Neste protocolo, descreveremos a síntese de vagens, phenyoxadiazolyl metil sulfona-baseado reagente para a ligação local-seletivo de cargas para os tióis de biomoléculas, especialmente de anticorpos. Além disso, descreveremos a síntese e caracterização de um quelante bifuncional PODS-rolamento e sua conjugação com um anticorpo de modelo.
Maleimide-rolamento bifuncionais sondas têm sido empregadas há décadas para a modificação de local-seletiva de tióis em biomoléculas, especialmente de anticorpos. Ainda conjugados com base em maleimide exibem limitada estabilidade in vivo, porque a ligação Tioéter de grufo pode sofrer uma reação retrô-Michael. Isso, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação. Ambos estes processos podem produzir concentrações elevadas de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuíram a concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Em 2018, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de ‘PODS’ — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado. Temos claramente demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição muito superior desempenho in vivo em comparação com radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseada em maleimide conjugações. Neste protocolo, descreveremos a síntese de quatro etapas de vagens, a criação de uma variante de vagens-rolamento bifuncional do quelante onipresente DOTA (PODS-DOTA) e a conjugação de vagens-DOTA para o direcionamento de HER2-anticorpo Trastuzumabe.
Radiofarmacêuticos químicos têm explorado a seletividade e especificidade dos anticorpos para biomarcadores da doença para ambos imagem nuclear e direcionados a radioterapia1. Abordagem de longe o mais comum para o radioativos de anticorpos baseia-se a penhora indiscriminada de radiolabeled grupos prostético ou radiometal quelantes de aminoácidos — mais frequentemente lisinas — dentro da estrutura da imunoglobulina ( Figura 1A)2. Enquanto esta estratégia é certamente eficaz, sua natureza aleatória, não-local-específica pode criar problemas. Especificamente, bioconjugation tradicionais abordagens produzem mal definidos e immunoconjugates heterogêneo composto por misturas de milhares de regioisomers diferentes, cada um com seu próprio conjunto de propriedades biológicas e farmacológicas3. Além disso, bioconjugation aleatório pode impedir a imunorreatividade dos anticorpos se a carga é acrescentada aos domínios de antígeno-ligando a imunoglobulina.
Ao longo dos anos, uma variedade de estratégias de bioconjugation site-specific e local-seletiva foram desenvolvidos a fim de abordar estes problemas4,5. A mais comum dessas abordagens depende a ligadura de sondas de maleimide-rolamento aos grupos sulfidrila das cisteínas (figura 1B). Anticorpos IgG1 contêm naturalmente 4 pontes de dissulfeto inter cadeia, vínculos que podem ser seletivamente reduzidos para render capaz de sofrer reações de adição de Michael com maleimides para formar grufo Tioéter ligações grátis tióis. O uso de tióis e maleimides é, certamente, uma melhoria em relação a métodos tradicionais e uma grande variedade de synthons de maleimide-rolamento e quelantes bifuncionais estão atualmente disponíveis. No entanto, é importante notar que esta metodologia tem sérias limitações também. Immunoconjugates baseada em maleimide apresentam estabilidade limitada em vivo, pois a ligação Tioéter pode sofrer uma reação retrô-Michael (Figura 2),6,7,8,9, 10. isto, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação (por exemplo, glutationa ou albumina). Ambos estes processos podem aumentar as concentrações de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuir as concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Vários reagentes thiol-reactivos alternativos foram desenvolvidos na tentativa de contornar esses problemas, incluindo tosylates, bromo e iodo-acetyls e vinil sulfonas11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. no entanto, todas essas abordagens têm limitações que têm dificultado a sua aplicação generalizada.
Há cinco anos, o laboratório do falecido Carlos Barbas III no Scripps Research Institute foi pioneira no uso de sulfonas de metil phenyloxadiazolyl como reagentes para a formação seletiva de ligações altamente estáveis com tióis (Figura 1 e Figura 3) 18 , 19. os autores empregou uma variante de sulfona-rolamento de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína para modificar diversos anticorpos projetados para conter resíduos de cisteína livre, em última análise, produzindo immunoconjugates com maior estabilidade do que o análogo construções criadas usando sondas baseadas em maleimide. Ao ver este trabalho promissor, ficamos um pouco surpresos que esta tecnologia só tinha sido usada raramente em radioquímica e não tinha ainda sido usada em tudo na síntese de quelantes bifuncionais ou radioimmunoconjugates20,21 . Esta escassez de aplicativos, no entanto, logo começou a fazer mais sentido: várias tentativas de adquirir o reagente da Sigma-Aldrich resultaram no recebimento de misturas complexas de produtos de degradação com < 15% do composto desejado. Além disso, sintetizar o reagente relatado nos não era uma opção realista também, como a rota sintética publicada é um pouco complicada e requer equipamento sofisticado de química orgânica que mais radioquímica e imagem molecular laboratórios — incluindo a nossa — simplesmente não possuem.
Em resposta a esses obstáculos, nos propusemos a criar uma facilmente acessível e altamente estável phenyloxadiazolyl reagente de sulfona de metila que pode ser obtido através de uma rota sintética robusta e razoavelmente fáceis. No início deste ano, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de ‘PODS’ — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado (Figura 1 e Figura 3)22. A principal diferença entre cápsulas e o reagente relatado por Barbas, et al é que o antigo emprega um anel da anilina anexado para o agrupamento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl, enquanto este último dispõe de um fenol na mesma posição (Figura 4). Essa mudança facilita uma rota sintética mais simples e acessível, bem como — se nossa experiência com o composto comercialmente disponível é emblemática — um reagente final mais estável. Neste trabalho, nós também sintetizado um par de vagens-rolamento bifuncionais quelantes — PODS-DFO e vagens-CHX-A ‘-DTPA — para facilitar a criação de 89Zr – e 177Lu-rotulados radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos discutir, temos demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição superior desempenho in vivo comparado ao radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseado em maleimide conjugações.
O over-arching objetivo deste trabalho é facilitar a criação de immunoconjugates bem definidas, homogêneas, altamente estável e altamente immunoreactive para aplicações in vitro e in vivo. A abordagem sintética é bastante simples de ser realizada em quase qualquer laboratório, e o reagente de vagens do pai pode ser modificado com uma infinidade de diferentes quelantes, fluorophores ou cargas. No presente protocolo e o vídeo que acompanha, descreveremos a síntese simples, quatro etapas de vagens (Figura 5); a criação de uma variante de vagens-rolamento do DOTA, um quelante amplamente utilizado para a coordenação de 64Cu, 68Ga, 111, em 177Lu e 225Ac (Figura 6); e o bioconjugation de vagens-DOTA de um anticorpo de modelo, o Trastuzumabe HER2-direcionamento IgG1 (Figura 7).
Neste relatório, decidimos não incluir quaisquer protocolos para experimentação radioativos ou in vivo. Nossos motivos são simples. No que diz respeito ao primeiro, o radioativos de uma immunoconjugate baseada em vagens não difere em tudo isso de um immunoconjugate sintetizado usando outras estratégias bioconjugation, e esses procedimentos têm sido exaustivamente analisado em outro lugar2 . No que diz respeito a último, as especificidades de pré-clínicos experimentos in vivo (i.e., mode…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecer Dr. Sai Kiran Sharma conversas úteis.
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |