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Medicine

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Abstract

A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.

Introduction

Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular1. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado1.

condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular2,3. Em camundongos, a detecção de albumina na urina é geralmente realizada por um ensaio imunoenzimático de albumina (ELISA) a partir de 24 h de coleta de urina. Se a urina de uma coleta de urina de 24 h ou urina local for usada, pequenas diferenças nas concentrações de albumina podem ser perdidas devido a problemas de sensibilidade do ensaio. A maioria dos pesquisadores, portanto, usam modelos animais em que a albuminúria é induzida por lesão renal robusta devido a toxinas, drogas e Cirurgia renal.

Portanto, o achado de um método sensível para detectar alterações pequenas e transitórias na permeabilidade glomerular é muito importante para o campo. Rippe et al. apresentaram um modelo de rato para testar a permeabilidade glomerular aplicando um traçador fluorescentamente rotulado, a saber FITC-polysacarose 70 (ou seja, FITC-Ficoll 70), no tamanho da albumina4. A aplicação do traçador permite o teste de mudanças a curto prazo na permeabilidade glomerular (dentro dos minutos) e é muito sensível4. Dois estudos utilizaram o método Tracer em camundongos5,6. Apesar de seus benefícios, este método, infelizmente, tem desvantagens: é tecnicamente muito complexo, radioativo e invasivo. Uma análise mais adicional da urina é conseguida somente usando a filtração do gel ou a HPLC5,6da tamanho-exclusão.

Neste trabalho, apresentamos um método alternativo, sensível, não radioativo e rápido para medir a permeabilidade glomerular em camundongos utilizando FITC-polysacarose 70 fluorescentamente rotulado. Introduzindo um cateter transuretral, a coleção da urina é menos invasora do que a punctura da bexiga, o Urethrotomy, e a aplicação suprapúbica do cateter, e permite a coleção da urina pelo menos cada 30 minutos. a análise de urina é realizada a partir de pequenas quantidades (5μl) leitor de placas fluorescentes. As concentrações de traçador na urina são normalizadas para concentrações de creatinina na urina usando um ensaio de creatinina enzimática.

Conseqüentemente, este método novo oferece uma ferramenta sensível para estudar ferimento glomerular adiantado com permeabilidade glomerular aumentada.

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Protocol

As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes delineadas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (institutos nacionais de saúde da publicação n º 85-23, revisado em 1996). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as aprovações institucionais relevantes (governo estadual Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referência 84-02.04.2012. A397).

1. preparação de instrumentos, soluções e equipamentos

  1. Reconstituir FITC-polysacarose 70 com 0,9% de cloreto de sódio estéril (NaCl) a uma concentração final de 10 mg/mL (i.e., 100 mg em 10 mL de NaCl).
  2. Dialyze FITC-polysacarose 70 solução para remover moléculas FITC livres durante a noite a 4 ° c (corte de peso molecular [MWCO] em 10.000). Use 1 L de 0,9% de NaCl estéril por 10 mL de FITC-polysacarose 70 agitação constante. Proteja da luz. Aliquot o FITC-polysacarose diafiltrado 70 e armazená-lo em-20 ° c.
  3. Para o FITC-polysacarose 70 bolus, adicionar 4 μL de 10 mg/mL FITC-polysacarose 70 solução para 996 μL de 0,9% NaCl (a concentração final de FITC-polysacarose 70:40 μg/mL).
  4. Para a solução de infusão de equilibração, adicione 20 μL de uma solução de FITC-polysacarose 70 de 10 mg/mL a 9,98 mL de NaCl estéril de 0,9% que rende a uma concentração final de 20 μg/mL.
  5. Para a solução experimental, adicione medicamentos ou substâncias à solução de perfusão (por exemplo, para a angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para um rato de 25 g, adicione 3 μL de Ang II de uma solução de 1 mM).
  6. Para a cirurgia, prepare uma máquina de barbear, duas braçadeiras cirúrgicas, um par de tesouras cirúrgicas, duas pinças, duas pinças finas, um par de tesouras finas e cotonetes. Prepare linhas de seda de 2 10 cm (4-0 a 6-0) para procedimentos de ligadura.
  7. Para a colocação de um cateter venoso central, prepare uma seringa de 10 mL com uma agulha de 21 G. Coloque a ponta da agulha em um cateter de 30 cm de comprimento (com um diâmetro interno [ID] de 0,58 mm). Ligue o cateter de 0,58 mm a um cateter de 10 cm (com um ID de 0,28 mm). Corte a ponta do cateter mais pequeno oblíquo para criar uma ponta afiada que seja introduzida na veia de jugular.
  8. Prepare a anestesia (i.e., anestesia intraperitoneal cetamina, 100 mg/kg de peso corporal, e xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).
  9. Prepare um angiocatômetro de 22 G descartando a agulha e marcando o cateter a 1 cm da ponta. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 ° c.
  10. Prepare um dispositivo de pressão arterial e mude a membrana de medição de pressão sanguínea, se necessário.

