Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit einem hochempfindlichen, nicht radioaktiven Tracer vor. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina.
Abstract
Der Verlust von Albumin im Urin (Albuminurie) sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus. Unter physiologischen Bedingungen werden kleine Mengen von Albumin durch den Glomerulus gefiltert und im Röhrensystem bis zum Erreichen der Absorptionsgrenze resorbiert. Frühe Zunahmen der pathologischen Albuminfiltration können daher durch die Analyse von Albuminurie übersehen werden. Daher erscheint die Verwendung von Tracern zur Prüfung der glomerulären Permselektivität vorteilhaft. Fluoreszierend markierte Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-Polysucrose (d.h. FITC-Ficoll) kann verwendet werden, um die glomeruläre Permselektivität zu untersuchen. FITC-Polysucrose-Moleküle werden durch den Glomerulus frei gefiltert, aber nicht im Röhrensystem resorbiert. Bei Mäusen und Ratten wurde FITC-Polysucrose in Modellen der glomerulären Permeabilität mit technisch komplexen Verfahren (d. h. radioaktive Messungen, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [HPLC], Gelfiltration) untersucht. Wir haben ein AUF FITC-Polysucrose Tracer basierendes Protokoll modifiziert und erleichtert, um frühe und geringfügige Erhöhungen der glomerulären Permeabilität zu FITC-Polysukrose 70 (Größe von Albumin) bei Mäusen zu testen. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina (5 l). Dieses Protokoll enthält Informationen darüber, wie der Tracer FITC-Polysukrose 70 intravenös aufgetragen und Urin über einen einfachen Harnkatheter gesammelt wird. Urin wird über einen Fluoreszenzplattenleser analysiert und zu einem Urinkonzentrationsmarker (Kreatinin) normalisiert, wodurch technisch komplexe Verfahren vermieden werden.
Introduction
Funktionelle oder strukturelle Defekte innerhalb der glomerulären Filtrationsbarriere erhöhen die glomeruläre Durchlässigkeit gegenüber Albumin, was zur Detektion von Albumin im Urin (Albuminurie) führt. Albuminuria sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus und ist ein wichtiger Marker für glomeruläre Verletzungen1. Selbst niedrige Niveaus von Albuminurie, die im normalen Bereich liegen, sind mit einem erhöhten kardiovaskulären Risikoverbunden 1.
Unter physiologischen Bedingungen wird Albumin durch den Glomerulus gefiltert und fast vollständig im Röhrensystem2,3resorbiert. Bei Mäusen wird der Nachweis von Albumin im Urin in der Regel durch einen Albumin-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) aus 24 h Urinsammlung durchgeführt. Wenn Urin aus einer 24 h Urinsammlung oder Spot-Urin verwendet wird, können kleine Unterschiede in den Albumin-Konzentrationen aufgrund von Assay-Empfindlichkeitsproblemen übersehen werden. Die meisten Forscher verwenden daher Tiermodelle, in denen Albuminurie durch robuste Nierenverletzungen durch Toxine, Medikamente und Nierenoperationen induziert wird.
Daher ist die Suche nach einer sensiblen Methode zur Erkennung kleiner und vorübergehender Veränderungen der glomerulären Permeabilität für das Feld sehr wichtig. Rippe et al. haben ein Rattenmodell zur Prüfung der glomerulären Permeabilität vorgelegt, indem sie einen fluoreszierend beschrifteten Tracer, nämlich FITC-Polysukrose 70 (d.h. FITC-Ficoll 70), in der Größe von Albumin4auftragen. Die Tracer-Anwendung ermöglicht die Prüfung von kurzfristigen Veränderungen der glomerulären Permeabilität (innerhalb von Minuten) und ist sehr empfindlich4. Zwei Studien haben die Tracer-Methode bei Mäusen5,6verwendet. Trotz ihrer Vorteile hat diese Methode leider Nachteile: Sie ist technisch sehr komplex, radioaktiv und invasiv. Eine weitere Analyse des Urins erfolgt nur durch Gelfiltration oder Größenausschluss HPLC5,6.
In diesem Beitrag stellen wir eine alternative, empfindliche, nicht radiozentrische und schnelle Methode zur Messung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit fluoreszierend beschriftetem FITC-Polysukrose 70 vor. Durch die Einführung eines transurethralen Katheters ist die Urinsammlung weniger invasiv als Blasenpunktion, Urethrotomie und suprapubische Katheteranwendung und ermöglicht eine Urinsammlung mindestens alle 30 min. Die Urinanalyse wird aus kleinen Mengen (5 fluoreszierenden Plattenleser. Tracer-Konzentrationen im Urin werden mit einem enzymatischen Kreatinin-Assay zu Kreatininkonzentrationen im Urin normalisiert.
Daher bietet diese neuartige Methode ein empfindliches Werkzeug, um frühe glomeruläre Verletzungen mit erhöhter glomerulärer Permeabilität zu untersuchen.
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Protocol
Die Untersuchungen wurden gemäß den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, revidiert 1996) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen institutionellen Zulassungen durchgeführt (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] Referenznummer 84-02.04.2012.A397).
1. Vorbereitung von Instrumenten, Lösungen und Ausrüstung
- FitC-Polysucrose 70 mit 0,9% sterilem Natriumchlorid (NaCl) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml (d. h. 100 mg in 10 ml NaCl) rekonstituieren.
- Dialyse FITC-Polysucrose 70 Lösung zur Entfernung freier FITC-Moleküle über Nacht bei 4 °C (Molekulargewichtsabschaltung [MWCO] bei 10.000). Verwenden Sie 1 L 0,9% sterile NaCl pro 10 ml FITC-Polysukrose 70 unter ständigem Rühren. Vor Licht schützen. Aliquot die dialysierte FITC-Polysukrose 70 und lagern Sie sie bei -20 °C.
- Für die FITC-Polysukrose 70 bolus, fügen Sie 4 l von 10 mg/ml FITC-Polysukrose 70 Lösung zu 996 l von 0,9% NaCl (die Endkonzentration von FITC-Polysukrose 70: 40 g/ml).
- Für die Ausgleichsinfusionslösung 20 l einer 10 mg/ml FITC-Polysukrose-70-Lösung auf 9,98 ml von 0,9 % sterilem NaCl hinzufügen, was zu einer Endkonzentration von 20 g/ml führt.
- Für die experimentelle Lösung Medikamente oder Substanzen in die Infusionslösung geben (z.B. für Angiotensin II [Ang II] [100 ng/kg/min] für eine 25 g Maus, fügen Sie 3 l Ang II einer 1 mM Lösung hinzu).
- Für die Operation bereiten Sie einen Rasierer, zwei chirurgische Klemmen, eine chirurgische Schere, zwei Pinzette, zwei feine Pinzette, eine feine Schere und Tupfer. Bereiten Sie zwei 10 cm Seidenfäden (4-0 bis 6-0) für Ligationsverfahren vor.
- Für die Platzierung eines zentralen Venenkatheters eine 10 ml Spritze mit einer 21 G Nadel vorbereiten. Legen Sie die Nadelspitze in einen 30 cm langen Katheter (mit einem Innendurchmesser [ID] von 0,58 mm). Schließen Sie den 0,58 mm Katheter an einen 10 cm Katheter (mit einer ID von 0,28 mm) an. Schneiden Sie die Spitze des kleineren Katheter schräg, um eine scharfe Spitze zu schaffen, die in die juguläre Vene eingeführt wird.
- Bereiten Sie die Anästhesie (d. h. intraperitoneale Anästhesie Ketamin, 100 mg/kg Körpergewicht, und Xylazin, 5 mg/kg Körpergewicht).
- Bereiten Sie einen 22 G Angiokatheter vor, indem Sie die Nadel entsorgen und den Katheter 1 cm von der Spitze aus markieren. Heizen Sie das Heizkissen auf 37 °C vor.
- Bereiten Sie ein Blutdruckmessgerät vor und wechseln Sie bei Bedarf die Blutdruckmessmembran.
2. Vorbereitungsphase
- Harnkatheter
HINWEIS: Abschnitt 2.1 folgt dem Protokoll, wie es von Reis et al.7beschrieben wird. Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 1 zeigen die Platzierung eines Harnkatheters bei weiblichen Mäusen.- Anästhesisieren Sie die Maus mit Ketamin/Xylazin (siehe Schritt 1.8). Verwenden Sie den Zehen-Pinch-Test, um die richtige Anästhesie zu bestätigen. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, wiederholen Sie die Anästhesie (z.B. mit der halben Dosierung) nach 60 min. Eine richtige Anästhesie wird bestätigt, wenn der Zehenkneifentest nicht zu einem Reflexentzug führt.
HINWEIS: Weibliche FVB-Mäuse werden in diesem Protokoll verwendet. - Positionieren Sie die Maus in dorsaler Rekumbency auf einem 37 °C Heizkissen. Ziehen Sie den Unterbauch fest und finden Sie das Urethralostium (z.B. unter dem Mikroskop).
- Verwenden Sie den Kunststoffteil des Katheters eines 22 G Angiokatheters und schmieren Sie ihn mit Xylocain-Gel. Führen Sie es vorsichtig 3 mm in das Urethralostium ein, während Parallele zur distalen Harnröhrenachse (Abbildung1A).
- Drehen Sie die Spitze des Angiokatheters um 180°, indem Sie die Spitze innerhalb des Harnröhrenostiums halten und die Achse der Harnröhre beibehalten (Abbildung 1B).
