Summary
在这里,我们提出了一个协议,用高度灵敏的非放射性示踪剂测试小鼠的球状渗透性。此方法允许重复尿分析与小尿量。
Abstract
尿液中白蛋白的流失(白蛋白尿)预测心血管结果。在生理条件下,少量的白蛋白被球蛋白过滤,并在管状系统中重新吸收,直到达到吸收极限。病理白蛋白过滤的早期增加可能错过通过分析白蛋白尿。因此,使用示踪剂来测试球状的渗透率似乎具有优势。荧光标记示踪剂氟辛等子素(FITC)-多糖(即FITC-纤维素),可用于研究球状渗透率。FITC-多糖分子被球蛋白自由过滤,但不在管状系统中重新吸收。在小鼠和大鼠中,使用技术复杂的程序(即放射性测量、高性能液相色谱[HPLC]、凝胶过滤)在球状渗透性模型中对FITC-Polyucrose进行了研究。我们修改并促进了基于FITC-多糖示踪剂的协议,以测试小鼠中FITC-Polyucrose 70(白蛋白大小)的球状渗透性的早期和微小增加。此方法允许重复尿分析与小尿体积 (5 μL)。该协议包含有关追踪器 FITC-Polyucrose 70 如何静脉注射和通过简单的尿导管收集尿液的信息。尿通过荧光板读取器进行分析,并归化为尿浓度标记(肌氨酸),从而避免技术上复杂的程序。
Introduction
球状过滤屏障内的功能或结构缺陷增加了白蛋白的球状渗透性,导致尿中白蛋白的检测(白蛋白)。白蛋白尿病预测心血管结果,是肾小球损伤的重要标志1。即使白蛋白尿水平较低,处于正常范围内,也与心血管风险增加1相关。
在生理条件下,白蛋白通过球蛋白过滤,在管状系统2,3中几乎完全重新吸收。在小鼠中,尿液中白蛋白的检测通常通过从24小时尿液收集中与白蛋白酶相关的免疫吸附剂测定(ELISA)进行。如果使用 24 小时尿收集或点尿的尿液,则由于测定敏感性问题,白蛋白浓度的微小差异可能会丢失。因此,大多数研究人员使用动物模型,其中白蛋白尿是由毒素、药物和肾脏手术引起的强健的肾损伤引起的。
因此,发现一种灵敏的方法来检测球状渗透性的微小和瞬态变化,对该领域非常重要。Rippe等人提出了一个大鼠模型,通过应用荧光标记的示踪剂,即FITC-聚糖70(即FITC-Ficoll 70),在白蛋白4的大小测试球状渗透性。示踪剂应用允许测试球状渗透性的短期变化(在几分钟内),并且非常敏感4。两项研究在小鼠5,6中使用了示踪法。尽管这种方法有其优点,但不幸的是,它的缺点:它在技术上非常复杂,放射性和侵入性。尿的进一步分析只能通过使用凝胶过滤或大小排除HPLC5,6完成。
在本文中,我们提出了一种替代的、灵敏的、非放射性的、快速的方法,用荧光标记的FITC-Polyucrose 70测量小鼠的球状渗透性。通过引入输尿管导管,尿液收集比膀胱穿刺、尿道和超尿管应用的侵入性小,并且允许至少每30分钟收集一次尿液。荧光板读取器。使用酶肌氨酸测定法,将尿液中的示踪剂浓度归化为尿液中的肌氨酸浓度。
因此,这种新方法为研究早期肾小球损伤和增加球状渗透性提供了一个敏感的工具。
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Protocol
调查是根据《实验室动物护理和使用指南》(美国国家卫生研究院出版物,1996年修订)中概述的准则进行的。所有动物实验均按照相关机构批准进行(州政府兰德萨姆特·法尔·纳图尔,乌姆韦尔特·德·维尔布劳赫舒茨[LANUV] 参考号84-02.04.2012.A397)。
1. 仪器、解决方案和设备的准备
- 用0.9%无菌氯化钠(NaCl)将FITC-聚糖70重组为10mg/mL的最终浓度(即100毫克的纳L)。
- Dialyze FITC-聚糖70溶液在4°C(分子量切断[MWCO]为10,000时过夜,去除自由FITC分子)。在不断搅拌下,每 10 mL 的 FITC-聚蔗糖 70 使用 1 L 的 0.9% 无菌 NaCl。防止光线照射。将硅化FITC-聚糖70与一起储存在-20°C。
- 对于 FITC-聚糖 70 博鲁,将 4 μL 的 10 mg/mL FITC-聚糖 70 溶液加入 996 μL 的 0.9% NaCl(FITC-聚蔗糖 70 的最终浓度:40 μg/mL)。
- 对于平衡输液溶液,将20μL的10mg/mL FITC-Polyucs70溶液加入9.98 mL的0.9%无菌NaCl,最终浓度为20微克/mL。
- 对于实验溶液,向输注溶液中添加药物或物质(例如,对于血管紧张剂 II [Ang II] [100 纳克/kg/min],对于 25 g 小鼠,添加 3 μL 的 Ang II 的 1 mM 溶液)。
- 对于手术,准备一把棉被,两个手术夹子,一把手术剪刀,两把钳子,两把细钳子,一把细剪刀和一把棉签。准备两条 10 厘米丝线(4-0 至 6-0),用于结扎程序。
- 对于中央静脉导管的放置,用 21 G 针头准备一个 10 mL 注射器。将针头插入 30 厘米长的导管(内径 [ID] 为 0.58 mm)。将 0.58 mm 导管连接到 10 厘米导管(ID 为 0.28 mm)。切割较小的导管斜尖,以创建一个尖锐的尖端,引入到静脉。
- 准备麻醉(即腹内麻醉氯胺酮,100毫克/千克的体重,和木兰辛,5毫克/千克的体重)。
- 通过丢弃针头,将导管从尖端1厘米标记,准备22G血管导管。将加热垫预热至 37°C。
- 准备血压装置,必要时更换血压测量膜。
2. 准备阶段
- 尿导管
注:第2.1节遵循Reis等人第7条所述的协议。图1和补充图1显示了导尿管在雌性小鼠中的位置。- 用氯胺酮/西拉津麻醉小鼠(参见步骤1.8)。使用脚趾捏测试确认正确的麻醉。为了保持麻醉,在60分钟后重复麻醉(例如,用一半的剂量)。 如果脚趾捏测试没有导致反射性退缩,则确认适当的麻醉。
注: 此协议使用雌性 FVB 小鼠。 - 将鼠标置于 37 °C 加热垫上的背回回电中。拧紧下腹部,找到尿道骨(例如,在显微镜下)。
- 使用 22 G 血管导管的塑料部分,用木黄凝胶润滑。小心地将其引入尿道,同时平行于远端尿道轴(图1A)。
- 将尖头保持在尿道内并保持尿道的轴,从而转动血管的顶端 180°(图 1B)。
- 将导管再引入小鼠 7 mm,使其放置在膀胱内(图 1C)。请勿将导管强制超出阻力范围。如果感觉到阻力,请从一开始就纠正导管的位置。请注意,如果导尿管的位置正确,尿液可能已经出现在导管内。
- 将一根 1.5 mL 的棕色管子放在血管顶部以收集尿液。下皮应用1mL 0.9%NaCl,以提高尿液产量。
- 用氯胺酮/西拉津麻醉小鼠(参见步骤1.8)。使用脚趾捏测试确认正确的麻醉。为了保持麻醉,在60分钟后重复麻醉(例如,用一半的剂量)。 如果脚趾捏测试没有导致反射性退缩,则确认适当的麻醉。
- 中央静脉导管
- 把老鼠的脖子勒断,用头朝外科医生放上正位。用胶带过度伸展鼠标头。
- 用70%异丙醇对颈部进行消毒。使用钳子和一把剪刀在下颌线下方进行一个小的皮肤切口(5 毫米)。切皮肤约1厘米的胸骨的方向,直到达到胸骨的中间。
- 用剪刀仔细解剖颈部右侧的皮肤。将皮肤的矩形切口到鼠标的右侧,露出颈部的软组织。用一把剪刀和一把钳子。用两个夹子固定皮瓣。
注: 颈静脉沿甲状腺左侧运行,或被甲状腺的右叶轻微覆盖。在此步骤之后,使用显微镜进行手术。 - 用细钳尖用钝化制剂仔细暴露壶静脉。避免静脉分支受伤。
注:可能需要用细剪刀去除组织。使用剪刀去除组织时要小心,因为它会增加出血的风险。 - 用丝线(4-0 至 6-0)在可见壶脉的远端放置并合上连字(朝向鼠标头)。用胶带固定丝线,确保颈静脉有轻微的张力,从而在结扎上加紧。准备围绕血管近端的连字。
- 用平衡输液填充导管(参见步骤 1.4),用胶带固定导管,使导管与管状静脉对齐。控制气泡以避免空气栓塞。
- 在插入部位用细钳子提起颈静脉(插入部位是连字的1⁄2毫米)。将管平行于静脉。刺穿壶脉,瞄准流明,插入约2⁄4毫米,平行于颈静脉的轴。避免任何轻快的动作。
- 关闭连字以固定导管。通过显微镜仔细观察,控制结扎的紧度。在手术现场放一个湿拭子。
- 血压测量
- 将尾部袖口放在鼠标尾部底部,而鼠标则处于背功能。开始测量,并重复每个时间点 10 倍。从测量值生成平均值。
- 如果血压测量似乎不正确并生成错误数据,则调整尾袖的位置。
3. 平衡阶段
- 在平衡阶段开始之前,更换尿收集管并将其放在冰上。
- 引入一个装有FITC平衡相溶液的10 mL注射器(参见步骤1.4),用21G针头和较大的导管(ID为0.58 mm),并将其放入注射器泵中。
- 折叠拭子,并将其放在小血管导管周围(ID为 0.28 mm),该导管被引入血管静脉。将导管放在拭子内。在拭子上放置一个夹子,以消除逆行血流或空气栓塞。将 27 G 针头与装有 FITC bolus 的 1 mL 注射器连接到小血管导管的末端。
- 打开夹具并应用 FITC bolus (100 μL)。再次关闭卡箍,并将较大的导管与较小的导管连接。以 0.008 mL/min (0.480 mL/h) 启动注射器泵。继续输注60分钟。
4. 实验阶段
注:在此阶段,可以研究药物对肾小球渗透率的影响。
- 将尿管(时间点 0 分钟)更改为另一个 1.5 mL 棕色管。在小容器导管周围放置拭子,并合上步骤 3.3 所示的夹子。
- 断开大导管与小血管导管的连接。将注射器更改为实验阶段溶液(参见步骤 1.5)。让输液泵运行,使大导管充满平衡溶液。
- 重新连接导管,同时避免空气栓塞并重新打开夹子。以 0.008 mL/min 的速度启动注射器泵。
- 继续运行注射器泵 60 分钟,然后收集尿管内的尿液(尿 60 分钟)。将尿管放在冰上。
- 在麻醉过程中因宫颈错位而牺牲小鼠。在处置之前,观察鼠标5分钟,以确保其死亡。
5. 尿分析
-
荧光测量
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)解冻尿池,将其稀释1:10。
注:尿池是一个尿液池,从健康小鼠在代谢笼中收集12-24小时尿液中收集。 - 为荧光测量准备标准。取10棕色1.5 mL管,并将其标记为空白(1:10稀释尿池)和以下FITC-聚糖70浓度(0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80和160微克/mL)。
- 将稀释后的尿池的246 μL移入1.5 mL棕色管中,加入4μL的FITC-Polyucs70库存浓度(见步骤1.1),以获得160微克/mL FITC-聚蔗糖70的最终浓度。将稀释的尿池的移液100 μL移入所有其他管中。
- 将 160 μg/mL FITC-聚糖 70 管的 100 μg/mucs7 管移至 80 μg/mL 管中稀释 1:2,然后继续其他浓度。确保稀释浓度的适当混合物(例如,在继续前涡旋管)。
- 用稀释的尿池稀释小鼠尿样(0分钟,60分钟)1:10。
- 每个标准 FITC-Polyucrose 70 浓度和小鼠尿液样本的移液器 5 μL,在黑色 384 孔板中作为三联体。将板在 1,000 x g下离心 15 s,以避免气泡。
- 在板式读取器中分析 384 孔板。在 496 nm 处执行激励,并在 525 nm 处测量荧光。
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)解冻尿池,将其稀释1:10。
-
肌氨酸测量
- 按照制造商的说明进行操作。简而言之,通过稀释100 mM肌氨酸标准溶液的10 μL,使用990 μL肌氨酸测定缓冲液制备肌氨酸标准,以制备1 mM标准溶液。
- 将 1 mM 肌氨酸标准溶液的 0、2、4、6、8 和 10 μL 添加到 96 孔板中,分别生成 0、2、4、6、8 和 10 nmol/孔标准。在每个井中加入肌氨酸测定缓冲液,使体积增加到50μL。
- 通过加入42~44μL肌氨酸测定缓冲液、2μL肌酸酶、2μL肌氨酸酶酶、2μL肌氨酸酶混合物和2μL肌氨酸探针制备反应混合物。对于空白,使用44μL的肌氨酸测定缓冲液,2μL的肌酸酶,2μL的肌氨酸酶混合,和1⁄2μL的肌氨酸探针。
- 在96孔板中为每个孔中加入50μL的适当反应混合物,并在37°C的水平摇床上孵育60分钟。在孵育过程中保护板免受光线照射。测量板读取器上 570 nm 处的吸光度。
- 通过从所有读数中减去空白值来计算肌氨酸浓度。结果将具有单位纳米摩尔/微升。将肌氨酸的浓度乘以肌氨酸的分子量(113.12纳克/nmol),以接收单位纳米克/微升。
6. 数据分析
- 从标准曲线计算 FITC-聚糖 70 尿浓度。
- 参考在代表性尿样中,将FITC-Polyucrose70尿浓度与肌氨酸浓度为12.