2. fase de preparação

  1. Cateter urinário
    Nota: a seção 2,1 segue o protocolo conforme descrito por reis et al.7. A Figura 1 e a Figura 1 suplementar mostram a colocação de um cateter urinário em camundongos fêmeas.
    1. Anestesie o rato com cetamina/xilazina (ver passo 1,8). Use o teste do dedo do pé-pitada para confirmar a anestesia apropriada. Para manter a anestesia, repita a anestesia (por exemplo, com metade da dosagem) após 60 min. a anestesia apropriada é confirmada se o teste da pitada do dedo do pé não resultar na retirada do reflexo.
      Nota: ratos FVB fêmeas são utilizados neste protocolo.
    2. Posicione o mouse na recumbência dorsal em uma almofada de aquecimento de 37 ° c. Aperte o abdômen inferior e encontrar o óstio uretral (por exemplo, um microscópio).
    3. Use a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifica-a com o gel do xilocaína. Introduza-o com cuidado 3 milímetros no óstio uretral ao paralelalizar o eixo uretral longe do ponto de origem (Figura 1a).
    4. Gire a parte superior do angiocatheter 180 ° mantendo a ponta dentro do óstio uretral e mantendo o eixo da uretra (Figura 1b).
    5. Introduzir o cateter 7 mm mais no rato para que seja colocado dentro da bexiga (Figura 1C). Não force o cateter para além da resistência. Corrija a posição do cateter desde o início se a resistência for sentida. Tome nota de que se a posição do cateter urinário estiver correcta, a urina já pode aparecer dentro do cateter.
    6. Coloc um tubo marrom de 1,5 mL sobre a parte superior do angiocatheter para recolher a urina. Aplique 1 ml de 0,9% de NaCl por via subcutânea para realçar a produção de urina.
  2. Cateter venoso central
    1. Raspar o pescoço do mouse e colocá-lo em decúbito com a cabeça em direção ao cirurgião. Hyperextend a cabeça do rato com uma fita.
    2. Desinfecte o pescoço com isopropanol a 70%. Faça uma incisão pequena da pele (5 milímetros) abaixo do jawline, usando um pinça e um par de tesouras. Corte a pele aproximadamente 1 cm na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido.
    3. Dissecar cuidadosamente a pele no lado direito do pescoço, usando um par de tesouras. Faça uma incisão retangular da pele para o lado direito do mouse para expor o tecido mole do pescoço. Use um par de tesouras e um tweezer. Fixar as abas da pele com duas braçadeiras.
      Nota: a veia jugular corre ao longo do lado esquerdo da glândula tireóide ou é ligeiramente coberta pelo lobo direito da glândula tireóide. Após esta etapa, use um microscópio para a cirurgia.
    4. Expor cuidadosamente a veia jugular por meio de uma preparação sem corte, usando a ponta da pinça fina. Evite lesões nos ramos das veias.
      Nota: pode ser necessário remover o tecido com tesouras finas. Tenha cuidado ao usar tesouras para remover o tecido, pois aumenta o risco de sangramento.
    5. Coloc e feche uma ligadura com uma linha de seda (4-0 a 6-0) na parte longe do ponto de origem da veia de jugular visível (para a cabeça do rato). Põr a tensão sobre a ligadura fixando a linha de seda com uma fita para assegurar a tensão ligeira na veia de jugular. Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular.
    6. Encha o cateter com a solução de infusão de equilíbrio (ver passo 1,4) e fixe o cateter com uma fita para que o cateter alinhe a veia jugular. Controle de bolhas para evitar o embolismo aéreo.
    7. Levante a veia jugular com pinças finas no local de inserção (o local de inserção é de 1 – 2 mm proximal da ligadura). Alinhe a tubagem paralela à veia jugular. Perfure a veia jugular, visando o lúmen, e insira por aproximadamente 2 – 4 mm, paralelhando o eixo da veia jugular. Evite quaisquer movimentos Brisk.
    8. Feche a ligadura para fixar o cateter. Controle para a estanqueidade da ligadura através da visualização cuidadosa através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia.
  3. Medição da pressão arterial
    1. Coloque a cauda-manguito na parte inferior da cauda do mouse, enquanto o mouse se coloca em recumbency dorsal. Iniciar as medições e repeti-los 10x por ponto de tempo. Construa uma média a partir das medições.
    2. Ajuste a posição da cauda-braçadeira se as medidas da pressão sanguínea não parecerem corretos e os dados falsos são produzidos.

3. fase de equilibração

  1. Alterar o tubo de coleta urinária antes da fase de equilíbrio começa e colocá-lo no gelo.
  2. Introduza uma seringa de 10 mL preenchida com uma solução de fase de equilibração FITC (ver passo 1,4) com uma agulha de 21 G e o cateter maior (com um ID de 0,58 mm) e coloque-o na bomba da seringa.
  3. Dobre um cotonete e coloque-o em torno do cateter da pequeno-embarcação (com uma identificação de 0,28 milímetros) que seja introduzido na veia de jugular. Coloque o cateter dentro do cotonete. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia aérea. Ligue uma agulha de 27 G com uma seringa de 1 mL preenchida com o bolus FITC até ao fim do cateter de pequeno vaso.
  4. Abra o grampo e aplique o bolus FITC (100 μL). Feche a braçadeira novamente e conecte o cateter maior com o cateter menor. Iniciar a bomba da seringa com 0, 8 mL/min (0,480 mL/h). Continuar a perfusão durante 60 min.

4. fase experimental

Nota: nesta fase, o efeito de fármacos na permseletividade glomerular pode ser investigado.

  1. Mude o tubo urinário (ponto de tempo 0 min) para outro tubo castanho 1,5 mL. Coloque um cotonete em torno do cateter de pequeno vaso e feche um grampo como indicado na etapa 3,3.
  2. Desconecte o cateter grande do cateter da pequeno-embarcação. Mude as seringas para as soluções de fase experimental (ver passo 1,5). Deixe a bomba da infusão funcionar de modo que o grande cateter esteja enchido com a solução do equilíbrio.
  3. Reconecte os cateteres evitando o embolismo de ar e reabra a braçadeira. Ligue a bomba da seringa a 0, 8 mL/min.
  4. Continue a correr a bomba da seringa para 60 min e recolher a urina dentro do tubo urinário depois disso (urina 60 min). Coloque o tubo de urina no gelo.
  5. Sacrifique o rato por luxação cervical durante a anestesia. Antes da eliminação, o rato é observado durante 5 minutos para garantir que está morto.