- Führen Sie den Katheter 7 mm weiter in die Maus ein, so dass er in die Blase gelegt wird (Abbildung 1C). Zwingen Sie den Katheter nicht über den Widerstand hinaus. Korrigieren Sie die Position des Katheters von Anfang an, wenn Widerstand empfunden wird. Beachten Sie, dass, wenn die Position des Harnkatheters korrekt ist, Urin bereits innerhalb des Katheters erscheinen könnte.
- Legen Sie eine 1,5 ml braune Röhre über die Oberseite des Angiokatheters, um den Urin zu sammeln. Tragen Sie 1 ml 0,9% NaCl subkutan auf, um die Urinproduktion zu verbessern.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit Ketamin/Xylazin (siehe Schritt 1.8). Verwenden Sie den Zehen-Pinch-Test, um die richtige Anästhesie zu bestätigen. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, wiederholen Sie die Anästhesie (z.B. mit der halben Dosierung) nach 60 min. Eine richtige Anästhesie wird bestätigt, wenn der Zehenkneifentest nicht zu einem Reflexentzug führt.
- Zentraler Venenkatheter
- Rasieren Sie den Hals der Maus und legen Sie es in Recumbency mit dem Kopf in Richtung des Chirurgen. Hyperextend den Kopf der Maus mit einem Band.
- Desinfizieren Sie den Hals mit 70% Isopropanol. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt (5 mm) unterhalb der Kieferlinie, mit einer Pinzette und einer Schere. Schneiden Sie die Haut ca. 1 cm in Richtung des Brustbeins, bis die Mitte des Brustbeins erreicht ist.
- Sezieren Sie vorsichtig die Haut auf der rechten Seite des Halses, mit einer Schere. Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Haut auf der rechten Seite der Maus, um das Weichgewebe des Halses zu belichten. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette. Fixieren Sie die Hautklappen mit zwei Klemmen.
HINWEIS: Die Jugularvene verläuft entlang der linken Seite der Schilddrüse oder ist leicht vom rechten Lappen der Schilddrüse bedeckt. Verwenden Sie nach diesem Schritt ein Mikroskop für die Chirurgie. - Die Jugularvene vorsichtig durch stumpfe Zubereitung aussetzen, mit der Spitze der feinen Pinzette. Vermeiden Sie Verletzungen an Venenzweigen.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, Gewebe mit einer feinen Schere zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie eine Schere verwenden, um Gewebe zu entfernen, da es das Risiko von Blutungen erhöht. - Legen und schließen Sie eine Ligatur mit einem Seidenfaden (4-0 bis 6-0) am distalen Teil der sichtbaren Jugularvene (in Richtung des Kopfes der Maus). Setzen Sie Die Ligatur an, indem Sie den Seidenfaden mit einem Klebeband fixieren, um eine leichte Spannung an der Jugularvene zu gewährleisten. Bereiten Sie eine Ligatur um den proximalen Teil der Jugularvene vor.
- Füllen Sie den Katheter mit der Gleichgewichtsinfusionslösung (siehe Schritt 1.4) und fixieren Sie den Katheter mit einem Klebeband, so dass der Katheter die Jugularvene ausrichtet. Kontrolle für Blasen, um Luftembolie zu vermeiden.
- Heben Sie die Jugularvene mit feiner Pinzette an der Einsteckstelle an (die Einfügestelle ist 1–2 mm proximal der Ligatur). Richten Sie die Schläuche parallel zur Jugularvene aus. Punktieren Sie die juguläre Vene, zielen auf das Lumen, und setzen Sie für etwa 2–4 mm, parallel zur Achse der Jugularvene. Vermeiden Sie lebhafte Bewegungen.
- Schließen Sie die Ligatur, um den Katheter zu fixieren. Kontrolle für dichige Ligatur durch sorgfältiges Betrachten durch das Mikroskop. Legen Sie einen feuchten Tupfer über den Ort der Operation.
- Blutdruckmessung
- Legen Sie die Schwanzmanschette an der Unterseite des Mausschwanzes, während die Maus in dorsaler Restauneubekeit liegt. Starten Sie die Messungen und wiederholen Sie sie 10x pro Zeitpunkt. Erstellen Sie aus den Messungen einen Mittelwert.
- Passen Sie die Position der Schwanzmanschette an, wenn Blutdruckmessungen nicht korrekt erscheinen und falsche Daten erstellt werden.
3. Ausgleichsphase
- Ändern Sie das Harnsammelrohr, bevor die Gleichgewichtsphase beginnt, und legen Sie es auf Eis.
- Führen Sie eine 10 ml Spritze, gefüllt mit FITC-Gleichgewichtsphasenlösung (siehe Schritt 1.4), mit einer 21 G Nadel und dem größeren Katheter (mit einem ID-Id von 0,58 mm) ein und legen Sie sie in die Spritzenpumpe.
- Falten Sie einen Tupfer und legen Sie ihn um den Kleinen-Gefäß-Katheter (mit einer ID von 0,28 mm), der in die Jugularvene eingeführt wird. Legen Sie den Katheter in den Tupfer. Legen Sie eine Klemme über den Tupfer, um retrograde Durchblutung oder Luftembolie abzuschaffen. Schließen Sie eine 27 G Nadel mit einer 1 ml Spritze, die mit dem FITC Bolus gefüllt ist, an das Ende des Kleingefäßkatheters an.
- Öffnen Sie die Klemme und tragen Sie den FITC-Bolus (100 l) auf. Schließen Sie die Klemme erneut und verbinden Sie den größeren Katheter mit dem kleineren Katheter. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 0,008 ml/min (0,480 mL/h). Setzen Sie die Infusion für 60 min fort.
4. Versuchsphase
HINWEIS: In dieser Phase kann die Wirkung von Medikamenten auf die glomeruläre Permselektivität untersucht werden.
- Ändern Sie das Harnrohr (Zeitpunkt 0 min) in ein weiteres 1,5 ml braunes Rohr. Legen Sie einen Tupfer um den Kleingefäßkatheter und schließen Sie eine Klemme, wie in Schritt 3.3 angegeben.
- Trennen Sie den großen Katheter vom Kleingefäßkatheter. Ändern Sie die Spritzen in die experimentellen Phasenlösungen (siehe Schritt 1.5). Lassen Sie die Infusionspumpe laufen, so dass der große Katheter mit der Gleichgewichtslösung gefüllt wird.
- Schließen Sie die Katheter wieder an, während Sie Luftembolie vermeiden und die Klemme wieder öffnen. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 0,008 ml/min.
- Fahren Sie die Spritzenpumpe 60 min weiter und sammeln Sie danach den Urin im Harnröhrchen (Urin 60 min). Legen Sie den Urinschlauch auf Eis.
- Opfern Sie die Maus durch Zervixverrenz während der Anästhesie. Vor der Entsorgung wird die Maus 5 Minuten lang beobachtet, um sicherzustellen, dass sie tot ist.
5. Urinanalyse
-
Fluoreszenzmessung
- Den Harnpool auftauen und 1:10 mit phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnen.
HINWEIS: Der Harnpool ist ein Urinpool, der von gesunden Mäusen in einer 12-24 h Urinsammlung in einem Stoffwechselkäfig gesammelt wurde. - Vorbereiten von Standards für die Fluoreszenzmessung. Nehmen Sie 10 braune 1,5 ml-Röhrchen und beschriften Sie sie für roh (1:10 verdünnter Urinpool) und die folgenden FITC-Polysucrose-70-Konzentrationen (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 g/ml).
- Pipetten Sie 246 l verdünnten Urinbecken in ein 1,5 ml braunes Rohr und fügen Sie 4 l der FITC-Polysukrose 70-Lagerkonzentration (siehe Schritt 1.1) hinzu, um eine Endkonzentration von 160 g/ml FITC-Polysukrose 70 zu erhalten. Pipetten Sie 100 l des verdünnten Urinpools in alle anderen Röhren.
- 1:2 verdünnen, indem 100 l des 160-g/ml-FITC-Polysukrose-70-Rohrs in das 80-g/ml-Rohr einfließen und mit den anderen Konzentrationen fortfahren. Gewährleisten Sie eine richtige Mischung der verdünnten Konzentrationen (z. B. durch Wirbeln des Rohres, bevor Sie fortfahren).
- Verdünnen Sie die Urinproben der Maus (0 min, 60 min) 1:10 mit verdünntem Harnbecken.
- Pipette 5 l jeder Standard-FITC-Polysukrose-70-Konzentration und der Maus-Urinproben als Triplicate in einer schwarzen 384-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 15 s, um Blasen zu vermeiden.
- Analysieren Sie die 384-Well-Platte in einem Plattenleser. Führen Sie die Anregung bei 496 nm durch und messen Sie die Fluoreszenz bei 525 nm.
- Den Harnpool auftauen und 1:10 mit phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnen.
-
Kreatinin-Messung
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie kurz die Kreatinin-Standards vor, indem Sie 10 l der 100 mM-Standardlösung für Kreatinin mit 990 l Kreatinin-Assay-Puffer verdünnen, um eine Standardlösung von 1 mM vorzubereiten.
- Fügen Sie 0, 2, 4, 6, 8 und 10 l der 1 mM Kreatinin-Standardlösung in eine 96-Well-Platte ein, um 0, 2, 4, 6, 8 bzw. 10 nmol/well-Standards zu erzeugen. Fügen Sie jedem Brunnen einen Kreatinin-Assay-Puffer hinzu, um das Volumen auf 50 l zu erhöhen.
- Bereiten Sie die Reaktionsmischungen vor, indem Sie 42–44 L Kreatinin-Assay-Puffer, 2 l Kreatinase, 2 l Kreatininase, 2 l Kreatinin-Enzym-Mix und 2 l Kreatinin-Sonde hinzufügen. Für den Rohling verwenden Sie 44 l Kreatinin-Assay-Puffer, 2 l Kreatinase, 2 l Kreatinin-Enzym-Mix und 1–2 l Kreatinin-Sonde.
- Fügen Sie jedem Brunnen in der 96-Well-Platte 50 l des entsprechenden Reaktionsmixes hinzu und inkubieren Sie ihn 60 min auf einem horizontalen Shaker bei 37 °C. Schützen Sie die Platte während der Inkubation vor Licht. Messen Sie die Absorption bei 570 nm auf einem Plattenleser.
- Berechnen Sie die Kreatininkonzentrationen, indem Sie den Leerwert von allen Messwerten subtrahieren. Das Ergebnis ist die Einheit Nanomole/Mikroliter. Multiplizieren Sie die Konzentration von Kreatinin mit dem Molekulargewicht von Kreatinin (113,12 ng/nmol), um die Einheit Nanogramm/Mikroliter zu erhalten.
6. Datenanalyse
- Berechnen Sie die FITC-Polysukrose 70 Urinkonzentration aus der Standardkurve.
- Verweisen Sie auf die FITC-Polysukrose-70-Urinkonzentrationen auf Kreatininkonzentrationen in der repräsentativen Urinprobe.
- Verweisen Sie die Urin 60 min Proben auf Urin 0 min Proben von Kontrollen und behandelten Mäusen.
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Representative Results
Wie in Abbildung 2dargestellt, ist die Methode zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen in drei Phasen aufgebaut. Die erste Phase wird als Vorbereitungsphase bezeichnet, in der ein Harnkatheter und ein zentraler Venenkatheter platziert werden. Die zweite Phase wird als Ausgleichsphase bezeichnet, beginnend mit einer intravenösen Bolusinjektion von FITC-Polysukrose 70 und gefolgt von der kontinuierlichen Infusion von FITC-Polysukrose 70 für 60 min. Die letzte Phase wird als Versuchsphase bezeichnet. In dieser Phase wird die Infusion von FITC-Polysukrose 70 fortgesetzt und Medikamente oder andere Substanzen können auf Beeinflussung der glomerulären Permeabilität getestet werden. Urin wird am Ende jeder Phase gesammelt.
Um die glomeruläre Durchlässigkeit innerhalb dieses Tracermodells zu untersuchen, ist es wichtig, einen Harnkatheter richtig und ohne Verletzung der Schleimhaut zu platzieren. Die Platzierung eines Harnkatheters in eine weibliche Mausblase ist in Abbildung 1dargestellt. Der Katheter wird 3 mm in das Urethralostium gelegt, parallel zur kranipulaalen Harnröhrenachse (Abbildung 1A). Der Katheter wird um 180° zum Schwanz der Maus gedreht (Abbildung 1B) und 7 mm weiter in die Blase eingeführt, parallel zur murinen Wirbelsäule (Abbildung 1C, D).
Wie oben beschrieben, verwendeten frühere Methoden zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen HPLC zur Reinigung von FITC-Polysukrose 70-Signalen aus Urinproben5,6. Da diese Methode Fluoreszenzmessungen ohne vorherige Reinigung des Tracers verwendet, wurden PBS, Mausurin und FITC-Polysukrose 70 im Urin der Maus analysiert. Abbildung 3A zeigt den Fluoreszenzscan von PBS mit einem Fluoreszenzspitzenwert von 325 nm, was ein Effekt des Anregungsblitzes bei 290 nm zu sein scheint. Der Fluoreszenzscan von nativem Mausurin zeigt ein Fluoreszenzmaximum bei 395 nm (Abbildung 3B). FITC-Polysukrose 70 gelöst in Mausurin zeigt ein Fluoreszenzmaximum bei 525 nm (Abbildung 3C,D). Abbildung 3C zeigt, dass Mausurin die Fluoreszenzmessung von FITC-Polysukrose 70 im Urin der Maus nicht stört. Steigende Konzentrationen von FITC-Polysukrose 70 zeigen eine erhöhte Fluoreszenzintensität (Abbildung 3E).
Um zu beweisen, dass diese Methode in der Lage ist, Unterschiede in der glomerulären Durchlässigkeit zu erkennen, wurde Ang II in der experimentellen Phase des Modells angewendet. Ang II erhöhte die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen 60 min nach einer kontinuierlichen Verabreichung in nicht blutdruckrelevanten Dosierungen (Abbildung 4A,B). Die Erhöhung der glomerulären Permeabilität durch Ang II könnte durch einen Ang-II-Rezeptorblocker (ARB), nämlich Candesartan (Abbildung 4A), blockiert werden. Ang II Auswaschung verringert glomeruläre Durchlässigkeit (Abbildung 4A). Der Blutdruck wurde mit der Schwanz-Manschette-Methode gemessen und zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (Abbildung 4B). Polysucrose 70- und FITC-Polysucrose 70-infundierte Tiere dienen als Kontrollen für FITC-Polysukrose 70- und Ang II-behandelte Tiere (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Platzierung eines Harnkatheters bei weiblichen Mäusen. Seitliche Ansicht des Mausbauchs. (A) Der markierte und geschmierte Katheter wird 3 mm in das äußere Urethralostium einer weiblichen Maus eingeführt. Die Schädelachse der Harnröhre ist mit dem Katheter parallel. Eine sorgfältige Spannung am Unterbauch mit dem linken Zeigefinger erleichtert die Einschleppung des Katheters in das äußere Urethralostium. (B) Der Katheter wird um 180° zum Schwanz der Maus gedreht. Die Spitze des Katheters verbleibt 3 mm innerhalb des äußeren Urethralostiums. (C) Der Katheter wird nun 7 mm weiter in die Blase eingeführt. Die Richtung des Katheters ist an der murinen Wirbelsäule ausgerichtet. (D) Ventralansicht des Mausbauchs. Der Katheter wird 10 mm in die Maus gelegt. (E) Urin erscheint mit einem korrekten Einsetzen in die Blase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der experimentellen Verfahren auf einer Zeitachse. Nach der Narkose der Maus wird ein Harnkatheter platziert. Der zentrale Venenkatheter wird implantiert und Basisurin erhalten (0 min). Anschließend wird die FITC-Polysukrose 70 bolus über den zentralen Venenkatheter aufgetragen und eine kontinuierliche Infusion von FITC-Polysukrose 70 gestartet. Die Ausgleichsphase für FITC-Polysukrose 70 dauert 60 min. Urin wird nach der Ausgleichsphase (0 min) und vor Beginn der Versuchsphase gesammelt. Innerhalb dieser Phase können Medikamente oder andere Substanzen (wie Angiotensin II) angewendet werden. Am Ende der Versuchsphase wird Urin zur Analyse erhalten (60 min). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszenz von PBS und Mausurin mit und ohne FITC-Polysukrose 70. (A) Der Fluoreszenz-Frequenzscan (Erregung von 290 nm, Emission von 325-700 nm) von PBS zeigt ein Signal bei 325 nm, was eine Wirkung des Anregungsblitzes bei 290 nm zu sein scheint. (B) Bei der Frequenzscan von minativer Urin (Urinpool bei 1:10 und 1:20 verdünnt) gibt es ein Signal mit einem Maximum von 395 nm, wahrscheinlich verursacht durch Harnprotein-Autofluoreszenz. (C) Mausurin, der FITC-Polysukrose 70 (40 g/ml) enthält, zeigt eine Signalspitze bei 525 nm, die die Messung der Urinautofluoreszenz nicht beeinträchtigt. (D) Vergrößerung des FITC-Polysukrose-70-Fluoreszenzspitzen in Abhängigkeit von der Emissionswellenlänge. Es werden unterschiedliche Konzentrationen von FITC-Polysukrose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 g/ml) angezeigt. (E) Die Erhöhung der KONZENTRATIONen von FITC-Polysukrose 70 zeigt eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei einer Emission von 525 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Angiotensin II (Ang II) erhöht die glomeruläre Durchlässigkeit. (A) Ang II erhöht signifikant die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen, gemessen durch FITC-Polysucrose 70-Nachweis im Urin der Mäuse (Mittelwert + SEM; n = 5; p < 0.004, getestet durch Kruskal-Wallis-Test). FITC-Polysucrose 70 Konzentrationen im Urin wurden auf Urin-Kreatinin-Konzentrationen verwiesen. Die weißen Säulen (0 min) stellen FITC-Polysukrose 70 Stufen vor Beginn der Ang-II-Stimulation dar, die schwarzen Säulen (60 min) stellen FITC-Polysukrose 70 Stufen 60 min nach Beginn der Ang-II-Stimulation dar und die grauen Säulen (120 min oder +60 min) nach einem zusätzlich 60 min Ang II Stimulation oder 60 min Ang II Auswaschung. (B) Der systolische Blutdruck wurde mit der Schwanzmanschettenmethode (Mittelwert + SEM) überwacht. Es wurden keine signifikanten Blutdruckunterschiede zwischen der Kontrolle und den mit Ang II behandelten Gruppen festgestellt. (C) Polysucrose 70 und FITC-Polysucrose 70 verändern die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen nicht signifikant. Ang II erhöht die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen signifikant (Mittelwert + SEM; n = 7, p < 0,005). Diese Zahl wurde von Konigshausen et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung der Platzierung eines Harnkatheters bei weiblichen Mäusen. Seitliche Ansicht des Mausbauchs. (A) Der markierte und geschmierte Katheter wird 3 mm in das äußere Urethralostium einer weiblichen Maus eingeführt. Die Schädelachse der Harnröhre ist mit dem Katheter parallel. Eine sorgfältige Spannung am Unterbauch mit dem linken Zeigefinger erleichtert die Einschleppung des Katheters in das äußere Urethralostium. (B) Der Katheter wird um 180° zum Schwanz der Maus gedreht. Die Spitze des Katheters verbleibt 3 mm innerhalb des äußeren Urethralostiums. (C) Der Katheter wird nun 7 mm weiter in die Blase eingeführt. Die Richtung des Katheters ist an der murinen Wirbelsäule ausgerichtet. (D) Ventralansicht des Mausbauchs. Der Katheter wird 3 mm in das äußere Urethralostium einer weiblichen Maus eingeführt. (E) Nachdem der Katheter um 180° gedreht wurde, wird er 7 mm weiter in die Mausblase eingeführt. Die Richtung des Katheters ist an der murinen Wirbelsäule ausgerichtet. Diese Zahl wurde von Reis et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht es dem Prüfer, die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen auf sehr empfindliche Weise mit einem Tracer zu testen. Mit dieser Methode kann eine kurzfristige Erhöhung der glomerulären Permeabilität mit nur geringen Mengen Urin diagnostiziert werden. Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Beherrschung dieser Technik sind 1) die Entwicklung manueller Expertise in der Mauschirurgie, insbesondere in der Kanulation einer zentralen Vene, 2) Platzierung des Harnkatheters ohne Beeinträchtigung der Schleimhaut, und 3) manuelles Know-how im Umgang mit der Schleimhaut 384-Well-Platten mit kleinen Probenvolumen.
Bei der Platzierung des zentralen Venenkatheters ist es wichtig, dass der Katheter nicht in die Jugularvene eindringt. Um eine Penetration zu vermeiden, empfehlen wir, die Jugularvene mit einer distalen Ligatur zu verspannungen (siehe Schritt 2.2.7) und die Jugularvene mit feiner Pinzette zu heben, um das Lumen der Jugularvene zu verlängern. Um die Einsteckstelle klein zu halten, versuchen Sie, grobe Bewegungen beim Einsetzen des Katheters zu vermeiden und immer die beste Sicht auf das operationsische Feld zu gewährleisten, indem Sie zusätzliches Gewebe entfernen. Der kritischste Schritt bei der Platzierung des Harnkatheters ist die endgültige Einfügung in die Blase. Wenn Widerstand gefühlt wird, empfehlen wir von Anfang an von vorn, um keine falschen Spuren und Verletzungen der Schleimhaut zu verursachen. Katheterdrehung, Schmierung und sanfte Bewegungen, sowie Training, helfen in schwierigen Fällen7.
FITC-Polysucrose 70 ist ein fluoreszierend, verzweigtes und vernetztes Polymer aus Saccharose und Epichlorhydrin9. Es verhält sich in Lösung wie ein kugelförmiges Molekül mit einer kugelförmigen Form und mit einer niedrigen Formasymmetrie, aber mit einer molekularen Verformbarkeit9. Wie andere Saccharosemoleküle wird FITC-Polysukrose 70 vom Glomerulus gefiltert und nicht im Röhrensystem4resorbiert. Um freie FITC-Moleküle in der Infusion zu vermeiden, dialysierten wir die FITC-Polysukrose-70-Lösung vor der Anwendung an die Mäuse. Es ist möglich, dialysierte FITC-Polysucrose 70 Moleküle monatelang bei -20 °C zu lagern. Da FITC-Polysucrose 70 in diesem und anderen Protokollen intravenös aufgetragen wird, ist es wichtig, dass kein Blut die Urinproben kontaminiert. Daher muss der Harnkatheter mit Vorsicht platziert werden und gerinnungshemmende Substanzen innerhalb des Experiments sollten vermieden werden. Die Standardkurve für FITC-Polysucrose 70 wird im Urinpool der Maus aufgelöst, um die genauesten Ergebnisse zu erhalten. Aufgrund von Konzentrationsunterschieden im Urin an unterschiedlichen Versuchszeitpunkten und zwischen Gruppen müssen FITC-Polysucrose 70-Konzentrationen auf einen Marker im Urin verweisen, der die Urinkonzentration widerspiegelt (z. B. Kreatinin). Eine Interferenz der FITC-Polysukrose 70-Fluoreszenz mit der Messung von Kreatinin in einem enzymatischen Assay ist unwahrscheinlich.
