Syntes och Bioconjugation av Thiol-reaktiva reagenser för skapandet av webbplatsen-selektivt modifierade Immunoconjugates

Summary

I detta protokoll, kommer vi att beskriva syntesen av BALJOR, phenyoxadiazolyl metyl sulfon-baserade reagens för webbplats-selektiv fastsättning av laster till Tioler av biomolekyler, särskilt antikroppar. Dessutom kommer vi att beskriva syntes och karakterisering av en SKIDA räntebärande bifunktionell kelator och dess konjugering till en modell antikropp.

Abstract

Maleimide-bärande bifunktionell sonder har använts i decennier för webbplats-selektiv modifiering av Tioler i biomolekyler, särskilt antikroppar. Maleimide-baserade konjugat visas ännu begränsad stabilitet i vivo eftersom succinimidyl thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion. Detta kan naturligtvis leda till utgivningen av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp. Båda dessa processer kan producera förhöjda aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minskad aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. 2018, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade ‘SKIDA’ — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations. Vi har tydligt visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates utställning vida överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer. I detta protokoll, kommer vi att beskriva fyra steg syntesen av BALJOR, skapandet av en bifunktionell PODS-bärande variant av den allestädes närvarande kelator DOTA (PODS-DOTA) och konjugationen av SKIDA-DOTA till den HER2-targeting antikropp trastuzumab.

Introduction

Radiofarmaceutisk kemister har länge utnyttjas den selektivitet och specificitet av antikroppar för biomarkörer för sjukdom för både kärn avbildning och riktad strålbehandling¹. Särklass vanligaste förhållningssätt till den radiolabeling av antikroppar bygger på urskillningslösa tillbehöret av radiomärkt prosthetic grupper eller radiometal kelater till aminosyror — oftast lysines — inom strukturen för immunglobulin ( Figur 1A)². Denna strategi är säkert effektiv, kan dess slumpmässigt, icke-plats-specifika natur skapa problem. Specifikt, traditionella bioconjugation metoder producera dåligt definierat och heterogena immunoconjugates består av blandningar av tusentals olika lägesisomererna, alla med sin egen uppsättning biologiska och farmakologiska egenskaper³. Slumpmässiga bioconjugation kan dessutom hindra immunoreaktivitet antikroppar om lasten läggs till den immunglobulin antigen-bindande domäner.

Genom åren har en mängd platsspecifika och webbplats-selektiv bioconjugation strategier utvecklats för att hantera dessa problem^4,5. Den vanligaste av dessa metoder bygger på ligering av maleimide-bärande sonder till sulfhydryl grupper av cysteines (figur 1B). IgG1 antikroppar innehåller naturligt 4 mellan kedjan disulfidbryggor, kopplingar som selektivt kan reduceras för att ge gratis Tioler kan genomgå Michael tillägg reaktioner med maleimides att bilda succinimidyl thioether obligationer. Tioler och maleimides är verkligen en förbättring jämfört med traditionella metoder, och ett brett utbud av maleimide-bärande synthons och bifunktionell kelater är tillgängliga. Det är dock viktigt att notera att denna metod har allvarliga begränsningar samt. Maleimide-baserade immunoconjugates uppvisar begränsad stabilitet i vivo eftersom thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion (figur 2)^{6,7,8,9, 10}. detta, naturligtvis, kan leda till utsläpp av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp (glutation eller serum albumin). Båda dessa processer kan öka aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minska aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. Flera alternativa thiol-reaktiva reagenser har utvecklats i ett försök att kringgå dessa frågor, inklusive tosylates, bromo – och Jodo-Acetexs, och vinyl sulfoner^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. alla dessa metoder har dock begränsningar som har hindrat deras utbredd tillämpning.