5. análise de urina

  1. Medição de fluorescência
    1. Descongelar a piscina urinária e dilui-lo 1:10 com tampão fosfato salina (PBS).
      Nota: a piscina urinária é um conjunto de urina que foi coletado de camundongos saudáveis em uma coleta de urina de 12 a 24 h em uma gaiola metabólica.
    2. Prepare padrões para a medição de fluorescência. Tomar 10 tubos castanhos 1,5 mL e rotulá-los para o espaço em branco (1:10 urina diluída) e as seguintes concentrações de FITC-polysacarose 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μg/mL).
    3. Pipet 246 μL de piscina de urina diluída num tubo castanho 1,5 mL e adicionar 4 μL da concentração de FITC-polysacarose 70 (ver passo 1,1) para obter uma concentração final de 160 μg/mL FITC-polysacarose 70. Pipet 100 μL da piscina de urina diluída em todos os outros tubos.
    4. Diluir 1:2 pipetando 100 μL do tubo de 160 μg/mL de FITC-polysacarose 70 para o tubo de 80 μg/mL e continuar com as outras concentrações. Assegure a mistura adequada das concentrações diluídas (por exemplo, por vortexing o tubo antes de continuar).
    5. Diluir as amostras de urina do rato (0 min, 60 min) 1:10 com piscina urinária diluída.
    6. Pipete 5 μL de cada concentração de FITC-polysacarose 70 padrão e das amostras de urina do rato como triplica numa placa preta 384-well. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 15 s para evitar bolhas.
    7. Analise a placa 384-well em um leitor da placa. Realize a excitação a 496 nm e meça a fluorescência a 525 nm.
  2. Medição da creatinina
    1. Siga as instruções do fabricante. Em resumo, prepare os padrões de creatinina diluindo 10 μL da solução padrão de creatinina de 100 mM com 990 μL de tampão de ensaio de creatinina para preparar uma solução padrão de 1 mM.
    2. Adicione 0, 2, 4, 6, 8 e 10 μL da solução padrão de 1 mM de creatinina em uma placa 96-well para gerar padrões de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol/poço, respectivamente. Adicione o tampão do ensaio da creatinina a cada poço para trazer o volume a 50 μL.
    3. Prepare as misturas de reacção adicionando 42 – 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de creatininase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 2 μL de sonda de creatinina. Para o espaço em branco, use 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 1 – 2 μL de sonda de creatinina.
    4. Adicionar 50 μL da mistura de reacção adequada a cada poço na placa de 96 poços e incubar-o durante 60 min num agitador horizontal a 37 ° c. Proteja a placa da luz durante a incubação. Meça a absorvência em 570 nanômetro em um leitor da placa.
    5. Calcule as concentrações de creatinina subtraindo o valor em branco de todas as leituras. O resultado terá a unidade nanomoles/microlitro. Multiplicar a concentração de creatinina pelo peso molecular da creatinina (113,12 ng/nmol) para receber a unidade nanogramas/microlitro.

6. análise de dados

  1. Calcule a concentração de urina FITC-polysacarose 70 da curva padrão.
  2. Consulte as concentrações de urina FITC-polysacarose 70 em concentrações de creatinina na amostra de urina representativa.
  3. Consulte as amostras de urina 60 min para amostras de urina 0 min de controles e camundongos tratados.

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Representative Results

Conforme representado na Figura 2, o método para testar a permeabilidade glomerular em camundongos é construído em três fases. A primeira fase é denominada fase de preparação, na qual se colocam um cateter urinário e um cateter venoso central. A segunda fase é chamada de fase de equilíbrio, iniciando com uma injeção intravenosa de bóculo de FITC-polysacarose 70 e seguida pela infusão contínua de FITC-polysacarose 70 por 60 min. A última fase é chamada de fase experimental. Nesta fase, a infusão de FITC-polysacarose 70 é continuada e drogas ou outras substâncias podem ser testadas para influenciar a permeabilidade glomerular. A urina é coletada no final de cada fase.

Para investigar a permeabilidade glomerular dentro deste modelo do Tracer, é essencial coloc um cateter urinário corretamente e sem ferir a mucosa. A colocação de um cateter urinário em uma bexiga fêmea do rato é demonstrada em Figura 1. O cateter é colocado 3 mm no óstio uretral, paralelo ao eixo uretral craniocaudal (Figura 1a). O cateter é girado 180 ° para a cauda do rato (Figura 1b) e introduzido 7 milímetros mais mais na bexiga, paralela à espinha murino (Figura 1C, D).

Como descrito acima, métodos prévios para testar a permeabilidade glomerular em camundongos usaram HPLC para purificar FITC-polysacarose 70 sinais de amostras de urina5,6. Como este método usa a medida da fluorescência sem uma purificação precedente do Tracer, PBS, urina do rato, e FITC-polysacarose 70 na urina do rato foram analisados. A Figura 3a mostra a varredura da fluorescência de PBS com um pico da fluorescência em 325 nanômetro, que parece ser um efeito do flash da excitação em 290 nanômetro. A varredura da fluorescência da urina nativa do rato mostra um máximo da fluorescência em 395 nanômetro (Figura 3B). FITC-polysacarose 70 dissolvido na urina do rato indica um máximo da fluorescência em 525 nanômetro (Figura 3C, D). A Figura 3C mostra que a urina do rato não perturba a medida da fluorescência de FITC-polysacarose 70 na urina do rato. As concentrações crescentes de FITC-polysacarose 70 mostram uma intensidade aumentada da fluorescência (Figura 3E).

Para comprovar que esse método é capaz de detectar diferenças na permeabilidade glomerular, o Ang II foi aplicado na fase experimental do modelo. O Ang II aumentou a permeabilidade glomerular em camundongos 60 min após uma administração contínua em dosagens não-sanguíneas relevantes (figura 4a, B). O aumento da permeabilidade glomerular devido ao Ang II pode ser bloqueado por um bloqueador do receptor de Ang II (ARB), a saber, Candesartan (figura 4a). O washout de Ang II diminuiu a permeabilidade glomerular (figura 4a). A pressão arterial foi mensurada por meio do método da cauda-manguito e não mostraram diferenças significativas entre os grupos (Figura 4B). Os animais com infusão de polysacarose 70 e FITC-polysacarose 70 servem como controles para FITC-polysacarose 70-e animais tratados com Ang II (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: colocação de um cateter urinário em camundongos fêmeas. Vista lateral do abdômen do rato. (A) o cateter marcado e lubrificado é introduzido 3 milímetros no óstio uretral externo de um rato fêmea. O eixo craniocaudal da uretra é paralelo com o cateter. A tensão cuidadosa no abdômen mais baixo com o dedo indicador esquerdo facilita a introdução do cateter no ostium uretral externo. (B) o cateter é girado 180 ° para a cauda do rato. A ponta do cateter permanece 3 milímetros dentro do ostium uretral externo. (C) o cateter é introduzido agora 7 milímetros mais mais na bexiga. A direção do cateter está alinhada com a espinha murina. (D) vista ventral do abdômen do rato. O cateter é colocado 10 mm no rato. (E) a urina aparece com uma inserção correta na bexiga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ilustração esquemática dos procedimentos experimentais em uma linha do tempo. Após a narcose do rato, um cateter urinário é colocado. O cateter venoso central é implantado e a urina basal é obtida (0 min). Posteriormente, o bolus FITC-polysacarose 70 é aplicado através do cateter venoso central e uma infusão contínua de FITC-polysacarose 70 é iniciada. A fase de equilibração para FITC-polysacarose 70 dura 60 min. a urina é coletada após a fase de equilíbrio (0 min) e antes da fase experimental começar. Nesta fase, podem ser aplicadas drogas ou outras substâncias (como a angiotensina II). No final da fase experimental, a urina é obtida para análise (60 min). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: fluorescência da PBS e da urina do rato com e sem FITC-polysacarose 70. (A) a varredura da freqüência da fluorescência (excitação de 290 nanômetro, emissão de 325-700 nanômetro) de PBS mostra um sinal em 325 nanômetro, que parece ser um efeito do flash da excitação em 290 nanômetro. (B) na varredura da freqüência da urina nativa do rato (Associação da urina diluída em 1:10 e em 1:20), há um sinal com um máximo em 395 nanômetro, causado provavelmente pela autofluorescência urinária da proteína. (C) a urina do rato contendo FITC-polysacarose 70 (40 μg/ml) mostra um pico de sinal a 525 nm que não interfere com a medição da autofluorescência da urina. (D) ampliação do pico de fluorescência FITC-polysacarose 70 dependendo do comprimento de onda de emissão. Diferentes concentrações de FITC-polysacarose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg/mL) são exibidas. (E) as concentrações crescentes de FITC-polysacarose 70 mostram um aumento da intensidade da fluorescência na emissão de 525 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: a angiotensina II (Ang II) aumenta a permeabilidade glomerular. (A) Ang II aumenta significativamente a permeabilidade glomerular em camundongos, medido pela detecção FITC-polysacarose 70 na urina dos camundongos (média + sem; n = 5; p < 0, 4, testado pelo teste de Kruskal-Wallis). As concentrações de FITC-polysacarose 70 na urina foram referenciadas às concentrações da creatinina da urina. As colunas brancas (0 min) representam FITC-polysacarose 70 níveis antes do início da estimulação de Ang II, as colunas pretas (60 min) representam FITC-polysacarose 70 níveis 60 min após o início da estimulação de Ang II, e as colunas cinzentas (120 min ou + 60 min) após um adicional 60 min de Ang II estimulação ou 60 min de Ang II washout. (B) a pressão arterial sistólica foi monitorada pelo método da cauda-manguito (média + MeV). Nenhuma diferença significativa da pressão sanguínea entre o controle e os grupos de Ang II-tratados foi anotada. (C) polisacarose 70 e FITC-polisacarose 70 não alteram significativamente a permeabilidade glomerular em camundongos. Ang II aumenta a permeabilidade glomerular em camundongos significativamente (média + SEM; n = 7, p < 0, 5). Este número foi modificado a partir de Konigshausen et al.8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 1
Figura suplementar 1: diagrama esquemático da colocação de um cateter urinário em camundongos fêmeas. Vista lateral do abdômen do rato. (A) o cateter marcado e lubrificado é introduzido 3 milímetros no óstio uretral externo de um rato fêmea. O eixo craniocaudal da uretra é paralelo com o cateter. A tensão cuidadosa no abdômen mais baixo com o dedo indicador esquerdo facilita a introdução do cateter no ostium uretral externo. (B) o cateter é girado 180 ° para a cauda do rato. A ponta do cateter permanece 3 milímetros dentro do ostium uretral externo. (C) o cateter é introduzido agora 7 milímetros mais mais na bexiga. A direção do cateter está alinhada com a espinha murina. (D) vista ventral do abdômen do rato. O cateter é introduzido 3 milímetros no óstio uretral externo de um rato fêmea. (E) depois que o cateter é girado 180 °, é introduzido 7 milímetros mais mais na bexiga do rato. A direção do cateter está alinhada com a espinha murina. Este número foi modificado de Reis et al.7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) perícia manual em segurar 384-bem placas com pequenos volumes de amostras.

Ao colocar o cateter venoso central, é essencial que o cateter não penetre na veia jugular. Para evitar a penetração, recomendamos colocar a tensão na veia jugular com uma ligadura distal (ver passo 2.2.7) e levantar a veia jugular com pinças finas para estender o lúmen da veia jugular. Para manter o local de inserção pequeno, tente evitar movimentos brutos ao inserir o cateter e sempre garantir a melhor visão do campo cirúrgico, removendo o tecido extra. O passo mais crítico na colocação do cateter urinário é a inserção final na bexiga. Se a resistência é sentida, nós recomendamos começar sobre do começo a fim não causar trilhas falsas e ferimento à mucosa. Rotação do cateter, lubrificação e movimentos suaves, bem como treinamento, auxiliam em casos difíceis7.

FITC-polysacarose 70 é um polímero cDNAs etiquetado, ramificado, e Cross-linked da sacarose e do epicloridrina9. Comporta-se na solução como uma molécula globular com uma forma esférica e com uma baixa assimetria da forma mas com um deformabilidade molecular9. Como outras moléculas de sacarose, o FITC-polysacarose 70 é filtrado pelo glomérulo e não reabsorvido no sistema tubular4. Para evitar moléculas FITC livres na infusão, nós diafiltrado a solução de FITC-polysacarose 70 antes da aplicação aos ratos. É possível armazenar as moléculas diafiltrado de FITC-polysacarose 70 em-20 ° c por meses. Como FITC-polysacarose 70 é aplicado intravenosamente neste e em outros protocolos, é essencial que nenhum sangue contesta as amostras de urina. Portanto, o cateter urinário precisa ser colocado com cautela e substâncias anticoagulantes dentro do experimento devem ser evitadas. A curva padrão para FITC-polysacarose 70 é dissolvida na associação da urina do rato para começ os resultados os mais exatos. Devido às diferenças de concentração na urina em diferentes pontos de tempo experimentais e entre os grupos, as concentrações de FITC-polisacarose 70 precisam ser referenciadas a um marcador na urina que reflete a concentração de urina (por exemplo, creatinina). A interferência da fluorescência de FITC-polysacarose 70 com a medida da creatinina em um ensaio enzimático é improvável.

