Einschränkungen hat. Maleimide-basierte Immunokonjugate aufweisen begrenzten Stabilität in-vivo, da Thioether Gestänge ein Retro-Michael-Reaktion (Abbildung 2)6,7,8,9, unterziehen kann 10., natürlich kann dies zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf (z. B. Glutathion oder Serum-Albumin). Beide Prozesse können die Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe zu erhöhen sowie die Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte zu verringern. Mehrere alternative Thiol-reaktive Reagenzien sind entwickelt worden, in dem Bemühen, diese Fragen, namentlich Tosylates, Bromo und Iodo-Acetyl- und Vinyl Sulfonen11,12,13, zu umgehen 14 , 15 , 16 , 17. all diese Ansätze haben jedoch Einschränkungen, die ihre breite Anwendung behindert haben.
Vor fünf Jahren Pionier das Labor des späten Carlos Barbas III am Scripps Research Institute im Einsatz von Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfonen als Reagenzien für die selektive Bildung von sehr stabile Verbindungen mit Thiole (Abbildung 1 und Abbildung 3) 18 , 19. die Autoren beschäftigt eine Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon-Lager Variante von Fluorescein, mehrere Antikörper entwickelt, um kostenlose Cystein Rückstände zu ändern Immunokonjugate letztlich höhere Stabilität als analog zu produzieren Konstruktionen mit Maleimide-basierte Sonden erstellt. Beim Anblick dieses vielversprechende Arbeit, waren wir etwas überrascht, dass diese Technologie nur kaum in Radiochemie verwendet worden hatte und noch nicht wurde überhaupt in der Synthese von bifunktionelle Chelatoren oder Radioimmunoconjugates20,21 verwendet hatte . Dieser Mangel an Anwendungen, jedoch bald fing an, mehr Sinn machen: mehrere Versuche zur Beschaffung von Reagenz von Sigma-Aldrich führte bei der Auszahlung der komplexe Mischungen von Zersetzungsprodukten mit < 15 % der gewünschten Verbindung. Darüber hinaus Synthese der gemeldeten Reagenz selbst war keine realistische Option, da die veröffentlichten Syntheseweg etwas umständlich ist und anspruchsvolle organische Chemie Geräte erfordert, die meisten Radiochemie und molekulare Bildgebung Labors – einschließlich der unsrigen — einfach nicht besitzen.
In Reaktion auf diese Hindernisse brachen wir erstellen eine leicht zugängliche und hochstabiles Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz, der über einen robusten und relativ einfache Syntheseweg erzielt werden kann. Anfang des Jahres berichteten wir die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt "PODS" – als Plattform für Thiol-basierte Bioconjugations (Abbildung 1 und Abbildung 3)22. Der wesentliche Unterschied zwischen Hülsen und das Reagenz von Barbas, berichtet ist Et Al., dass ersteres einen Anilin Ring befestigt Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon glyko-beschäftigt, während letztere verfügt über ein Phenol in der gleichen Position (Abbildung 4). Diese Änderung ermöglicht eine einfache und zugängliche Syntheseweg sowie – wenn unsere Erfahrung mit den im Handel erhältlichen Verbindung emblematischen ist — ein stabiler endgültige Reagenz. In dieser Arbeit haben wir auch ein paar Hülsen tragenden bifunktionelle Chelatoren synthetisiert — Hülsen-DFO und Hülsen-CHX-A''-DTPA – die Schaffung von 89Zr- und 177Lu-mit der Bezeichnung Radioimmunoconjugates bzw. zu erleichtern. Wie wir diskutieren werden, haben wir bewiesen, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung in-vivo Höchstleistungen im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist die Erstellung von klar definierten, homogene, hochstabile und hoch immunreaktiven Immunokonjugate für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu erleichtern. Der synthetischen Ansatz ist einfach genug, um in fast jedem Labor durchgeführt werden, und das übergeordnete PODS Reagenz kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Chelatoren, Fluorophore oder Ladungen geändert werden. In diesem Protokoll und das dazugehörige Video beschreiben wir die einfache, vierstufiges Synthese von Hülsen (Abbildung 5); die Schaffung einer Hülsen tragenden Variante von DOTA, eine weit verbreitete Chelator für die Koordinierung der 64Cu, 68Ga 111In 177Lu und 225Ac (Abbildung 6); und die Biokonjugaten von Hülsen-DOTA an einem Modell Antikörper, die HER2-targeting IgG1 Trastuzumab (Abbildung 7).