Die Analyse der FITC-Polysukrose 70-Fluoreszenz sollte in schwarzen 384-Well-Platten durchgeführt werden, da in diesen Platten kleine Urinvolumina von 5 l gemessen werden können. Wir empfehlen nicht, die gleichen Brunnen innerhalb der 384-Well-Platten wiederzuverwenden, auch nach dem Waschen der Platten, da die Fluoreszenz noch messbar ist. Da Blasen die Fluoreszenzmessung stören, sollten die Platten vor der Analyse zentrifugiert werden. Alternativ können Blasen manuell mit der Spitze einer Pipette zerstört werden.
Die Verwendung von Polysukrosen zur Prüfung der glomerulären Permselektivität wurde vor fast 40 Jahren beschrieben10. Fluoreszierend markiertes Polysucrose wurde in den letzten Jahren fast ausschließlich bei Ratten untersucht4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Dies kann anatomische Gründe aufgrund einfacherer chirurgischer Eingriffe bei Ratten als bei Mäusen haben. Bei Ratten wird die Urethrotomie verwendet, um Urinproben zu erhalten4,5,9,12,13,14,21. Zur Analyse von Plasma- und Urinproben werden Sonden einer Hochleistungs-Ausschlusschromatographie4,5,9,12,13,14 ,21. Darüber hinaus wird die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) mit radioaktiven 51Cr-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Zwei frühere Studien haben FITC-Polysukrose 70 bei Mäusen5,6angewendet. Bei Mäusen wird ein suprapubischer Harnkatheter in dieBlase6,20eingeführt. Harn- und Plasmasonden werden vor der Analyse der FITC-Polysukrose 70 Fluoreszenz einer Gelfiltration unterzogen. Ähnlich wie bei Ratten wurde GFR mittels Radioaktivität6,20analysiert. Die zweite Veröffentlichung über die Anwendung von FITC-Polysucrose 70 bei Mäusen verwendet ein Modell der Peritonealdurchlässigkeit und analysierte daher nicht den Urin der Maus auf FITC-Polysukrose 70 Fluoreszenz22. Die vorgestellte Methode wurde daher modifiziert, um urinprobenund analysen zu erleichtern. Urinproben können leicht über einen nichtinvasiven transurethralen Harnkatheter gewonnen werden. Die Urinanalyse für FITC-Polysucrose 70 Fluoreszenz wird ohne vorherige Hochleistungs-Ausschlusschromatographie oder Gelfiltration durchgeführt. Durch Bezugnahme auf FITC-Polysukrose 70 Fluoreszenz auf Maus-Urinkreatinin ist die Messung von GFR mit einem radioaktiven Assay nicht erforderlich.
Erhöhungen des Blutdrucks erhöhen die glomeruläre Durchlässigkeit. Daher ist die Blutdrucküberwachung bei der Untersuchung der glomerulären Durchlässigkeit von wesentlicher Bedeutung. Die genauesten Blutdruckmessungen bei Mäusen werden über einen zentralen arteriellen Katheter23 durchgeführt, der eine Heparinisierung des Katheters benötigt, um eine Gerinnung zu verhindern. Wir haben Probleme mit Hämaturie nach niedrig dosierter Heparinisierung und Harnkatheterplatzierung erlebt. Daher haben wir uns entschieden, die Schwanz-Manschette-Technik durchzuführen, um den Blutdruck zu messen, der nicht invasiv ist und keine Heparinisierung erfordert. Je nach Tiefe der Anästhesie ist die Blutdrucküberwachung mit der Schwanz-Manschette-Methode manchmal eine Herausforderung. Blutdruckmembranen müssen im Voraus überprüft werden und die Position der Maus sollte vor der Blutdruckaufzeichnung optimiert werden.
Neben den Herausforderungen bei der Blutdruckmessung wird diese Technik auch durch die Herstellung beliebiger Einheiten von FITC-Polysukrose 70 eingeschränkt. Bisher wurde diese Technik nur bei Tieren untersucht, so dass ihre Relevanz für den menschlichen Glomerularfilter noch unbekannt ist. Zeitintervalle zur Untersuchung von Erhöhungen der glomerulären Durchlässigkeit hängen von der Urinproduktion der Maus ab. Daher kann sehr kurzfristige Erhöhung der glomerulären Permeabilität (in Minuten) aufgrund des Mangels an Urinproduktion der Maus verpasst werden. In diesem Protokoll wird FITC-Polysucrose 70 zu Urinkreatinin normalisiert, das hauptsächlich durch glomeruläre Filtration, aber auch durch proximale röhrenförmige Sekretion aus dem Blut entfernt wird. Dies führt zu einem Fehler bei der Schätzung der glomerulären Permeabilität mit dieser Methode, wodurch die gemessene Bruchfreiheit von Polysucrose24reduziert wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak und Nicola Kuhr für ihre außergewöhnliche technische Unterstützung und Dr. Dennis Sohn für seine Hilfe beim Fluoreszenzscan. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 an L.C.R. und L.S. unterstützt. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
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