Ungefär fem år sedan, börjat laboratoriet för den sena Carlos Barbas III vid Scripps Research Institute använda sig av phenyloxadiazolyl metyl sulfoner som reagens för selektiv bildandet av mycket stabila kopplingar med Tioler (figur 1 c och figur 3) ^{18 , 19}. författarna sysselsatt en phenyloxadiazolyl metyl sulfon-bärande variant av fluorescein att ändra flera antikroppar konstruerade för att innehålla rester av gratis Cystein, i slutändan producerar immunoconjugates med högre stabilitet än motsvarande konstruktioner som skapats med maleimide-baserade sonder. När han ser denna lovande arbete, var vi lite förvånad över att denna teknik hade endast använts knappt i radiokemi och hade ännu inte använts alls i syntesen av bifunktionell kelater eller radioimmunoconjugates^20,21 . Denna brist på tillämpningar, men snart började mer meningsfullt: flera försök till koppleri reagensen från Sigma-Aldrich resulterade i mottagandet av komplexa blandningar av nedbrytningsprodukter med < 15% av den önskvärda föreningen. Dessutom syntetisera rapporterade reagensen oss var inte ett realistiskt alternativ heller, som den publicerade syntesväg är ganska ohanterlig och kräver avancerad organisk kemi utrustning som de flesta radiokemi och molekylär avbildning laboratorier — inklusive vår — helt enkelt inte besitter.

Svar på dessa hinder anges vi att skapa en lättillgänglig och mycket stabil phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens som kan erhållas via en robust och rimligen lättköpt syntesväg. Tidigare i år, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade ‘SKIDA’ — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations (figur 1 c och figur 3)²². Den viktigaste skillnaden mellan SKIDA och reagens rapporteras av Barbas, et al. är att den förstnämnda sysselsätter en anilin ring bifogas den phenyloxadiazolyl metyl sulfon biexponentiellt, medan det sistnämnda erbjuder en fenol i samma position (figur 4). Ändringen underlättar en mer enkel och lättåtkomlig syntesväg som — om vår erfarenhet med kommersiellt tillgängliga föreningen är symboliska — en stabilare slutliga reagens. I detta arbete, vi också syntetiseras ett par BALJOR räntebärande bifunktionell kelater — PODS-DFO och PODS-CHX-A”-DTPA — att underlätta skapandet av ⁸⁹Zr- och ¹⁷⁷Lu-märkt radioimmunoconjugates, respektive. Som vi kommer att diskutera, har vi visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates uppvisar överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer.

Övergripande målet med detta arbete är att underlätta skapandet av väldefinierade, homogent, mycket stabil och mycket immunreaktiva immunoconjugates för in vitro- och in vivo-program. Den syntetiska metoden är enkel nog att utföras i nästan alla laboratorium och överordnade PODS reagens kan ändras med en uppsjö av olika kelatorer, fluorophores eller laster. I detta protokoll och medföljande videon, kommer vi att beskriva enkla, fyra steg syntesen av SKIDA (figur 5). skapandet av en SKIDA räntebärande variant av DOTA, en allmänt använd kelator för samordning av ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹år, ¹⁷⁷Lu och ²²⁵Ac (figur 6). och bioconjugation av SKIDA-DOTA till en modell antikropp, den HER2-targeting IgG1 trastuzumab (figur 7).

Protocol

1. syntes av 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) Obs: På grund av ljuskänslighet av föreningen, hålla alla reaktioner i folie-täckt fartyg. I en 10 mL runda botten mätkolv, Lös 100 mg (0.517 mmol, 1 motsvarande) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL metanol. Till denna lösning, tillsätt 360 μL av diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 motsvarigheter; vattenfri) och små magnetiska rör bar. Täcka kolven med en gummipropp och rör n…

Representative Results

De fyra första stegen i detta protokoll — syntesen av SKIDA — har utformats för att vara robust och tillförlitlig. Den deprotonation och substitution av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol att bilda den önska thioether-produkten ger thioether i > 99% avkastning efter bara 45 minuter. Nästa, uppnåddes ligering mellan 1 och N-Boc-N’-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine via en standard peptid koppling förfarande, vilket resulterar i samlingen av pro…

Discussion

I denna rapport har vi valt att inte inkludera några protokoll för radiolabeling eller in vivo-experiment. Våra skäl är enkelt. Med avseende på förra, den radiolabeling av en SKIDA-baserade immunoconjugate skiljer sig inte alls från det av en immunoconjugate som syntetiseras med andra bioconjugation strategier, och dessa förfaranden har varit utförligt recenserade någon annanstans² . Beträffande den senare kan detaljerna i prekliniska in vivo experiment (dvs musmodeller, doser, etc.) v…

Materials

5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50