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Protocol
(1) die Synthese von 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Hinweis: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Verbindung, halten Sie alle Reaktionen in Gefäßen mit Folie abgedeckt.
- In einer 10 mL Runde untere Kolben, 100 mg (0.517 Mmol, 1 Äquivalent) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL Methanol auflösen.
- Diese Projektmappe hinzufügen 360 μL der Diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 Mmol; 4 Entsprechungen; wasserfrei) und eine kleine magnetische Stir Bar. Decken Sie die Flasche mit einem Gummistopfen und rühren Sie die Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Mit einer 1 mL-Glas-Spritze, poke ein Loch durch den Gummistopfen und 32 μL (0.517 Mmol, 1 Äquivalent) der Iodomethane schnell zu dieser Mischung hinzufügen. Lassen Sie die Mischung für 45 Minuten bei Raumtemperatur zu reagieren.
Hinweis: Aufgrund der möglichen schädlichen Auswirkungen von Iodomethane sollte diese Reaktion in einem chemischen Abzug erfolgen. - Das Wasserbad einen Drehverdampfer auf 40 ° C und reduzieren Sie langsam den Druck, die Lösungsmittel um ein weißer Feststoff leisten zu entfernen.
- Lösen Sie der Feststoff in 3 mL Ethylacetat auf und waschen Sie mindestens dreimal mit einer 5 mL Lösung von 0,1 M Natriumcarbonat mit einem separatory Trichter.
Hinweis: In regelmäßigen Abständen nehmen Sie vor Ort-Tests von der wässrigen Phase unter einer UV-Lampe; Sobald nichts unter der Lampe zu sehen ist, können Sie die Waschungen beenden. - Die organische Phase in einem separatory Trichter zu sammeln und mit Wasser waschen, bis der pH-Wert der wässrigen Phase 6,8-7,0 erreicht (mit pH-Papier).
- Die organische Phase sammeln und Magnesiumsulfat entfernen Sie alle Spuren von Wasser hinzufügen.
Hinweis: Die Magnesium-Sulfat sollte mit einem kleinen Spatel hinzugefügt werden, wonach die Lösung verwirbelt werden sollte. Wenn Feinpartikel des Trocknungsmittels noch zu sehen sind, ist die Lösung trocken. Wenn dies nicht der Fall ist, fügen Sie kleine Mengen von Magnesium-Sulfat, bis feine Partikel gesehen werden können. - Filtern Sie das Gemisch mit einem mittleren Glasfritte oder Filterpapier.
- Verdampfen Sie die flüchtigen Bestandteile mit Drehverdampfer, ein Prozess, der das gewünschte Produkt als weiße Nadeln produzieren sollte.
(2) die Synthese von Tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamat (2)
Hinweis: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Verbindung, halten Sie alle Reaktionen in Gefäßen mit Folie abgedeckt.
- In einer 25 mL Runde untere Kolben, Auflösen von 387 mg (0,92 Mmol, 1,0 Äquivalent) NBoc-N′-Succinyl-4,7,10-Trioxa-1,13-Tridecanediamine in 10 mL Dichlormethan.
- Diese Projektmappe hinzufügen 480 μl (2,76 Mmol, 3 Äquivalente) von DIPEA, 264 mg (1,38 Mmol; 1,5-Äquivalente) N-Ethyl - N′-[3-(Dimethylamino) Propyl] Carbodiimide Hydrochlorid (EDCI) und 200 mg (0,97 Mmol, 1,1 Äquivalente) 1. Verschließen Sie das Gefäß mit einem Glasstopfen und lassen Sie die Reaktion für 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Hinweis: Achten Sie auf die Verdunstung von Dichlormethan. Bei Bedarf fügen Sie mehr im Laufe der Woche. - Waschen Sie die Mischung in einem separatory Trichter mit einer Lösung aus 1 M Salzsäure (3 x 5 mL).
- Die organische Phase sammeln und weiterhin in einem separatory Trichter, zuerst mit einer Lösung aus 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) und dann mit Wasser (3 x 5 mL) waschen.
- Die organische Phase sammeln und Magnesiumsulfat entfernen Sie alle Spuren von Wasser hinzufügen (siehe Schritt 1,7). Filtern Sie das Gemisch mit einem mittleren Glasfritte oder Filterpapier.