A análise da fluorescência FITC-polysacarose 70 deve ser realizada em placas pretas de 384 poços, pois pequenos volumes de urina de 5 μL podem ser medidos nessas placas. Nós não recomendamos reusar os mesmos poços dentro das placas 384-well, mesmo depois de lavar as placas, porque a fluorescência é ainda mensurável. Como as bolhas interferem com a leitura de fluorescência, as placas devem ser centrifugadas antes da análise. Alternativamente, as bolhas podem ser destruídas manualmente com a ponta de uma pipeta.

O uso do polysucroses para testar o com glomerular foi descrito quase 40 anos há10. A polisacarose com rótulo fluorescentamente foi investigada em estudos de lesão glomerular quase exclusivamente em ratos nos últimos anos4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Isso pode ter motivos anatômicos devido a procedimentos cirúrgicos mais fáceis em ratos do que em camundongos. Em ratos, a urethrotomia é utilizada para a obtenção de amostras de urina4,5,9,12,13,14,21. Para analisar amostras de plasma e urina, as sondas são submetidas à cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho4,5,9,12,13,14 ,21. Além disso, a taxa de filtração glomerular (TFG) é medida pelo ácido tetraacético 51CR-etilenodiamina radioativo (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Dois estudos prévios aplicaram FITC-polysacarose 70 em camundongos5,6. Em camundongos, um cateter urinário suprapúbica é introduzido na bexiga6,20. As sondas urinárias e plasmáticas são submetidas à filtração por gel antes da análise da fluorescência FITC-polysacarose 70. Semelhante ao dos ratos, a TFG foi analisada via radioatividade,6,20. A segunda publicação sobre a aplicação de FITC-polysacarose 70 em camundongos utiliza um modelo de permeabilidade peritoneal e, portanto, não analisou a urina do camundongo para a fluorescência FITC-polysacarose 7022. O método apresentado foi, portanto, modificado para facilitar a amostragem e análise da urina. As amostras de urina podem ser facilmente obtidas através de um cateter urinário transuretral não invasivo. A análise de urina para FITC-polysacarose 70 fluorescência é realizada sem qualquer cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho anterior ou filtração de gel. Ao referenciar a fluorescência FITC-polysacarose 70 à creatinina urinária do rato, não é necessária a medição da TFG com um ensaio radioactivo.

Aumentos na pressão arterial aumentam a permeabilidade glomerular. Portanto, a monitorização da pressão arterial é essencial enquanto investiga a permeabilidade glomerular. As medidas de pressão arterial mais precisas em camundongos são realizadas através de um cateter arterial central23 necessitando de heparinização do cateter para evitar a coagulação. Nós experimentamos problemas com hematúria após o heparinização da baixo-dose e a colocação urinária do cateter. Conseqüentemente, nós decidimos executar a técnica da cauda-braçadeira para medir a pressão sanguínea, que é não invasora e não precisa o heparinization. Dependendo da profundidade da anestesia, a monitoração da pressão sanguínea com o método da cauda-braçadeira é às vezes desafiadora. As membranas da pressão sanguínea precisam de ser verific adiantado e a posição do rato deve ser aperfeiçoada antes da gravação da pressão sanguínea.

Além dos desafios na medição da pressão arterial, esta técnica também é limitada pela produção de unidades arbitrárias de FITC-polysacarose 70. Até o momento, essa técnica só foi investigada em animais e, portanto, sua relevância para o filtro glomerular humano ainda é desconhecida. Os intervalos de tempo para investigar aumentos na permeabilidade glomerular dependem da produção de urina do rato. Conseqüentemente, os aumentos muito a curto prazo na permeabilidade glomerular (nos minutos) podem ser faltado devido à falta da produção da urina do rato. Neste protocolo, FITC-polysacarose 70 é normalizado à creatinina urinária, que é removida do sangue principalmente via filtração glomerular, mas também por secreção tubular proximal. Isto introduzirá um erro ao estimar a permeabilidade glomerular usando este método, reduzindo o afastamento fracionário medido do polysacarose24.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, e Nicola Kuhr por sua assistência técnica excepcional e Dr. Dennis Sohn por sua ajuda com a varredura de fluorescência. Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 para L.C.R. e L.S. O financiador não teve papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

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References

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Medicina edição 150 permeabilidade glomerular polisacarose traçador albuminúria cateter urinário do rato cateter venoso central do rato diafragma de fenda glomérulo
Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70
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Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

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