- 将尿液60分钟样本参考尿0分钟对照样本和治疗小鼠。
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Representative Results
如图2所示,测试小鼠球状渗透性的方法分三个阶段建立。第一阶段称为准备阶段,其中放置尿导管和中央静脉导管。第二阶段称为平衡阶段,从静脉注射FITC-Polyucrose 70开始,然后持续输注FITC-Polyucrose 7060分钟。最后一个阶段称为实验阶段。在此阶段,继续注入FITC-多糖70,并可以测试药物或其他物质影响球状渗透性。尿在每个阶段结束时收集。
为了研究此示踪模型中的球状渗透性,必须正确放置导管,同时不伤害粘膜。图1显示了将导尿管放入雌性小鼠膀胱。导管被放置在3毫米的尿道中,与颅尿道轴平行(图1A)。导管朝小鼠尾部转动180°(图1B),并进一步引入7毫米,与鼠脊平行(图1C,D)。
如上所述,以前测试小鼠球状渗透性的方法使用HPLC来纯化来自尿样5、6的FITC-Polyucrose70信号。由于该方法使用荧光测量,无需事先纯化示踪剂,因此对小鼠尿液中的PBS、小鼠尿液和FITC-Polyucrose 70进行了分析。图3A显示了在325nm处荧光峰值的PBS荧光扫描,这似乎是290nm时激发闪光的影响。原生小鼠尿液的荧光扫描显示荧光最大为 395 nm(图 3B)。FITC-聚糖70溶解在小鼠尿液中,在525nm时显示荧光最大值(图3C,D)。图3C显示,小鼠尿液不会干扰小鼠尿液中FITC-Polyucs70的荧光测量。FITC-Polyucrose 70 浓度的增加表明荧光强度增加(图 3E)。
为了证明该方法能够检测球状渗透性的差异,在模型的实验阶段应用了Ang II。在持续服用非血压相关剂量后,Ang II 在小鼠体内的球状渗透性提高了60分钟(图4A,B)。由于昂II引起的肾球渗透性增加,可以通过安II受体阻滞剂(ARB)来阻断,即甘蔗素(图4A)。昂 II 冲洗降低球状渗透性 (图 4A)。血压通过尾袖法测量,没有显示各组之间的显著差异(图4B)。聚糖70-和FITC-聚糖70注入动物作为控制FITC-聚糖70和安II处理的动物(图4C)。
图1:雌性小鼠泌尿管的放置。鼠标腹部的横向视图。(A) 标记和润滑的导管被引入3毫米的雌性小鼠的外尿道。尿道的颅状轴与导管平行。用左食指小心地紧紧紧紧紧紧紧紧的下腹部,有助于将导管引入外部尿道。(B) 导管朝鼠标尾部转动 180°。导管尖端在外尿道骨内保持 3 mm。(C) 导管现在进一步引入膀胱 7 mm。导管的方向与鼠脊对齐。(D) 小鼠腹部的文室视图。导管被放置在鼠标10毫米。(E) 尿液在正确插入膀胱时出现。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:时间表上实验程序的原理图。小鼠麻醉后,放置一个尿导管。植入中央静脉导管,获得基线尿(0分钟)。之后,通过中央静脉导管应用FITC-聚糖70博鲁,并开始连续注入FITC-聚糖70。FITC-Polyucrose 70的平衡相持续60分钟,尿在平衡阶段(0分钟)后和实验阶段开始之前收集。在此阶段,可以应用药物或其他物质(如血管紧张剂 II)。在实验阶段结束时,获得尿液进行分析(60分钟)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:带或不带FITC-聚糖70的PBS和小鼠尿液荧光。(A) PBS 的荧光频率扫描(激发 290 nm,发射 325-700 nm)显示 325 nm 的信号,这似乎是 290 nm 激发闪光的影响。(B) 在小鼠原生尿液的频率扫描(尿池稀释在1:10和1:20)时),有一个信号,最大为395nm,可能是由尿蛋白自荧光引起的。