- Mit einem Drehverdampfer entfernen Sie die flüchtige Lösungsmittel unter vermindertem Druck zu einem Off-White Solid leisten.
- Wieder lösen Sie dieses solide in 10 mL Ethylacetat auf und auszufällen Sie das Produkt über die schrittweise (z.B. 2 mL zu einem Zeitpunkt) Zugabe von 30 mL Cyclohexan.
- Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier oder eine mittlere Glasfritte, das Produkt als weißes Pulver zu erhalten.
(3) die Synthese von Tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamat (3)
Hinweis: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Verbindung, halten Sie alle Reaktionen in Gefäßen mit Folie abgedeckt.
- Lösen Sie in einem 10 mL Rundboden Kolben 30 mg (0,05 Mmol; 1 Äquivalent) 2 in 4 mL Dichlormethan auf.
- Langsam diese Mischung in 49 mg (0,2 Mmol; 4-Äquivalente) 70 % m-Chloroperbenzoic Säure hinzu und bedecken Sie den Reaktionsbehälter mit einem Glasstopfen. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, eine gelbe Mischung schließlich nachgeben.
- Waschen Sie die gelbe Mischung in einem separatory Trichter, zuerst mit einer 0,1 M NaOH (3 x 5 mL) und dann mit Wasser (3 x 5 mL).
- Die organische Phase mit Magnesiumsulfat getrocknet und die Mischung mit einem mittleren Glasfritte oder Filterpapier filtern.
- Mit einem Drehverdampfer entfernen Sie Lösungsmittel unter vermindertem Druck, das Produkt als blasse Feststoff zu erhalten.
(4) die Synthese von N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] Phenyl} Succinamide (PODS)
- In einer 25 mL Runde untere Kolben, 30 mg 3 in 2,0 mL Dichlormethan auflösen.
- Fügen Sie 400 μl Trifluoroacetic Säure und verschließen Sie die Flasche mit einem Glasstopfen.
- Rühren Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 3 Stunden.
- Mit einem Drehverdampfer, entfernen Sie die flüchtigen Bestandteile unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur, eine ölige Rückstände.
- Den öligen Rückstand in 7 mL Wasser auflösen und mit einem separatory Trichter, waschen mit Ethylacetat (3 x 4 mL). Halten Sie die wässrige Schicht.
- Lyophilize der wässrigen Schicht zur PODS als weißes Pulver zu leisten.
Hinweis: Die molare Absorption Koeffizienten für PODS bei 280 und 298 nm sind 9.900 und 12.400 zu cm-1M-1, beziehungsweise.
(5) die Synthese von Hülsen-DOTA
- In einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 10 mg der Hülsen in 300 μL der Dimethyl Sulfoxid (0.018 Mmol; 1 Äquivalent) auflösen und 26 μL von N, N-Diisopropylethylamine (0,15 Mmol; 8-Äquivalente) hinzufügen.
- Lösen sich 15,2 mg DOTA-Bn-NCS (0,02 Mmol; 1,2 Äquivalente) in 100 μl der Dimethylsulfoxide und kombinieren Sie diese Lösung mit der Lösung von Schritt 5.1. Versiegeln Sie den Microcentrifuge Schlauch.
- Lassen Sie die Reaktion auf über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
- Reinigen Sie das Produkt mit Reverse-Phase C18 HPLC Chromatographie um nicht umgesetztes DOTA-Bn-NCS zu entfernen.
Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Ausrüstung für jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.), und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide mit 0,1 % TFA) zu 70: 30 MeCN/H2O (beide mit 0,1 % TFA) über 30 min, eine semi-präparative 19 x 250 mm C18 -Spalte und einer Durchflussmenge von 6 mL/min werden verwendet , Hülsen, p-SCN-Bn-DOTA und Hülsen-DOTA wird Retentionszeiten von rund 14,4, 18,8 und 19,6 min, bzw. haben. Alle drei Verbindungen lässt sich bei 254 nm.
(6) die Biokonjugaten von Hülsen-DOTA zu trastuzumab
Hinweis: In diesem Schritt begannen wir mit einem 16,4 mg/mL Stammlösung von Trastuzumab.
- Verdünnen Sie in einem low-Protein Bindung 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 61 μL der Trastuzumab Vorratslösung (1 mg; 6,67 Nmol, 1 Äquivalent) mit 859 μL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4).
- Diese Mischung fügen Sie 6,7 μL einer frisch zubereiteten 10 mM-Lösung von DÄMMUND in H2O (66,7 Nmol, 10-äquivalente hinzu).
- Bereiten Sie eine 1 mg/mL Lösung von Hülsen-DOTA in DMSO und das Reaktionsgemisch (66.67 Nmol, 10 Äquivalente) fügen Sie 73 μl dieser PODS-DOTA-Lösung hinzu.
- Microcentrifuge Schlauch zu versiegeln und die Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
- Reinigen Sie nach 2 Stunden das Immunoconjugate eine vorverpackte Einweg Größe Ausgrenzung Entsalzung Spalte verwenden.
- Der Spalte "Größe Ausgrenzung" equilibrate zunächst wie beschrieben durch den Lieferanten, von Konservierungsstoffen in der Spalte vorhanden während der Lagerung zu entfernen. Eine typische Vorgehensweise beinhaltet Waschen der Spalte 5 Mal mit einem Volumen von PBS, die das Volumen der Spalte entspricht: 5 x 2,5 mL PBS.
- Fügen Sie das Reaktionsgemisch, Spalte "Größe-Ausschluss" feststellend, dass das Volumen des Reaktionsgemisches.
- Nachdem das Reaktionsgemisch die Spalte eingegeben hat, fügen Sie einen angemessenen Betrag von PBS, das Gesamtvolumen der Lösung hinzugefügt, um die Spalte zu bringen bis zu 2,5 mL. Zum Beispiel wenn die Konjugation Reaktion führte zu einem Gesamtvolumen von 1,3 mL, müssten 1,2 mL zusätzliche PBS die Spalte hinzugefügt werden.
- Schließlich sammeln Sie das Produkt mit 2 mL PBS als der Eluent.
- Konzentrieren Sie die endgültige Immunoconjugate mit zentrifugalen Filteranlagen mit einem 50 kDa Molekulargewicht Cut-off.
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Representative Results
Die ersten vier Schritte dieses Protokolls – die Synthese der Hülsen – wurden entwickelt, um robust und zuverlässig. Die Deprotonierung und Substitution von 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol bilden die gewünschte Thioether-Produkt bietet die Thioether in > 99 % Ausbeute nach nur 45 Minuten. Als nächstes wurde der Ligatur zwischen 1 und N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine über ein standard-Peptid Kupplung Verfahren, mit dem Ergebnis in der Auflistung des Produkts (2) in 55 % Rendite erzielt. Anschließend erfolgte die Oxidation von 2 mit m-Chloroperoxybenzoic Säure, ein weit verbreitetes Oxidationsmittel. Im Anschluss an die Waschschritte wurde 3 als blasse Feststoff in ca. 90 % Ausbeute erhalten. Schließlich erfolgte die Beseitigung der schützende Tert-Butyloxycarbonyl-Gruppe von 3 nach Standardverfahren, mit einem 4:1-Verhältnis von Dichloromethane:trifluoroacetic Säure. Nach der Gefriertrocknung von der wässrigen Phase, unser Produkt-PODS – wurde als weißes Pulver in 98 % Ausbeute erhalten. Der Fortschritt der Reaktion folgte per Dünnschichtchromatographie und die Identität der einzelnen Produkte über 1H-NMR, 13C-NMR und HRMS-ESI (Tabelle 1) bestätigt wurde.
Einer der wichtigsten Vorteile des PODS Reagenz ist seine Modularität. Eine Vielzahl von Chelatoren, Fluorophore, Giftstoffe oder anderen Ladungen kann die Verbindung Anhänger Amin beizufügen. Im Protokoll nutzen wir die allgegenwärtigen Chelator DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Tetraacetic Säure) als repräsentative Nutzlast. DOTA, natürlich, wird in einer Vielzahl von biomolekularen Radiopharmaka als ein Chelator für Radiometals einschließlich 68 64Cu, 111In 90Y, 177Lu, Ga und 225Ac. Zu diesem Zweck wurde eine Herstellung-Lager-Variante von DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) beschäftigt und mit Anhänger Amins der Hülsen über einfache Kopplung Bedingungen gekoppelt. Die daraus resultierende bifunktionelle Chelator wurde dann per reverse Phase C18 HPLC gereinigt und in ~ 75 % Ausbeute isoliert. Wie bei den anderen Vorläufern, der Fortschritt der Reaktion folgte per Dünnschichtchromatographie und die Identität des Produkts über 1H-NMR, 13C-NMR und HRMS-ESI (Tabelle 1) bestätigt wurde.
Im letzten Schritt des Protokolls besprechen wir die Website-selektive Biokonjugaten von Hülsen-DOTA zu einem Modell Immunglobulin, die HER2-targeting Antikörper Trastuzumab. Zu diesem Zweck die Disulfid-Verbindungen der Antikörper Scharnier Region gezielt mit Reduktionsmittel DÄMMUND reduziert [tris(2-carboxyethyl) Phosphin]. Nach diesem Reduzierungsschritt ist der Antikörper mit Hülsen-DOTA 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend über Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt. In diesem Fall die gereinigten, DOTA tragenden Immunoconjugate wurde in ~ 80 % Ausbeute erhalten, und MALDI-ToF-Analyse ergab eine gewisse Kennzeichnung (DOL) von ~1.8 DOTA/mAb. Generell haben wir festgestellt, dass 10 Äquivalente der DÄMMUND, 10 Entsprechungen für die PODS-Reagenz und einer 2 h Inkubation ausreichen, um eine Immunoconjugate mit einem DOL 2 PODS/MAB (Tabelle 2) zu erbringen sind. Dieses Ergebnis bleibt konsistent in den unterschiedlichsten menschlichen humanisierten und Chimären IgG1-Antikörper; die gleichen Bedingungen produziert jedoch Immunokonjugate mit einer DOL nur ~1.5 bei der Arbeit mit murinen IgG1-Antikörper. All dies sagte, Forscher diese Reaktionsbedingungen für neue Antikörper und Hülsen tragenden Ladungen optimieren sollten. Schließlich und vor allem in Bezug auf das Endprodukt fanden mehrfach und reproduzierbar wir, dass PODS-basierten Immunokonjugate Immunoreactivities gleich oder besser als analog Konstrukte erstellt mit zufälligen oder Maleimide-basierte zeigen Konjugation-Strategien.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Bioconjugations mit (A) Amin-reaktiv, (B) Maleimide-Lager, und (C) Hülsen tragenden Ladungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Die Michael-Zugabe ein Thiol-Lager Biomolekül (grün) und ein Radionuklid-Lager Maleimide (gelb), bilden einer radioaktiven Bioconjugate, sowie die zusätzliche Reaktionen, die die radioaktiven Konstrukt in Anwesenheit von endogenen unterliegen können Thiol-tragenden Moleküle (rosa). RT = Raumtemperatur. Abbildung Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Reaktion zwischen Hülsen und ein Thiol. Abbildung Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Die Struktur der Hülsen (A) sowie (B) das Reagenz berichtet von Barbas, Et Al.18,19Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Schema der vierstufigen Synthese der Hülsen. Abbildung Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Schema der Synthese von Hülsen-DOTA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Schema der Biokonjugaten von Trastuzumab mit Hülsen-DOTA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Vergleich des in-vivo Verhaltens von 89Zr-Label Radioimmunoconjugates von huA33 mit Hülsen-basierte (89Zr-DFO-PODS-huA33) und Maleimide-basierte (89Zr-DFO-Mal-huA33) Biokonjugaten Strategien erstellt. Planar (links) und maximaler Intensität Projektion (rechts) PET-Bildern von Athymic nackten Mäusen mit A33 Antigen exprimierenden SW1222 Darmkrebs Xenotransplantate (weißer Pfeil) nach der Injektion von 89Zr-DFO-PODS-huA33 und 89 ZR-DFO-Mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). Die koronalen Scheiben schneiden das Zentrum der Tumoren. Abbildung Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Vergleich des in-vivo Verhaltens von 89Zr-Label Radioimmunoconjugates von huA33 mit Hülsen-basierte (89Zr-DFO-PODS-huA33) und Maleimide-basierte (89Zr-DFO-Mal-huA33) Biokonjugaten Strategien erstellt. Bioverteilung Daten nach der Verabreichung von 89Zr-DFO-PODS-huA33 und 89Zr-DFO-Mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) Athymic nackten Mäusen A33 Antigen exprimierenden subkutane SW1222 menschlichen colorectal Krebs Xenotransplantate tragen. Die Werte für den Magen, Dünndarm