(C) 含有FITC-Polyucrose 70 (40 μg/mL) 的小鼠尿液在 525 nm 处显示信号峰值,不会影响尿液自荧光的测量。(D) 根据发射波长,FITC-聚糖70荧光峰的放大倍数。显示不同浓度的FITC-聚糖70(1.25、2.5、5、10、20和40 μg/mL)。(E) 增加FITC-聚糖70浓度表明荧光强度在525nm的发射时增加。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:血管紧张蛋白II(昂II)增加球状渗透性。(A) 昂 II 显著提高小鼠的球状渗透性,通过 FITC-聚糖 70 检测在小鼠尿液中测量(均值 = SEM;n = 5;p < 0.004,由克鲁斯卡尔-瓦利斯测试)。FITC-多糖在尿液中的70浓度与尿肌肽浓度参照。白色柱(0 分钟)表示在 Ang II 刺激开始之前的 FITC-聚糖 70 级,黑色列(60 分钟)表示在 Ang II 刺激开始后 60 分钟 60 分钟,灰色柱(120 分钟或 +60 分钟)在安 II 刺激启动后增加 60 分钟的 Ang II 刺激或 60 分钟的 Ang II 洗涤。(B) 收缩压由尾袖方法(均值 + SEM)监测。对照组和安II治疗组之间无明显的血压差异。(C) 多糖70和FITC-聚糖70对小鼠的球状渗透性没有显著改变。Ang II 显著提高小鼠的球状渗透性(均值 = SEM;n = 7,p < 0.005)。这个数字已由科尼格豪森等人8.请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:雌性小鼠泌尿导管放置的原理图。鼠标腹部的横向视图。(A) 标记和润滑的导管被引入3毫米的雌性小鼠的外尿道。尿道的颅状轴与导管平行。用左食指小心地紧紧紧紧紧紧紧紧的下腹部,有助于将导管引入外部尿道。(B) 导管朝鼠标尾部转动 180°。导管尖端在外尿道骨内保持 3 mm。(C) 导管现在进一步引入膀胱 7 mm。导管的方向与鼠脊对齐。(D) 小鼠腹部的文室视图。导管被引入雌性小鼠的外尿道3毫米。(E) 导管转动180°后,再向小鼠膀胱中引入7 mm。导管的方向与鼠脊对齐。这个数字已由Reis等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
提出的方法使研究者能够使用示踪剂以非常敏感的方式测试小鼠的球状渗透性。使用这种方法,只需少量尿液即可诊断肾小球渗透性的短期增加。成功掌握此技术最关键的步骤是:1) 发展小鼠手术的手动专业知识,特别是在中央静脉的罐中,2) 在不损害粘管的情况下放置导管,以及 3) 手动处理专业知识384 孔板,样品体积小。
放置中央静脉导管时,导管不得穿透静脉静脉。为了避免渗透,我们建议用远端结扎(参见步骤2.2.7)在颈静脉上加张力,并用细钳子抬起壶脉,以延伸壶脉的流明。为了保持插入部位小,尽量避免插入导管时的严重运动,并始终通过去除多余的组织确保手术场的最佳视图。在尿导管的位置最关键的步骤是最终插入膀胱。如果感觉到阻力,我们建议从一开始就重新开始,以免造成错误轨道和粘粘损伤。导管旋转、润滑、轻柔运动以及训练,在困难情况下帮助7。
FITC-Polyucrose 70是一种荧光标记、分枝和交联的蔗糖和中氯霉素9的聚合物。它在溶液中作为球形分子,具有低形状不对称,但分子变形9。与其他蔗糖分子一样,FITC-聚糖70被球状物过滤,在管状系统中不重新吸收。为了避免输注中的游松FITC分子,我们在小鼠施用之前对FITC-Polyucrose 70溶液进行透析。可以将硅酸FITC-聚糖70分子储存在-20°C下数月。由于FITC-多糖70是静脉注射在此和其他协议,这是至关重要的,没有血液污染尿样。因此,尿导管需要谨慎放置,在实验中应避免抗凝物质。FITC-Polyucrose 70 的标准曲线溶解在小鼠尿池中,以获得最准确的结果。由于不同实验点和组之间的尿液浓度差异,FITC-多糖70浓度需要参考尿液中反映尿浓度的标记物(例如肌氨酸)。在酶测定中,FITC-Polyucas70荧光与肌氨酸的测量不太可能发生干扰。