und Dickdarm sind Inhalt. Abbildung Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Verbindung | 1 H-NMR Verschiebungen | 13 C-NMR Verschiebungen | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, Br s), 2,75 (3 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 166,3 163,7, 149,7, 128,5, 114,8, 113.5, 14,8 | m/Z betr. [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; gefunden: 208.0539; Δ: 0,0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9,68 (1H, s), 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,82 (1H, s), 4,99 (1H, s), 3,70 3,45 (12H, m), 3.41 (2H, Q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2H, Q, J = 6,5 Hz), 2,76 (3H, s), 2,71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1.80-1,70 (4 H, m), 1,42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171,3, 165,8, 164.6, 156,2, 141,8, 127,7, 119,6, 118,6, 79,2, 70,6, 70,5, 70.3, 70,1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29.9, 28,6, 14,8 | m/Z betr. für [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; gefunden: 632.2722; Δ:-0,470 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3.41 (2 H, Q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2 H, Q, J = 6,5 Hz), 2,71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1.80-1,70 (4H, m), 1,43 (9H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171,5, 166,5, 161,6, 156,1, 143,4, 128,7, 119,6, 116,4, 79,1, 70,5, 70,4, 70.2, 70,0, 69,4, 43,0, 38,8, 38,4, 33,2, 31,3, 29,7, 28,4 | m/z Betr. für [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; gefunden: 642.2797; Δ:-0,930 ppm | |||
| HÜLSEN | (500 MHz, D2O) 7,85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60 3,45 (15 H, m), 3,45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2.67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2,54 (2 H t, J = 6,5 Hz), 1,87 (2 H, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, D2O) 174,5, 173.2, 166,8, 161,4, 142,2, 128,6, 120,3, 116,6, 69,4, 69,4, 69,3, 69,2, 68,2, 68,2, 42,5, 37,6, 36,2, 31,9, 30,7, 28.2, 26,4 | m/z Betr. für [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; gefunden: 542.2281; Δ: 0,37 ppm | |||
| HÜLSEN-DOTA | (600 MHz, DMSO-d6) 10,46 (1 H, s), 9.74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7,99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7,44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7,1 Hz), 4.35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1,76 (2H, Q, J = 6,3 Hz), 1,61 (2H, Q, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, DMSO-d6) 171,8, 171.4, 166,1, 162,2, 158,8, 158.6, 129,8, 129.0, 127,6, 123,3, 119,5, 118.5, 116,5, 116,4, 70.2, 70,1, 70,0, 68,7, 68,5, 43,4, 41,8, 36,3, 32,2, 30.4, 29.8, 29,1 | m/z Betr. [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; gefunden: 1093.4327; Δ:-0,640 ppm | |||
Tabelle 1. Charakterisierungsdaten für den synthetischen Zwischenprodukten beschrieben sowie Hülsen und Schoten-DOTA.
| Antikörper | Typ | Konstante Region | Verhältnis von Hülsen: mAb |
| Humanplasma IgG | Menschlichen | Menschliche IgG | 2.1 ± 0,1 |
| Trastuzumab | Vermenschlicht | Menschlichen IgG1 | 2,0 ± 0,1 |
| huA33 | Vermenschlicht | Menschlichen IgG1 | 2.1 ± 0,1 |
| Cetuximab | Chimäre | Menschlichen IgG1 | 2.2 ± 0,1 |
| AR 9,6 | Murine | Murine IgG1 | 1,4 ± 0,1 |
| Maus-Plasma IgG | Murine | Murine IgG | 1,5 ± 0,1 |
Tabelle 2. Grad der Kennzeichnung von verschiedenen Antikörpern nach Konjugation mit einer Hülsen tragenden Fluorophor. Werte sind Standardabweichungen angegeben. Tabelle Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive bifunktionelle Chelatoren für die Erstellung der Website selektiv geändert Radioimmunoconjugates mit verbessert Stabilität. Bioconjugate Chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.
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Discussion
In diesem Bericht haben wir uns entschieden, keine Protokolle für enzymatische oder in vivo Experimente beinhalten. Unsere Gründe sind einfach. In Bezug auf erstere, die enzymatische ein PODS-basierte Immunoconjugate unterscheidet sich nicht überhaupt von derjenigen einer Immunoconjugate synthetisiert, mit anderen Biokonjugaten-Strategien, und diese Verfahren wurden umfassend überprüft anderswo2 . In Bezug auf Letzteres können die Besonderheiten der präklinischen in-vivo-Experimente (d. h. Mausmodelle, Dosen, etc.) im großen und ganzen die Anwendung und die Antikörper/Antigen-System variieren.
Unsere früheren Untersuchungen mit 89Zr-markierten Varianten der huA33 bieten eine überzeugende Darstellung der Vorteile des PODS-basierten Bioconjugations. HuA33 ist ein humanisierten IgG1-Antikörper, die zielt auf die A33 Antigen, ein transmembranen Glycoprotein ausgedrückt auf > 95 % der colorectal Krebse23,24. In unserem vorherigen Manuskript22berichten wir über die Synthese von 89Zr-DFO-huA33 Radioimmunoconjugate mit beiden Hülsen - und Maleimide-basierte Biokonjugaten Strategien. Die beiden radioaktiv Antikörper – 89Zr-DFO-PODS-huA33 und 89Zr-DFO-Mal-huA33 — in nahezu identische Ertrag, Reinheit, Spezifität Aktivität und Immunoreactivity produziert wurden. Kritisch, aber die zwei Radioimmunoconjugates ausgestellt drastisch unterschiedliche Stabilitäten in humanem Serum: nach der Inkubation für sieben Tage bei 37 ° C 89Zr-DFO-PODS-huA33 86 ± 1 % intakt geblieben, während seiner Maleimide-basierte Cousin nur 61 ± 5 war % intakt. In-vivo PET-Bildgebung und Bioverteilung Experimente in den Athymic nackten Mäusen A33 Antigen exprimierenden SW1222 menschlichen colorectal Krebs Xenotransplantate offenbarten krasse Unterschiede in der in-vivo Verhalten von zwei Radioimmunoconjugates (Abb. 8 und Abbildung 9). 89Zr-DFO-PODS-huA33 und 89Zr-DFO-Mal-huA33 produzieren hohe Aktivitätskonzentrationen im Tumorgewebe: 56,4 ± 6.9%ID/g und 49,6 ± 9.3%ID/g bzw. 48 h nach Verabreichung. Maleimide-basierte Radioimmunoconjugate produziert jedoch deutlich höhere Aktivitätskonzentrationen in gesundes Gewebe als der Hülsen-basierte Agent. Zum Beispiel 89Zr-DFO-Mal-huA33 produziert Aktivitätskonzentrationen von 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 und 12,2 ± 0,4 % ID/g in den Nieren, Leber und Knochen, bzw. bei 120 h nach der Injektion, Werte, die die Aktivitätskonzentrationen dramatisch überschreiten produziert von 89Zr-DFO-PODS-huA33 in den gleichen Geweben (1,4 ± 0,1, 1,2 ± 0,3 und 4.3 ± 0,6 % ID/g). In der Tat produziert 89Zr-DFO-PODS-huA33 unteren Aktivitätskonzentrationen in allen nicht-Zielorganismen Geweben (außer den Dickdarm) an 120 h nach der Injektion im Vergleich zu 89Zr-DFO-Mal-huA33. Infolgedessen sind die Tumor-Organtätigkeit Konzentrationsverhältnis für 89Zr-DFO-PODS-huA33 in der Regel besser als die von 89Zr-DFO-Mal-huA33; insbesondere die Tumor-Leber, Tumor-Milz, Tumor auf Niere und Tumor-zu-Knochen Aktivitätskonzentration sind fast das doppelte für die PODS-basierte Immunoconjugate im Vergleich zu seinem Vetter Maleimide abgeleitet. Wenn man bedenkt, dass der Hauptunterschied zwischen den zwei Radioimmunoconjugates der Biokonjugaten Griff von der Chelator war, ist die höhere Stabilität des PODS-Thiol-Verknüpfung für diese Leistungssteigerung in-vivo grenzender verantwortlich.