在黑色384孔板中应进行FITC-Polyucrose 70荧光的分析,因为这些板可以测量5μL的小尿量。我们不建议在384孔板内重复使用同一孔,即使在洗净板后,荧光仍然是可测量的。由于气泡干扰荧光读数,在分析之前,板应离心。或者,气泡可以使用移液器的尖端手动销毁。
近40年前,关于使用多糖来测试球状渗透率的描述。荧光标记的聚糖在过去几年中几乎只在大鼠身上进行了研究 4、11、12、13、14、15 ,16,17,18,19,20。这可能有解剖学的原因,因为在大鼠的外科手术比在小鼠更容易。在大鼠中,尿道切除术用于获取尿样4,5,9,12,13,14,21。为了分析血浆和尿液样本,探头受到高性能尺寸排除色谱4,5,9,12,13,14 ,21.此外,球状过滤速率 (GFR) 由放射性51Cr-乙二胺四乙酸 (EDTA)4、5、9、12、13测量 ,14,21.前两项研究在小鼠5、6中应用了FITC-聚糖70。在小鼠中,一个超阴尿导管被引入膀胱6,20。在分析FITC-Polyucrose 70荧光之前,对尿和等离子探针进行凝胶过滤。与大鼠相似,通过放射性6,20对GFR进行分析。第二份有关在小鼠中应用FITC-Polyucrose 70的出版物采用了围肠渗透性模型,因此没有分析小鼠尿液中FITC-Polyucrose 70荧光22。因此,对所提出的方法进行了修改,以方便尿样取样和分析。尿样可以通过非侵入性转导尿导管轻松获得。对 FITC-Polyucrose 70 荧光进行尿液分析,无需任何以前的高性能尺寸排除色谱或凝胶过滤。通过参考FITC-Polyucrose 70荧光到小鼠尿液肌氨酸,不需要使用放射性测定测量GFR。
血压升高可增强肾小球渗透性。因此,血压监测是研究肾小球渗透性所必需的。小鼠最准确的血压测量是通过中央导管23进行,需要导管的肝素化以防止凝血。在低剂量肝素化和尿导管放置后,我们遇到了血尿问题。因此,我们决定执行尾袖技术来测量血压,这是非侵入性的,不需要肝素化。根据麻醉的深度,用尾袖法监测血压有时具有挑战性。血压膜需要提前检查,在血压记录之前,应优化小鼠的位置。
除了在血压测量方面的挑战,该技术还受到限制生产FITC-Polyucrose 70的任意单位。到目前为止,这项技术只在动物身上被研究过,因此,它和人类肾小球过滤器的相关性仍然未知。研究肾小球渗透性增加的时间间隔取决于小鼠尿液的产生。因此,由于缺乏小鼠尿液生产,球状渗透性(以分钟)的短期增加可能会错过。在此协议中,FITC-Polyucrose 70 被归化为尿液肌氨酸,主要通过肾小球过滤从血液中去除,但也通过近端管分泌去除。这将在使用这种方法估计球状渗透性时引入误差,从而减少聚糖24的测量分数间隙。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢克里斯蒂娜·施万特、布兰卡·杜夫尼亚克和尼古拉·库尔的出色技术援助,并感谢丹尼斯·索恩博士在荧光扫描方面给予的帮助。这项研究得到了德国福森斯格明舍夫特(DFG)SFB 612 TP B18的资助,并授予了洛杉矶和洛杉矶。在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面,受资者没有作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
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