Eine breitere Sicht ist, die Website-nichtselektive Biokonjugaten Sonden, Lysines innerhalb Antikörper zugegeben eine unkomplizierte und einfache Ansatz zur Änderung der Antikörper. Das Vorhandensein von mehreren Lysines verteilt die Struktur von Immunglobulinen bedeutet jedoch, dass es unmöglich ist, die Kontrolle über den genauen Standort oder Grad Biokonjugaten2auszuüben. Infolgedessen diese Zufallsstrategie erzeugt häufig schlecht definiert und sehr heterogenen Immunokonjugate, die ausstellen können verringerte Immunoreactivity treten grundsätzlich innerhalb der Antigen-bindende Domänen3. Die Vorteile von Website-selektive Ansätze zur Biokonjugaten für beide Radioimmunoconjugates wiederholt dargestellt und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate8,14,25,26, 27,28,29,30. Kurz gesagt, nicht nur Website-selektive Biokonjugaten Strategien produzieren mehr klar definierte und homogene Immunokonjugate als traditionelle Methoden, sie auch imaging Agents, Radioimmunotherapeutics und ADCs mit in-vivo Leistungssteigerung. Doch wo stehen PODS-basierte grundsätzlich im Vergleich zu anderen Website-gezielte Modifizierung Strategien? Im Allgemeinen können die Ansätze für die Website-gezielte Modifizierung von Antikörpern in vier Kategorien eingeteilt werden: (1) grundsätzlich zu Cystein Rückstände, (2) die Manipulation der schweren Kette Glykane, Transformationen (3) Chemoenzymatic und (4) die Verwendung Gentechnik-4,5. Natürlich, dieses Klassifizierungssystem ist nicht perfekt, und einige Ansätze (z. B. die Änderung der schweren Kette Glykane mit Enzymen) zwangsläufig für zwei Kategorien qualifizieren. Jede Strategie hat ihre eigenen vor- und Nachteile. Gentechnik-basierte Ansätze bieten exquisite Kontrolle über die Website der Konjugation, doch sind sie komplexe und teure31,32,33. Oxidative Kupplungen, die schwere Kette Glykane sind preiswert und einfach, aber sie riskieren oxidativen Schäden an die strukturelle Integrität der Immunglobulin34,35,36,37 ,38.
Der Hauptvorteil der Thiol-basierte Bioconjugations — Hülsen enthalten – ist ihre Einfachheit und Modularität. Auf der anderen Seite entstammt der begrenzende Faktor, das Vorhandensein von mehreren Thiole innerhalb eines Antikörpers, eine Eigenschaft, die den Grad der Kontrolle über sowohl die Seite der Konjugation und die Anzahl der Änderungen pro Antikörper reduziert. In diesem Sinne ist die Kombination der Thiol-basierten Verbindlichkeiten und Antikörper, die gentechnisch verändert wurden, um kostenlose Cystein Rückstände zu besitzen ein besonders attraktives Konzept. Wie wir festgestellt haben, ist eine weitere Einschränkung der Maleimide-basierte Thiol grundsätzlich die Anfälligkeit der Succinimidyl Thioether Anleihe für Retro-Michael Ergänzungen in-vivo. Noch kritisch, hebt die Verwendung von Hülsen dieses Problem.
Bevor wir zum Schluß komme, ist es wichtig zu beachten, dass die emergente Art der Schoten Technologie einen eigenen Satz von Hindernissen erstellen kann. Z. B. keine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelatoren sind (derzeit) im Handel erhältlich, und es gibt keine Daten Adressierung der klinischen Pharmakologie, Toxikologie oder Immunogenität der Hülsen-basierten Immunokonjugate. Wir glauben jedoch, dass PODS-basierte Bioconjugations haben das Potenzial, das Verfahren grundlegend zu ändern, die Immunokonjugate im Labor und Klinik synthetisiert werden. Im Moment, wir haben nur angewandt diese chemische Technologie zur Entwicklung von Radioimmunoconjugates für nukleare Bildgebung und Radioimmuntherapie, obwohl Untersuchungen über das Dienstprogramm von diesem Ansatz für den Bau von Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und anderen biomolekularen Arzneimitteln sind derzeit im Gange. Am Ende hoffen wir inständig, dass dieses Protokoll – und vor allem die unkomplizierte und einfache Chemie, die wir entwickelt haben – hilft fördern den Einsatz von Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfonen für Sulfhydryl-basierte Konjugationen und Sporn eine Verschiebung im Bereich von Maleimides, stabiler und zuverlässiger Alternativen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Sai Kiran Sharma für hilfreiche Gespräche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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